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狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位研究
为阐明狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位,本研究通过合成肽模拟B细胞线性抗原表位,采用免疫学方法对生物信息学分析获得的狂犬病病毒CVS-11核蛋白潜在B细胞线性抗原表位进行验证.结果显示,狂犬病病毒CVS-11核蛋白355～369、385～400位氨基酸序列合成肽免疫小鼠血清经间接酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗多肽抗体效价达到1∶12 800以上;抗多肽抗体在免疫印迹试验(Western blot,WB)中识别变性狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原,在间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody,IFA)中识别感染BHK-21细胞的狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原.因此,狂犬病病毒CVS-1l核蛋白355～369、385～400位氨基酸序列经证实为B细胞线性抗原表位.
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应用噬菌体随机9肽库筛选庚型肝炎病毒抗原表位
自1985年美国Missouri大学Smith博士首先建立噬菌体表面展示技术(phage display techniques,PDT)以来,这一技术在研究分子间相互识别,如抗原-抗体、配体-受体、酶-底物等诸多领域已充分显示其独特的优势[1].该技术是以经过改建的噬菌粒为载体,将外源基因插入噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ基因中,从而使表达的外源肽或蛋白质展示在噬菌体表面,并保持一定的空间构象.噬菌体表面随机表达多肽文库技术的建立,使表面展示由单一表达转入随机表达,应用特定的靶分子(如抗体、受体或其它分子等)可从中筛选出相应的配体,通过测定插入基因的序列即可明确其表达产物的氨基酸序列[2,3].因此,噬菌体随机肽库已成为研究分子间相互作用的有力工具.本文用抗庚型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)包膜蛋白2(envelope protein 2,E2)单克隆抗体M-13-IgG为靶分子,从构象限制性噬菌体随机9肽库(PVⅢ9aa-cys)中筛选HGV特异性的抗原表位.
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一株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体抗原表位的鉴定
PEDV N蛋白为高度保守性蛋白,具有极强的免疫原性,因此在临床诊断中具有重要作用.本文对实验室前期制备的针对N蛋白的单克隆抗体9 G11的抗原表位进行精确定位.通过与N蛋白进行免疫印迹反应证明9G11所识别的表位是N蛋白的线性表位.利用NEB十二随机肽库进一步定位9G11核心表位氨基酸,结果显示位于N蛋白75～78位的氨基酸FYYL为9G11所识别的关键氨基酸.对20株PEDV不同亚群代表毒株的对应区域进行同源性分析表明此表位高度保守.确定该抗体识别的抗原表位有助于了解N蛋白的结构与功能,同时也为以表位为基础的快速、准确并具临床应用价值的PEDV诊断方法的建立打下良好基础.
关键词： 猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白 单克隆抗体 抗原表位 -
噬菌体肽库的免疫学应用研究
噬菌体展示肽库技术是一种用于筛选蛋白、多肽的强有力的生物技术,将外源蛋白与噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性.本文总结了这一技术及其相关展示系统在蛋白质相互作用的研究、抗体及疫苗的制备、多肽药物的研制等方面的应用潜力和独特的优点.
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应用噬菌体随机十二肽库筛选旋毛虫Ts87蛋白抗原表位
以抗旋毛虫Ts87蛋白单克隆抗体2A2作为靶标,对噬菌体展示随机十二肽库进行筛选.通过ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并对阳性克隆提取DNA进行测序分析.结果显示,经3轮生物淘洗后,目标噬菌体得到433倍富集.随机挑选20个克隆进行ELISA鉴定,其中有18个噬菌体克隆可以与单抗2A2特异性结合.测序分析发现,这18个克隆带有4种氨基酸序列,分别为:TPHPHIFYREAS、DWKAWTQMLDSY、WQIEYFrLHSLW和VSPHEYWSEL.经比对未发现这4种序列与Ts87蛋白序列有明显同源性.将这4株噬菌体克隆扩增后,经Western-blot鉴定均可被单抗2A2识别.结果表明本次筛选鉴定得到的4个噬菌体展示肽可能是旋毛虫 Ts87蛋白的模拟抗原表位.
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细粒棘球绦虫转酮醇酶生物信息学分析
目的 利用生物信息学技术对EgTK基因编码蛋白的结构和功能进行预测和分析. 方法 利用ExPASy系统的ProtParam、ProtScale、SignalP、SOMPA程序与SubLoc v1.0、DNAStar、IEDB、SYPEITHI、Phyre2等生物信息学软件分析EgTK的理化性质、抗原表位、跨膜区、二、三级结构等. 结果 EgTK基因由7个外显子,6个内含子构成,CDS长度为1 878 bp,编码625个氨基酸,分子式为C3015H4791N829O900S22,分子质量为67.76 ku;为跨膜蛋白,位于细胞质,二级结构主要以α螺旋、无规则卷曲为主.EgTK有16个潜在的B细胞线性表位,11个CTL细胞表位,13个Th细胞表位;EgTK三级结构与人类转酮醇酶相似性为97％;经多重比对,除去两端多余序列,共有473个氨基酸残基参与比对,发现195个变异位点、123简约性信息位点、72单态突变位点. 结论 生物信息学技术分析EgTK蛋白存在多个B、T细胞表位,具有良好的免疫原性,可为该蛋白的基因克隆、表达等提供理论依据.
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人乳头瘤病毒16型E7蛋白的生物信息学分析
目的 应用生物信息学预测分析人乳头瘤16型病毒(human papillomavirus type 16,HPV16) E7蛋白的结构特征与抗原表位. 方法 自NCBI GENE BANK获取HPV16E7蛋白的基因信息,应用ProtParam分析其编码的E7蛋白理化性质和一级结构;利用SO)PMA分析E7蛋白的二级结构;应用 SWISS MODEL的Automated mode预测E7蛋白的三维空间结构;使用NetNGlyc 1.0 Server、NetPhos3.1Server、MotifyScan、SignalP及TMHMM预测蛋白质的翻译后修饰位点、信号肽切割位点和跨膜区;利用CLUSTALX将HPV16 E7蛋白同其他高危型HPV E7蛋白进行同源性对比;应用ABCpred、BepiPred、IEDB、SYFPEITHI和NetMHCIIpan 3.1 Server预测E7蛋白的优势抗原表位. 结果 生物信息学预测E7蛋白无规卷曲占52.04％,结构较松散,为不稳定性蛋白.该蛋白存在多个磷酸化位点.利用序列匹配度为46％的HPV45E7蛋白为模板得到同型二聚体三级预测结构.E7蛋白高度保守,且具有潜在的B细胞抗原表位1-8、15-22、33-46,CD8+T细胞抗原表位82-90、11-19、7-11、85-93、13-21和CD4+T细胞抗原表位9-23、73-87、10-24、7-21、21-35. 结论 HPV16 E7蛋白为不稳定蛋白.该蛋白高度保守,且具有潜在的B、T细胞抗原表位.
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多房棘球绦虫95抗原T-B联合表位分析
目的 应用相关软件和在线网络分析Em95的蛋白二级结构,预测B细胞表位和T细胞表位的联合表位.方法 采用DNAStar软件和在线网络IEDB、SYFPEITHI及Propred等对Em95的B细胞表位和T细胞表位进行预测,寻找B细胞和T细胞表位共同的区域. 结果 Em95存在潜在的抗原表位,其中B细胞表位区域为10-19、43-48、52-59、78-82、92 100和110-115;分值高的T细胞表位区域为32-40、51-60、82-98、108-116和126-138.B细胞和T细胞共同的表位区域为52-59、92-98和110-115. 结论 运用生物信息学方法确定Em95的3个T-B细胞联合表位存在于5个T细胞抗原表位和6个B细胞抗原表位中存在区域,对进一步研究Em95的抗原性和研发优势表位疫苗具有重要意义.
关键词： 多房棘球绦虫95抗原 抗原表位 生物信息学 -
细粒棘球绦虫AgB5抗原表位的生物信息学预测
目的 应用计算机在线预测软件分析细粒棘球绦虫AgB5抗原蛋白的二级结构,预测其可能形成的B细胞表位和T细胞表位,为研制安全、高效的新型包虫病基因疫苗奠定基础,也为包虫病的免疫学治疗提供新的理论依据.方法 采用计算机在线预测软件SOPMA对细粒棘球绦虫AgB5抗原蛋白的二级结构进行预测和分析;采用LEPS和ABC Pred网络软件结合其表面特性、亲水性、柔韧性、可及性、可塑性等对其B细胞表位进行预测和分析;采用IEBD和SYFPEITHI在线软件对细粒棘球绦虫AgB5抗原蛋白的MHC-Ⅰ类HLA-A 0201限制性T细胞表位进行预测和分析.结果 采用计算机在线预测软件预测细粒棘球绦虫AgB5抗原蛋白的二级结构中α螺旋结构占76.47％,β-折叠占5.88％,无规则卷曲占17.65％.结合其表面特性、亲水性、柔韧性、可及性以及可塑性等分析得出分值较高的3个B细胞表位区域,分别为:6～14、28～33和48～52氨基酸序列,较易形成B细胞表位;通过MHC-Ⅰ类HLA-A 0201限制性T细胞表位分析得出分值较高的4个T细胞表位区域,分别为:9～13、24～29、38～45和51～59氨基酸序列,较易形成T细胞表位. 结论 通过生物信息网络技术方法分析确定细粒棘球绦虫AgB5抗原蛋白分别存在3个B细胞抗原表位和4个T细胞抗原表位,可为细粒棘球绦虫AgB抗原性研究和高效表位疫苗研发提供参考,为临床包虫病的免疫诊断、药物治疗提供新的靶标.
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刚地弓形虫热休克70基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析
目的 分析并预测刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原的可能性.方法 从Genbank数据库获取TgHSP70基因序列,采用在线蛋白分析专家系统(http://ca.expasy.org/),结合DNAMAN等生物信息学软件对该序列的编码区进行分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二级结构、亲/疏水性、三维空间结构、抗原表位等.结果 该基因全长2 382 bp,编码区为143～2 146 bp.编码蛋白性质稳定,理论分子质量单位为72.304 97 ku.TgHSP70有6个跨膜区,为跨膜蛋白；有4个N端糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,14个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点,3个酪氨酸激酶磷酸化位点；无信号肽,二级结构以无规卷曲为主；TgHSP70主要存在于弓形虫速殖子胞液和核内,有26个潜在的抗原表位.结论 TgH-SP70基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原.
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细粒棘球绦虫myophilin的抗原表位预测
目的 应用生物信息学软件预测细粒棘球绦虫亲肌肉蛋白myophilin的二级结构及B、T细胞抗原表位,为其保护性抗原表位筛选提供依据. 方法 从Genbank中获取myophilin的氨基酸序列,采用SOPMA软件预测其二级结构;采用LEPS和ABCpred软件联合预测其B细胞抗原表位;采用IEDB和SYFPEITHI软件联合预测其T细胞抗原表位. 结果 α螺旋、β折叠、无规则卷曲和β转角在myophilin二级结构中所占的比例分别为47.89％、10.00％、30.53％和11.58％;潜在的B细胞抗原表位分别为19～27、41～48、92～101、110～118、128～137和155～162;潜在的T细胞抗原表位为9～18、140～148和157～165氨基酸序列. 结论 myophilin蛋白可能有6个B细胞抗原表位和3个T细胞抗原表位,有望用作免疫诊断抗原和疫苗候选抗原.
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结核分枝杆菌panD蛋白功能预测及生物信息学分析
目的 研究结核分枝杆菌panD(Rv3601c)基因及其编码蛋白的结构和功能,为耐药结核的治疗提供参考依据.方法 运用ClustalX 2.1、MEGA 6.06软件以及ExPASy、NCBI等在线工具分析结核分枝杆菌panD基因信息,同时分析其进化特征、编码蛋白质的理化性质、信号肽、磷酸化位点、结构特点并预测其功能;利用BepiPred 1.0 Server和NetMHCIIpan 3.1 Server预测panD蛋白的B细胞和T细胞抗原表位. 结果 结核分枝杆菌panD基因全长420 bp,不同菌株panD基因序列相似度100％,具有高度同源性,进化关系较近,编码139个氨基酸.panD蛋白不稳定系数为8.72,亲水性平均系数为0.147,为稳定、疏水性蛋白、无跨膜区与信号肽,存在9个磷酸化位点.二级结构中以无规则卷曲为主,结构较疏松.三级结构同源建模成功.该蛋白具有多个潜在的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位. 结论 panD蛋白作为脱羧酶,在结核分枝杆菌合成β-丙氨酸过程中具有重要作用.panD蛋白序列保守稳定,具有多个优势抗原表位,是治疗耐药结核的潜在新靶标.
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微小巴贝斯虫烯醇化酶蛋白主要特征与抗原表位的生物信息学分析
目的 运用生物信息学方法分析微小巴贝斯虫烯醇化酶(BmEno)基因编码蛋白的主要特征和抗原表位.方法 运用ORF Finder、PROSITE、ProtPar am、SignalP、TMpred、SOSUI、Motif Scan、Bcepred、HNN等生物信息学在线分析软件,结合DNASTAR生物信息学分析软件,预测BmEno蛋白的开放阅读框、特征结构域、理化性质、信号肽、跨膜区、翻译后修饰位点、可溶性、亲水性、表面可及性、二级结构和抗原表位.结果 该蛋白由438个氨基酸组成,在349-362位存在烯醇化酶的特征结构域,分子式为C2098H3366N570O648S18,分子质量单位为47.5203 ku,等电点理论值为5.98,有25个翻译后修饰位点,10个亲水性参数得分≥1.9的区域,6个柔韧性参数得分≥2.0的区域,18个表面可及性参数得分≥1.9的区域,7个潜在的B细胞抗原表位,15个潜在的T细胞抗原表位,为可溶性蛋白.结论 微小巴贝斯虫烯醇化酶蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有潜在的免疫原性,可以作为微小巴贝斯虫的疫苗候选抗原.
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结核分枝杆菌Rv3407蛋白抗原表位的预测
目的 预测结核分枝杆菌Rv3407的抗原表位. 方法 利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3407氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性、柔韧性等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位. 结果 Rv3407蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,潜在的B细胞抗原表位较少,可能位于11-26、28-43、50-61、66-74、76-99位氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高.该蛋白潜在的T细胞抗原表位较多,可能位于2-12、22-26、34-37、40-44、56-60、75-79、86-93位氨基酸残基或其附近. 结论 结核分枝杆菌Rv3407是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原,B细胞抗原表位略少,预测结果为该蛋白抗原表位的进一步研究与应用奠定了基础.
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应用噬菌体肽库技术筛选华支睾吸虫童虫模拟抗原表位的研究
目的 利用噬菌体肽库技术筛选华支睾吸虫童虫模拟抗原表位,观察影响筛选效率和噬菌体滴度的关键因素.方法 收集华支睾吸虫感染童虫期大鼠血清,用正辛酸硫酸铵法提纯多克隆抗体,用提纯的多克隆抗体对噬菌体十二肽库进行3轮筛选.随机挑取噬菌体克隆,用ELISA法检测其特异性. 结果 经3轮免疫学筛选获得19个噬菌体克隆,ELISA测定有17个能被纯化的华支睾吸虫(童虫期)感染大鼠血清抗体识别. 结论 利用噬菌体肽库技术可以筛选出华支睾吸虫童虫模拟抗原表位,靶分子浓度以及噬菌体液的稀释度等因素是技术关键.
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噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域的应用
1985年Smith率先将EcoRI内切酶的部分基因片段插入丝状噬菌体fl的外壳蛋白基因Ⅲ区,使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体表面,并建立了噬菌体表面呈现技术(Phage display techniques).在此基础上,1990年Scott首次将编码随机序列肽的DNA与丝状噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ整合,使随机肽与噬菌体蛋白以融合形式表达,并呈现在噬菌体表面,从而建立了噬菌体随机肽库技术(Phage display random peptide libraries).近年来,噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具,在抗原表位(抗原决定簇)定位和模拟蛋白相互作用位点定位、功能配体或药物的筛选、新型疫苗的研制以及肿瘤治疗上拓宽了研究者的思维,提供了新的途径.目前,该技术在寄生虫学领域同样受到研究者的青睐.本文就噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域中的应用作一综述.
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4株埃博拉病毒核蛋白特异性单克隆抗体抗原结合表位研究
目的 分析鼠埃博拉病毒核蛋白(NP)特异性单克隆抗体抗原结合表位,了解其免疫学特性.方法 经生物信息学分析后,将NP分段重组表达,并分别以之为抗原,通过免疫印迹和竞争ELISA的方法对4株埃博拉病毒核蛋白特异性单抗的抗原结合表位进行分析.结果 经生物信息学表位分析后将埃博拉病毒全长核蛋白分为rNP1-418,rNP419-639和rNP640-739三段进行重组制备,免疫印迹法分析表明4株鼠单抗均识别线性表位,结合位点位于C端100 aa.通过对C端100 aa即rNP640-739 N端连续截短20 aa的方法进行鉴定,4株鼠单抗抗原表位位于埃博拉核蛋白C末端20 aa,但其中2株单抗无明显竞争.结论 明确了具有不同结合位点的埃博拉核蛋白特异性单抗,为免疫学快速检测试剂的研究奠定基础.
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河南地区HIV-1毒株Gag基因抗原表位变异特征及准种特点研究
目的 探讨中国河南地区人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)毒株GAG蛋白抗原表位变异特征,并对其准种特点加以分析.方法 套式聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增确认HIV阳性样本gagp17～p24基因区段并测序,PCR产物纯化后克隆,挑选克隆株鉴定为阳性后测序,以MEGA(version 3.0)等软件进行分析.结果 河南HIV毒株为B'亚型;gag基因p17区段抗原表位突变有E62G(55.80%),Y79F(48.90%),T84V(48.90%),144V(44.20%),gag基因p24区段抗原表位未见明显变异.结论 HIV-1 B'亚型毒株gag基因p17区段的4个抗原表位,存在较大变异,p24区段较为保守,适合抗原表位疫苗的研制.
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H1N1流感病毒HA蛋白抗原表位预测方法研究
目的 对H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白抗原表位预测方法进行研究.方法 用H1N1流感病毒裂解疫苗常规法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合、克隆化筛选,获得特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记各株mAb,ELISA阻断试验检测各mAb相互阻断结果;克隆各mAb的轻链和重链可变区基因,并用计算机模拟预测各mAb结合HA抗原表位的氨基酸位点.结果 获得稳定分泌抗H1N1流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞3株;ELISA阻断试验将3株mAbs分为2类;计算机模拟预测将3株mAbs也分为2类.结论 ELISA阻断试验和计算机模拟预测在解析H1N1流感病毒HA蛋白抗原表位时可以相互佐证.
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HFRS患者BLCL的建立及HTNV S基因片段在其内获得长期稳定的表达
虽然对汉坦病毒核蛋白(HV NP)氨基端蛋白的原核表达产物的抗原性及免疫原性已进行了许多研究,并已用于出血热的诊断,但该抗原表位的精确一级结构及其基因定位迄今尚未完全明确.而研究T细胞表位的前提是首先要构造含病原体抗原基因片段的表达载体质粒.要实现CTL效应细胞对靶细胞的有效杀伤,前提条件之一是效靶细胞必须具有相同的HLA型别.通常选用与效应细胞同源即同一供者的PBMC建立靶细胞,本研究采用与HV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系(EBV-transformed B lymphoblastoid cell line,BLCL)建立靶细胞系,将含有不同汉滩病毒(HTNV)S基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,为下一步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系.
