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判定肿瘤抗原特异性T细胞反应的新方法
几十年来, 人们致力于肿瘤疫苗的研究, 旨在激活患者自身的免疫系统, 产生持久有效的抗肿瘤免疫.在肿瘤疫苗治疗前后, 如何准确地定量、定性判定肿瘤抗原特异性T细胞应答, 评价疗效, 是影响抗肿瘤疫苗发展的关键.51Cr释放法和有限稀释法(limiting dilution analyses, LDA), 一直被认为是评价特异性T细胞反应的金标准, 但实践证明这两种方法费时、费力且敏感性低.近5、 6年来, 一些评价T细胞功能和特异性的新方法逐渐建立起来[1,2], 由于这些方法更加敏感, 提供的信息更有意义.尤为重要的是, 有的方法能够对淋巴细胞直接进行检测, 勿需体外扩增, 因而更能准确地反映机体的免疫状况.
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用于研究人凝血因子Ⅷ重链抗原表位的双色荧光免疫印迹分析法
目的:寻找更简便精确的方法来检测人凝血因子Ⅷ的抗原表位.方法:采用PCR技术从人凝血因子Ⅷ的克隆载体pENTR223.1/FVⅢ上克隆出FⅧ重链(FⅧ-N)的cDNA.将cDNA插入原核载体pET21a构建重组表达载体pET21 a-FⅧ-N,并转化大肠杆菌BL21( DE3),以IPTG诱导表达His-FⅧ-N融合蛋白.以表达产物免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗FVⅢ-N的抗血清.接着在重组表达载体pET21 a-FⅧ-N中引入内参Flagotag.对FⅧ-N进行定点突变,构建两个突变克隆N1和N2,对二者以及原FⅧ-N进行双色荧光免疫印迹分析.用双色红外激光成像系统进行扫描和定量分析,以绿荧光与红荧光的光密度比值表示突变克隆抗原性的大小.结果:双色荧光免疫印迹分析表明,突变克隆N1,N2的抗原性与原FⅧ-N相比均有显著下降(P＜0.05).FⅧ A2区的三个氨基酸残基Arg484,Arg489,Arg593对FⅧ-N 抗原性起着重要的作用.结论:成功建立了人凝血因子Ⅷ重链抗原表位检测的双色荧光免疫印迹分析法.
关键词： 人凝血因子Ⅷ重链 双色荧光免疫印迹 抗原表位 双色红外激光成像系统 -
狂犬病毒核蛋白基因的克隆及核蛋白主要抗原表位分析
目的:克隆狂犬病毒ERA株核蛋白基因并对核蛋白主要抗原表位进行分析.方法:根据GenBank中已发表的RV N基因序列,设计合成了1对特异性引物,对RV ERA株N基因进行了RT-PCR扩增.将PCR产物纯化后与pMD18-T连接得到重组质粒pMD-N,并进行核苷酸序列测定.结果:该基因全长1 353 bp,编码450个氨基酸.RV ERA株与Gen-Bank中RV不同固定毒株和分离毒株N基因相比,核苷酸的同源性为98.0%～99.6%,推导的氨基酸序列的同源性为98.3%～99.60A,.核蛋白主要抗原表位分析表明,ERA株与其他固定毒株和分离毒株相比,仅在BC抗原表位(369～383位氨基酸)和Th抗原表位(394～408位氨基酸)处有1～3个氨基酸的不同,其他表位无差异.但与Iagos bat、Mokola和Duvenhage毒株相比,抗原位点氨基酸组成差异明显.结论:RV ERA株N基因可用于基因工程疫苗研制和核酸检测的靶基因;核蛋白可作为抗原用于狂犬病的检测.
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用单表位合成肽抗原荧光偏振免疫法检测抗幽门螺旋杆菌尿素酶的抗体
目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)的抗体检测方法.方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果.分析FITC标记的合成肽抗原在不同浓度时的FP值,用FP技术分析抗原表位的抗原性以及不同稀释比例的血清样品对FP检测的影响.分别应用FPIA法和ELISA法,对126例样品进行Hp感染检测,对FPIA的检测数据进行受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析.结果:UreB的单表位抗原肽具有较强的抗原性和免疫原性;1.0nmoL/L的FITC标记肽可用于FPIA检测,血清样品做1:25稀释时可明显区分阳性和阴性检测结果.与ELISA方法检测的结果相比较,用基于UreB单表位合成肽抗原的FPIA法检测Hp感染的灵敏度为85.7%,特异度为98%.结论:应用UreB单表位合成肽抗原,可对抗UreB的抗体进行快速FPIA检测,用此法检测抗体在疾病的临床诊断中具有广阔的应用前景.
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利用噬菌体展示技术筛选C型副鸡嗜血杆菌抗原模拟表位
目的确定抗C型副鸡嗜血杆菌(Hpg C)的单克隆抗体(mAb)的抗原表位.方法利用噬菌体展示技术, 从随机12肽库中进行生物淘洗, 用ELISA进行筛选和鉴定.结果通过3轮吸附-洗脱-扩增的生物淘洗过程, 获得了抗Hpg mAb结合肽.通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了高亲和性和特异性的结合肽, 即Hpg的抗原表位.序列分析显示, 结合肽恒定区的序列为WIHP.结论利用噬菌体展示肽库筛选抗原表位技术, 成功地获得了Hpg C mAb的模拟表位, 它可能是线性表位, 非常有希望应用于实验性疫苗的研制.
关键词： 副鸡嗜血杆菌(Hpg) 噬菌体展示 抗原表位 -
隐球菌抗原MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定
目的 鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位.方法 应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A*0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位.结果 位于MP98 氨基酸序列肽5(436-444aa)与HLA-A*0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA-A*0201阳性个体者PBMC增殖,并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL.结论 肽5 GMFDGLSGV(436-444aa)是MP98上HLA-A*0201限制性CD8+CTL的优势表位,可作为隐球菌疫苗设计的候选表位.
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人SFRP1基因及其编码蛋白基本特性及抗原表位的生物信息学分析
目的:通过生物信息学分析人分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因编码蛋白的主要特性与抗原表位,筛选该蛋白的T/B细胞联合表位.方法:利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、SignalP、SOSUI、Motif Scan、NCBI上的ORF finder、SYFPEITHI、NetCTL等生物信息学在线分析程序,结合Gene Runner、DNAMAN、DNAStar等生物信息学软件,分析、预测SFRP1蛋白的理化性质、信号肽、可溶性、表面可及性、可塑性、跨膜区、翻译后修饰位点、亲(疏)水性、二级结构、T/B细胞抗原表位等.结果:该蛋白由314个氨基酸组成,分子式为C 1588 H2516 N426 O436 S26,分子质量单位为35.3856kD,等电点理论值为9.10,波长280nm时的吸光度(A)值为1.029,半衰期为30h,有16个潜在B细胞表位、2个CTL表位和辅助性T细胞联合表位、3个T/B细胞联合表位,为可溶性表达蛋白.结论:SFRP1基因编码的SFRP1为可溶性表达蛋白,有3个T/B细胞联合表位,可作为人类多种肿瘤免疫学治疗的重要靶点.
关键词： 肿瘤 分泌型卷曲相关蛋白1 生物信息学 抗原表位 -
乳腺癌相关基因环氧化酶2(COX-2)编码蛋白的主要特性与抗原表位生物信息学分析
目的:通过生物信息学分析人乳腺癌相关基因环氧化酶2(Cycloxygenase 2,COX-2)编码蛋白的主要特性与抗原表位,筛选该蛋白的T/B细胞联合表位.方法:利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的Prot-Param、SignalP、SOSUI、TMHMM、MotifScan,NCBI上的ORF finder、Bcepred、SYFPEITHI、NetCTL等生物信息学在线分析程序,结合Gene Runner、DNAMAN等生物信息学软件,分析、预测COX-2蛋白的理化性质、信号肽、可溶性、表面可及性、可塑性,跨膜区,翻译后修饰位点、亲(疏)水性、二级结构、T/B细胞抗原表位等.结果:该蛋白由604个氨基酸组成,分子式为C3126H4787N823O883S28,分子质量单位为68.924 kDa,等电点理论值为7.27,波长280 nm时的吸光度(A)值为1.073,半衰期为30 h,有7个表面可及性参数≥1.9的区域、4个亲水性参数得分≥1.9的区域、3个柔韧性参数得分≥2的区域、26个翻译后修饰位点、23个潜在B细胞表位、3个CTL表位和辅助性T细胞联合表位、2个T/B细胞联合表位,为可溶性表达蛋白.结论:人乳腺癌相关抗原COX-2基因编码的COX-2蛋白为可溶性表达蛋白,2个T/B细胞联合表位,可作为乳腺癌免疫学治疗的重要靶点.
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应用PEPSCAN技术研究单克隆抗体L13F3识别的抗原表位
目的分析汉滩病毒核衣壳蛋白(NP)主要线性表位免疫学反应的小抗原多肽的组成. 方法在应用多株国产单克隆抗体和噬菌体文库技术基本确定了病毒NP氨基端的一个主要的B细胞线性抗原表位的基础上, 进一步用单克隆抗体L13F3对6肽或15肽随机多肽文库进行筛选,并根据病毒NP 氨基端aa15-67的氨基酸序列,在纤维素膜上每间隔1或2个氨基酸合成了15肽和8肽的阵列,用L13 F3对这两组多肽阵列进行免疫学检测. 结果对随机多肽文库进行筛检未获阳性结果,而对两组多肽阵列的检测确定了2个分别由5肽和3肽组成的小的抗原反应多肽. 结论多肽阵列 检测技术即肽扫描(peptide scan)技术是精确定位抗原表位的有效方法.
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单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的基因扩增、克隆及其B细胞抗原表位分析
目的:克隆单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G-2(gG-2)全长基因并对糖蛋白G-2进行B细胞抗原表位预测. 方法:用PCR法扩增HSV-2的gG-2基因,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α株后测序. 利用Lasergene,Clustal X等软件,进行B细胞抗原表位预测. 结果:完成单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆. 通过B细胞抗原表位分析,发现HSV-1的gG-1和HSV-2的gG-2氨基端的同源性很低. gG-2蛋白在"独特区"存在抗原指数非常强的抗原表位. 结论:成功构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆,为单纯疱疹病毒感染的诊断试剂的研发及抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供研究材料和参考.
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运用单克隆抗体分析流感病毒H1亚型HA蛋白的抗原表位
目的 对甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白的抗原表位进行分析.方法 以前期获得的97株抗H1亚型HA抗原的单克隆抗体为研究工具,用间接ELISA方法对不同亚型的血凝素抗原进行反应,将H1亚型HA蛋白的抗原表位进行粗分类,用ELISA阻断试验对抗原表位进行细分类.选取两类抗原表位的抗体,通过行计算机模拟分析抗体与抗原结合的结构域,推测抗体结合的具体氨基酸位点.结果 根据抗体的交叉反应性不同,将流感病毒Ⅱ1亚型的HA的抗原表位分为8类；根据ELISA阻断试验的初步结果,H1亚型HA抗原的抗原表位又被细分为15类,通过计算机模拟分析预测的抗体与流感病毒HA抗原结合的氨基酸位点结果与ELISA阻断试验结果相吻合.结论 证明流感病毒H1N1亚型HA抗原上至少含有15个抗原表位,且通过ELISA阻断试验和计算机模拟分析得到了相互印证,为流感病毒血凝素HA抗原表位预测方法的完善及通用疫苗的研制提供了实验数据.
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多发性骨髓瘤MMSA-1抗原的二级结构预测及多克隆抗体的制备
目的 运用生物信息学技术研究人多发性骨髓瘤MMSA-1(GenBank:AY952881)基因表达蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,并制备多克隆抗体.方法 应用DNAStar Protean软件提供的模块分析和预测MMSA-1蛋白的二级结构和B细胞抗原表位.采用多通道同步固相全自动合成系统合成15肽,免疫健康新西兰成年家兔,制备相应的多克隆抗体.结果 MMSA-1蛋白含有较多的β折叠和转角结构.综合柔韧性、亲水性、抗原性、表面可能性、二级结构、偶联难易及实验难度等因素,选取了MMSA-1蛋白序列318～333位作为抗原表位,即SSSLLPQSPAPTEHL,15肽合成产物经HPLC纯化和质谱检测,纯度达到98.65%,序列正确.免疫兔子获得血清抗体采用层析柱纯化,ELISA检测效价:1∶6000.结论 本研究为基于人MMSA-1抗原表位手段的免疫治疗研究提供了理论依据.
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抗原表位鉴定方法的研究进展
抗原决定簇又称为抗原表位,是抗原分子中决定抗原特异性的化学基团,也是蛋白质抗原性的基础.抗原抗体的特异性结合反应是针对特定的抗原表位而并非是完整的抗原,因此明确蛋白质的抗原表位对多肽和新型疫苗分子的设计及诊断试剂的发展具有重要意义.随着科技的发展,出现了一些新的鉴定单克隆抗体抗原表位的方法.本文在传统表位鉴定方法基础上简要综述了多技术结合鉴定抗原表位新方法.
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牙周炎疫苗候选抗原筛选的研究现状
牙周炎是一种细菌感染性疾病, 牙龈卟啉单胞菌是公认的牙周致病菌,研究证明[1～3]用牙龈卟啉单胞菌的有效免疫原作为疫苗来防治牙周炎是可行的,但是发展防治牙周炎疫苗尚有许多问题,其首要步骤就是选择合适的抗原.当前国内外学者研究牙周炎疫苗重点和难点主要围绕抗原的筛选方面,牙周炎疫苗研究过程经历了从经典疫苗研究到新型疫苗研究的逐步完善的过程,因而疫苗候选抗原的筛选也经历了从病原体全菌细胞到有效抗原表位的研究过程.
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登革病毒基因组研究进展
登革病毒基因组研究的进展有利于相关疫苗研制及针对性药物设计.本文就登革病毒基因组特征、功能、抗原表位及登革病毒感染后宿主体内产生的化学增活素作用等方面的研究进展加以综述.
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蛋白质抗原表位研究进展
本文综述了蛋白质抗原表位的种类及特性,回顾了近几年来实验确定和理论预测B细胞蛋白质抗原表位的常用方法,介绍了表位作图和表位疫苗的研究现状.
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噬菌体肽库技术及其在HCV抗原表位研究中的应用
噬菌体随机肽库技术是研究抗原表位及其配体受体相互作用位点的强有力的工具.本文对噬菌体肽库技术的原理及其在抗原表位研究尤其在HCV抗原表位研究中的应用作一综述.
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H因子结合蛋白的非功能变异体作为脑膜炎球菌的候选疫苗
脑膜炎奈瑟菌是人类专属病原体，是脑膜炎和败血症的主要病因。 H因子结合蛋白（ fHbp ）是一种毒力因子，它通过高亲和性地结合人的补体调节因子H（ fH）保护脑膜炎奈瑟菌不受天然免疫力的伤害，同时也是正在研发中的预防脑膜炎球菌病疫苗中的关键抗原。 fHbp可分为3个不同的群（ V1、V2和V3），都能诱导有限的免疫交叉反应性。 fH与fHbp的相互作用能损害这种抗原的免疫原性，因为这阻碍了向fHbp中的抗原表位的接近，这为研究非功能性fHbp作为疫苗候选物提供了依据。这里作者鉴定了两个非功能性V3 fHbps fHbp T286A和fH-bpE313A ，各自含有一个单氨基酸替代从而导致与fH亲和性的显著减弱而又不影响该蛋白的折叠。非功能性fHbps的免疫原性用表达单一嵌合性fH （其上含有人fH中涉及与fHbp相结合的区域）的转基因小鼠进行评估。野生型V3 fHbp、V3 fHbpT286A 和V3 fHbpE313A 所诱导的抗V3 fHbp 的抗体滴度没有差异，说明非功能性fHbp保留了它们的免疫原性。此外，非功能性V3 fHbp诱导的血清杀菌活性等同于或高于野生型蛋白。作者的发现为合理设计下一代含非功能性V3 fHbp 的疫苗提供了根据。
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H3 N 2流感病毒血凝素球状头部的保守中和表位
一些针对流感病毒血凝素的中和抗体主要通过抑制血凝素和宿主细胞表面受体的结合而发挥作用，还有一些中和抗体可以阻止低pH介导的血凝素的构象改变，这种构象改变对膜融合是必须的。总的来说，前一种抗体主要结合在球状HA1的顶端，其针对的毒株特异性不强，而后一种抗体主要结合在HA2的中间，有较强的毒株特异性。在本研究中，我们分析了一种具有广泛中和作用的抗H3 N2流感病毒的人源抗体F005－126的表位及功能。对F005－126的Fab和血凝素所形成复合物的晶体结构研究表明，在血凝素的三聚体中，抗体跨越了其中两个血凝素单体所形成的交叉口，链接其球状顶端，并且将三个血凝素单体都链接起来。通过抗体重链骨架区3和三个互补决定区来识别两个多肽片段（部位L和R）和残基285位天冬氨酸链接的多糖。抗体结合到位点L （残基171～173、239、240）和R （残基91、92、270～273、284、285）主要是由多肽主链这些位点处的范德瓦尔斯力介导的，其次还可以通过HA1保守序列的一些侧链氢键来介导结合。此外，由F005－126识别的多糖在H3 N2病毒中均保守。 F005－126还可以阻止低pH 环境下介导的血凝素构象改变。一些新鉴定的保守型抗原表位，包括多糖，应该可以在人体中产生免疫原性，而且可以诱导产生抗H3病毒的广谱中和抗体。
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乙肝病毒样颗粒在初始树突细胞进入I类和II类MHC抗原提呈通路
病毒样颗粒( VLP s )代表了有效地引发机体免疫的病毒蛋白的高密度展示方式,由乙肝病毒外膜蛋白组成的病毒样颗粒可以诱导机体的细胞免疫和体液免疫应答。然而,研究表明乙肝病毒外膜蛋白VLP s可以破坏树突细胞的功能。作者研究了乙肝病毒外膜蛋白VLP s和树突细胞亚类的相互作用及抗原在树突细胞中通过主要组织相容性I类和II类抗原呈递途径的提呈状况。在体外试验针对 CpG的应答中,乙肝病毒外膜蛋白VLP s降低了浆细胞样树突细胞的α-干扰素的产生,但是在体内给予CpG情况下,不会损坏普通树突细胞或浆细胞样树突细胞的表型。为了评估细胞免疫应答,制造了含有卵白蛋白( OVA )模式表位的乙肝病毒外膜VLPs,OVA 抗原表位(257~264)和 OVA (323~339)分别是通过MHC I类和II类抗原呈递途径提呈的。乙肝病毒外膜蛋白VLP-OVA (157~264)在体内能被CD8+树突细胞交叉提呈,但不会被CD8-树突细胞提呈。因此,乙肝病毒外膜蛋白VLP s可在原发树突细胞和启动的细胞毒细胞以及协助性T细胞中通过MHC I和MHC II类抗原呈递途径进行提呈。
