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猕猴B病毒gC蛋白特异性抗原表位的合成和表达
目的 获得B病毒gC蛋白的特异性表位抗原.方法 利用长片段基因合成的方法,合成B病毒C蛋白的特性抗原表位基因,将该基因连接到pMAL-5x载体,转化到BL21受体菌进行表达,并纯化表达产物.结果 成功的获得了B病毒gC蛋白的特异性抗原蛋白,该蛋白以可溶的形式表达.结论 利用原核表达系统,可以产生B病毒gC蛋白的可溶性抗原,可以作为B病毒的检测抗原.
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原发性胆汁性肝硬化患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶特异性CD8+CTL表位预测及鉴定
目的鉴定原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)上的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,为临床探索特异性免疫治疗奠定基础.方法应用数据库SYFPEITHI预测PDC-E2上两段涵盖B细胞表位和CD4+T细胞表位的氨基酸序列(163～184aa和36～49aa)附近可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,再通过T2细胞株、细胞增殖试验和细胞毒性检测分别分析各抗原肽与HLA-A*0201的结合力、诱导患者外周血单个核细胞(PBMCs)增殖能力及抗原肽诱导的抗原特异性T细胞杀伤毒性,逐步鉴定HLA-A*0201限制性CD8+CTL细胞表位.结果数据库初步预测到5个可能性较大的HLA-A*0201限制性抗原肽,其中两个抗原肽(159～167aa和165～174aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有较高的亲和力,这两个抗原肽能刺激大部分HLA-A*0201阳性PBC患者PBMC增殖,并且由其诱导产生的CTL具有特异杀伤活性.结论位于PDC-E2内酯酰区上的KLSEGDLLA(159～167aa)和LLAEIETDKA(165～174aa)是PBC患者体内HLA-A*0201限制性的CD8+CTL表位.
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利用细菌鞭毛展示的随机肽库筛选HBV-PreS2蛋白表位
目的建立、改进并完善从细菌表面展示随机肽库中进行抗原表位筛选及鉴定的方法.方法以1株抗HBV-PreS2的单克隆抗体3B9为靶标,对FliTrxTM随机肽库进行筛选;监测每轮与抗体特异性结合的细菌克隆富集情况;通过逐轮增加洗涤强度筛选高亲和力克隆;对筛选出的克隆进行序列测定和Western blot鉴定.结果筛选过程中与抗体特异性结合的细菌克隆逐轮得到富集,对16个克隆进行序列测定,共获得10种序列,其中7个序列含典型的RXR(K)GXY保守序列,与病毒PreS蛋白135～140位氨基酸高度同源,Western b1ot反应为阳性;另外3个序列均不含典型的RXR(K)GXY结构,Westem blot反应结果不一.结论细菌表面展示的随机肽库是一种简捷、快速的抗原表位筛选方法.
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血清甲状腺球蛋白测定与甲状腺疾病
甲状腺球蛋白(Tg)是自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的主要自身抗原.各种甲状腺疾病均可出现Tg浓度异常.血清Tg测定对分化型甲状腺癌(DTC)复发或转移的诊断和疗效的监测有重要意义.但是Tg的测定受多种因素影响,其中甲状腺球蛋白抗体(TgAb)的干扰在临床上常见.另外,不同甲状腺疾病Tg抗原表位不同,Tg基因多态性与甲状腺疾病也有一定关系.
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SARS冠状病毒S基因序列及细胞抗原表位预测
目的比较SARS冠状病毒各分离株S基因序列及氨基酸序列之间的差异,预测SARS-CoV的S蛋白的抗原表位.方法利用Lasergene软件包中的EditSeq从21株SARS冠状病毒分离株截取S基因序列并翻译成氨基酸序列,然后用ClustalX软件对截取序列进行比较分析,确定基准株,后用Protean软件对基准株进行抗原表位预测.结果在21株分离株的S基因中有8株核苷酸序列、13株氨基酸序列没有发生点突变;预测出78个可能性抗原表位.结论SARS-CoV的S蛋白相当保守,只发生个别点突变,可能性抗原表位多,且在其中的14个区域中可能性显著.
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细粒棘球绦虫Eg18抗原表位预测
目的 通过生物信息学技术预测细粒棘球绦虫Eg18抗原B、T细胞表位,为细粒棘球绦虫筛选具有保护性抗原表位的抗原提供理论基础.方法 使用Expasy系统预测理化性质;二、三级结构的预测使用在线预测网站Predict Protein;通过在线软件ABCpred、LEPS结合二级结构、亲水性指数、表面可及性指数、柔韧性指数对B细胞表位进行预测;应用SYFPEITHI及IEDB软件预测MHC-Ⅰ类HLA-A0201限制性T细胞表位.结果 Eg18抗原二级结构中α-螺旋结构占氨基酸残基总数的98.1％,无规则卷曲占1.9％,无β-折叠结构;选出具有优势的30 ～41、55～71、110 ～126、136～ 144四个可能为Eg18蛋白B细胞表位的氨基酸序列区域;17 ～ 27、32 ～ 41、61～72、96 ～105四个较有可能形成T抗原表位的氨基酸序列区域.结论 通过生物信息学预测Eg18抗原可能有4个B细胞表位且为构象表位,有4个T抗原表位,可为进一步了解Eg18抗原提供参考.
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细粒棘球绦虫磷酸丙糖异构酶抗原表位预测与分析
目的 利用生物信息学的方法对细粒棘球绦虫EgTPI B、T细胞表位进行预测,为细粒棘球绦虫诊断抗原的筛选提供分子生物学依据.方法 采用Expasy中的protparam数据库推测EgTPI的理化性质;利用IEDB、ABCpred软件分析B细胞抗原表位.AMPHI法预测Th细胞的抗原表位;使用Jpred4软件和SWISS-MODEL构建TPI的二、三级结构;应用MEGA 4.0软件比对细粒棘球绦虫TPI和人类TPI、日本血吸虫TPI、肝片吸虫TPI等7种生物的序列.结果 通过分析得出EgTPI二级结构中直链结构占15.6％、α螺旋占38.9％、转角结构占12.0％、其他结构占42.2％;经多序列比对,人类TPI与细粒棘球绦虫TPI一致度仅为40.08％,较大的差异更有利于形成抗原表位.预测可能的T细胞表位有16-30、71-85、98-119、142-154、178-200;可能的B细胞表位有28-39、50-60、70-80、131-139、150-159、213-231.结论 EgTPI可能形成T细胞表位区域有5个,B细胞表位的区域有6个,EgTPI抗原表位预测分析为疾病诊断的候选分子筛选奠定分子生物学理论依据.
关键词： 细粒棘球绦虫 磷酸丙糖异构酶(TPI) 抗原表位 生物信息学 -
生物信息学预测GPⅡb/Ⅲa抗体CTL、Th的混合表位
背景:GPb/Ⅲa是特发性血小板减少性紫癜患者常见的血小板糖蛋白,已证实该蛋白独特型抗体结合血小板后会激活补体,破坏血小板.目的:以GPⅡbⅢa抗体为靶抗原,应用生物信息学软件对其CTL,Th细胞表位进行多参数预测.设计、时间及地点:开放性实验,于2008-03/08在珠江医院血液科实验室完成.材料:GPⅡb/Ⅲa抗体的氨基酸序列由GENBANK公司提供.方法:分别应用SYFPEITHI,RANKPEP,BIMAS,SVMHC,PREDEP,MHCPRED,PROPRED软件对人和鼠源的血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体蛋白进行HLA-A*0201,HLA-A*1101,HLA-A*2401限制性表位预测,经去除能引起自身免疫的已发表的多肽,取前者覆盖后二者的多肽为混合CTL表位,再联合软件predTAP、TAPPred的TAP结合预测结果,以及NetChop、MAPPP、PAProC软件的蛋白酶切位点预测结果,取能包含二者的多肽为CTL修正表位.用基于肽MHC-Ⅱ结合的算法Syfpeithi,RANKPEP,Mhcpred,HLAPRED进行HLA-DR的Th表位预测,后取Th表位覆盖CTL修正表位,得到CTL、Th细胞混合表位.结果:从1 740条多肽中筛选出5条人源抗人血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体的CTL、Th细胞混合表位肽,即Anti-GPⅡb/Ⅲa-Human的第1-15,24-38,50-64,65-81,109-121位:筛选出5条鼠源抗人血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体的CTL、Th细胞混合表位肽,即Anti-GPⅡb/Ⅲa-Mice的第1-15,26-40,46-60,68-82,93-107位.结论:根据血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体预测的CTL、Th细胞优势抗原表位,可用于制备特异性抗体,可成为特发性血小板减少性紫癜新疫苗研究的靶点.
关键词： 抗原表位 生物信息学 特发性血小板减少性紫癜 -
结核分枝杆菌抗原Ag85A(Rv3840c)限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定
目的 预测及鉴定新的HLA-A*0201结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原Ag85A中的CD8+CTL优势表位.方法 应用数据库SYFPEITHI预测可能存在的HLA-A*0201的限制性CD8+CTL表位,并经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A*0201的亲和力、经时间荧光分辨法检测结核(TB)患者外周血单个核细胞(PBMCs)对抗原肽的增殖反应,再通过细胞毒实验研究抗原肽诱导的T细胞毒杀伤活性,逐步鉴定Ag85A的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位.结果 位于Ag85A氨基酸序列(48-56)的肽表位与HLA-A*0201分子具有较高的亲和力,并能刺激HLA-A*0201阳性结核患者PBMC增殖,诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL.结论 肽6(GLPVEYLQV,48-56 aa)是Mtb抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CD8+CTL的优势表位,这为今后进一步研究结核杆菌,作为设计结核疫苗的候选表位奠定了一些基础.
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QLFATINSTL(93-102aa)是隐球菌抗原MP98 CTL优势表位
目的 鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位.方法 应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A*0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位.结果 位于MP98氨基酸序列肽3(93-102aa)与HLA-A*0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA-A*0201阳性个体PBMC增殖,并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL.结论 肽3 QLFATINSTL(93-102aa)是抗原MP98上HLA-A*0201限制性CD8+CTL的优势表位,可作为隐球菌疫苗设计的候选表位.
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HIV多抗原表位疫苗的构建
以CD8+的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+的辅助性T淋巴细胞(HTL)为介导的细胞免疫应答是有效地控制和清除包括HIV在内的多种病毒病原体的必备条件.因而,人们对于能够诱导CTL和HTL免疫应答的HIV-1疫苗的研究兴趣浓厚,使HIV疫苗很快由学术研究向商品开发和工业生产等领域过渡和延伸.
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HIV的抗原表位研究的国内外进展
人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)感染后,会刺激人体产生特异性免疫应答反应.其中,以中和抗体为代表的体液免疫应答和以CD8+的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)及CD4+的辅助性T淋巴细胞(HTL)为介导的细胞免疫应答,对控制HIV在体内的复制有重要作用.在上述免疫应答的过程中,病原体自身所携带的抗原表位是刺激机体产生免疫应答的必备条件.同时,抗原表位的变化也是HIV病毒逃逸机体免疫监视的重要机制之一.本文试就HIV抗原表位的国内外的研究状况做一综述.
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SARS冠状病毒S蛋白抗原表位串联基因的设计和表达
目的:表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,为研制新型的SARS病毒疫苗提供新思路.方法:应用生物信息学分析软件分析SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,设计全新的抗原表位编码基因序列,构建表达载体并在大肠杆菌中表达该基因.结果:设计并合成了SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列的新基因序列,在大肠杆菌中实现了该基因的高表达.结论:可以重新设计新基因产生新型候选重组疫苗.
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戊型肝炎病毒Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ基因型B细胞抗原表位的异同
目的:制备戊型肝炎病毒(HEV)缅甸株和墨西哥株ORF2重组蛋白(p166Bur和p166Mex)的单克隆抗体(McAbs),用于分析HEV不同基因型B细胞抗原表位的特点.方法:将免疫BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得分泌抗-p166Bur和抗-p166Mex McAbs的杂交瘤细胞株,然后采用ELISA和免疫印迹法测定 McAbs与不同基因型HEV ORF2编码蛋白p166的免疫反应性.结果:获得4株杂交瘤细胞株,即分泌抗-p166Bur McAbs的2C2、2B1以及分泌抗-p166Mex McAbs的D8G10和E5E12,其中2B1分泌的McAb仅能与第Ⅰ、Ⅱ基因型编码的重组蛋白结合,而其余3株分泌的McAbs既能与I、II基因型HEV的p166重组蛋白发生反应,也能与III、IV基因型的p166蛋白反应.结论:HEV第Ⅰ、Ⅱ基因型与Ⅲ、Ⅳ基因型ORF2编码蛋白既有共同又有不同的B细胞抗原表位.
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HPV16E7E6抗原表位嵌合体DNA抗肿瘤疫苗的研究
目的:探讨HPV16 E7、E6抗原表位与HSP70 N端重组DNA疫苗抗肿瘤活性.方法:以重叠PCR将HPV16 E7基因N端60个氨基酸的编码序列与E6基因的10个(48～57)氨基酸的编码序列及HSP70 N端序列进行融合.以pcDNA3.0为载体,构建真核表达载体pcD-E76HSP.重组质粒免疫C57BL/6小鼠后,通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细胞免疫反应及反应强度;观察该疫苗对C57BL/6小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的治疗效果.结果:重组DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠后,小鼠脾淋巴细胞体外增殖明显,并可诱导产生针对TC-1肿瘤细胞的特异性CTL反应;体内抑瘤试验显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小鼠移植瘤的生长有抑制作用.结论:该疫苗能激发特异性细胞免疫反应,显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长.
关键词： 人乳头状瘤病毒16型 抗原表位 热休克蛋白70 融合基因 DNA疫苗 -
自身抗原52 kD-Ro/SSA的序列分析及抗原性预测
目的:分析自身抗原52 kD-Ro/SSA的序列结构,预测其抗原位点.方法:将自身抗原52 kD-Ro/SSA的氨基酸序列输入"蛋白质结构预测"软件包,分析蛋白质分子亲水性、表面可及性、柔性,并模拟其二级结构,预测其主要抗原位点.结果:自身抗原52 kD-Ro/SSA是多抗原位点,其氨基酸序列中120～130、300～320、360～380位间抗原性较强.结论:确定52 kD-Ro/SSA的抗原优势表位,为研究抗原抗体间相互作用及其疾病机制打下基础.
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抗人CD33单克隆抗体(HIM3-4、WM53、M195)抗原识别表位的初步研究
目的:确定抗人CD33单克隆抗体(HIM3-4、WM53、M195)抗原识别表位所在区域,进而阐明抗体识别表位不同于其介导的生物学作用之间的关系.方法:将四个CD33胞外区不同长度的基因片段定向克隆入真核表达载体pDisplay,构建成真核表达载体pDisplay/EP1、2、3、4,分别将空载体和构建的质粒通过磷酸钙沉淀法转染入293T细胞,瞬时转染48小时后利用流式细胞仪通过抗血凝素A(HA)抗体标记以检测各质粒在细胞表面的表达, 同时检测HIM3-4、WM53、M195和不同区段的结合活性.结果:抗人CD33单克隆抗体HIM3-4能识别pDisplay/EP1、2、3表达的蛋白,WM53能识别pDisplay/EP1表达的蛋白,M195则均能识别四个片段所表达的蛋白.结论:HIM3-4、WM53、M195识别的CD33抗原表位分别位于115～170、17～60、170～262氨基酸.
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抗人TNF-α单克隆抗体抗原识别表位的初步研究
目的:确定抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)单克隆抗体(Z8)识别的抗原表位所在区域.方法:分别构建缺失hTNF-α不同部位的重组质粒,用IPTG诱导表达融合蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot分析.结果:Z8特异性识别含有hTNF-α C端92-157位氨基酸在内的融合蛋白,而不识别GST及其与hTNF-α N端1-91位氨基酸所形成的融合体.结论:Z8抗体识别的抗原表位位于hTNF-α 92-157区.
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噬菌体文库与计算机模拟筛选H1N1流感病毒血凝素结合位点的比较
目的:对H1N1流感病毒血凝素HA的抗原表位初步筛选.方法:用噬菌体展示文库对2株抗体的结合位点进行筛选,将筛选的抗原位点结合HA序列进行多肽合成,免疫小鼠制备单克隆抗体,通过分子生物学手段对4株抗体的轻链和重链可变区基因进行调取,通过计算机模拟抗体序列结合的抗原的结构域,推测抗体结合的氨基酸位点.结果:噬菌体文库筛选得出抗体的结合序列富含组氨酸和精氨酸,将针对多肽的单克隆抗体的序列和前期获得的2株抗HA单克隆抗体的序列比对分析,发现A1-8和anti-14p结合的HA抗原序列相一致,H1-13和anti-11p结合的HA抗原序列相一致.结论:通过将噬菌体展示文库技术和计算机模拟预测抗原抗体结合,可以有效筛选抗原表位,为流感病毒HA抗原表位预测方法的完善提供理论基础.
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从随机9肽库中筛选HCV抗原表位
目的:用患者血清中抗HCV抗体从随机9肽库中筛选HCV抗原表位.方法:将病人血清用硫酸铵粗提后,用ProteinA亲和层析柱纯化和制备抗HCV多克隆抗体;以此为筛选配基,对噬菌体表面展示的随机9肽库进行亲和筛选.结果:三轮筛选的投入产出比逐轮升高至5.0×10-3、假阳性率逐轮降低至0.2%,提示具有良好的富集效果.从第三轮挑选出的15个克隆进行结合试验,发现7个克隆只与HCV抗体有较强的结合力而不与正常人血清反应;测序表明6个克隆的外源肽含有核心序列SPVAXVLXT.用阳性噬菌体克隆检测20例病人血清,有程度不等的阳性反应.结论:用多克隆抗体从噬菌体随机肽库中筛选得到了有一定功能的模拟表位.
