首页 > 文献资料
-
人3型腺病毒六邻体高变区HVR1、HVR2、HVR5、HVR7的氨基酸修饰限制研究
传统腺病毒载体的局限性使得外源抗原以衣壳融合表达的方式在腺病毒载体上的应用越来越广泛,但是在人3型腺病毒(Adenovirus serotype 3,Ad3)载体六邻体高变区(Hypervariable region,HVR)改造过程中经常出现无法成功拯救病毒的情况,本研究主要根据对生物信息学预测的HVR1、HVR2、HVR5和HVR7中某些氨基酸进行删减或保留,通过构建重组Ad3载体pBRAd△E3GFP-mHexon,转染AD293细胞,验证Ad3载体在六邻体高变区的这些氨基酸进行修饰时对病毒拯救的影响,并由此获得高变区HVR1、HVR2、HVR5和HVR7在基因工程改造中应该保留的氨基酸的数据.这一研究结果为人3型腺病毒六邻体融合表达策略提供了操作依据,也为人3型腺病毒六邻体表达外源抗原表位,作为多价疫苗载体展示平台的应用奠定了基础.
-
腺病毒41型感染致儿童腹泻一例临床表现及病毒基因组学特征分析
目的 针对消化道疑似感染病例,采用高通量测序技术筛查病原体,并测定其全基因组序列,阐明其基因组及进化特征. 方法 通过对原因不明腹泻患儿的粪便进行病原体高通量基因测序,然后拼接其全基因组序列,采用大似然法(选择bootstrap为1000)绘制主要抗原蛋白六邻体(hexon)、五邻体(penton)和纤维突蛋白(fiber)的进化树,分析进化特征;运用Recombination Detection Program version 4 (RDP4)软件进行序列重组分析;使用软件CLC Genomics Workbench 9.0分析突变位点. 结果 患儿临床表现主要为发热、呕吐、腹泻伴抽搐,通过对腹泻患儿的粪便样品高通量测序,使用本实验室高通量测序数据分析程序检出41型腺病毒(HAdV-41).进一步测序和拼接获得该病毒全基因组序列,其基因组全长34 138 bp.序列比对显示该病毒核苷酸序列与已报道序列的高同源性为99％(Human adenovirus 41 isolate NIVD103),属于腺病毒F亚属.对该病毒六邻体、五邻体和纤维突蛋白进行进化分析,其六邻体与HAdV-41 isolate NIVD103,HAdV-41 isolate SH/2015/D16亲缘关系较近,五邻体与HAdV-41 isolate NIVD103,HAdV-41 isolate SH/2015/D16,HAdV41 isolate SH/2015/D240,HAdV-41 isolate SH/2015/D381亲缘关系较近,纤维突蛋白与五邻体相似;对全基因组序列进行重组分析,未发现明显的重组迹象,但突变分析显示引起此例腹泻的病毒株基因组有多处突变. 结论 从一例腹泻患儿粪便中检出的病原体为新的41型腺病毒,该病毒基因组与以往发现的41型腺病毒有较大差异,其流行态势、致病性及免疫原性值得关注.
-
2013—2015年安庆地区腺病毒流行株型别鉴定及六邻体基因特征分析
目的 了解引起安庆地区急性呼吸道感染的人类腺病毒( HAdv)流行株型别特点及编码六邻体蛋白基因及氨基酸残基的变异情况.方法 收集2013—2015年间流感监测哨点596份急性呼吸道感染患儿咽拭子,real-time PCR腺病毒核酸检测试剂盒进行检测,阳性标本进行Hep细胞病毒分离,对病毒分离成功样本进行六邻体蛋白基因( hexon gene) PCR扩增、测序并将序列与Gen-Bank发表的序列进行同源比对和进化树分析.结果 HAdv阳性标本68份,阳性率为11. 4% .病毒分离成功34株,其中,HAdv-3型为9株占26. 5% ;HAdv-7型为12株占35. 3% ;HAdv-14型为12株占35. 3% ;HAdv-55型为1株占2. 9% . 9株HAdv-3型分离株与KX384958亲缘关系近,为99. 8% ～100% ,与其他株相比较氨基酸残基的变异主要有 3 个;12 株 HAdv-7 型分离株与 KX897164 和KU361344亲缘关系近,为99. 8% ～100% ,与其他株相比较氨基酸残基的变异主要有7 个;12 株HAdv-14型分离株与JF420883亲缘关系近,为99. 6% ～99. 9% ,与其他株相比较氨基酸残基的变异主要有3个;1株HAdv-55型分离株与KP279748和KX289874亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸的同源性为100% .在这几个型别的研究株中HAdv-7 型变异大,其次为 HAdv-14 型.结论 2013—2015年,引起安庆地区急性呼吸道感染的腺病毒流行株主要为HAdv-3型、HAdv-7型、HAdv-14型,同时存在少量HAdv-55型. HAdv-55型分离株六邻体基因稳定,没有出现变异.而HAdv-3型、HAdv-7型、HAdv-14型型别之间,核苷酸和氨基酸均发生不同程度的变异.在抗原决定簇HVR1、HVR2 和HVR7区存在氨基酸的变异.
-
腺病毒六邻体蛋白部分基因的构建表达及表达产物抗原性研究
腺病毒是人类呼吸道、胃肠道、眼部等部位许多疾患的重要病原之一[1],引起人的急性呼吸系统疾病、流行性角膜结合膜炎、咽结合膜热等.在儿童急性感染疾病中,2%～7%是由腺病毒引起的,有时可造成一定范围的流行.由于腺病毒型别较多,给实验室诊断带来一定困难.
-
人3型腺病毒衣壳六邻体嵌合乙肝病毒preS1双抗原表位重组体的构建及其抗原性的初步鉴定
目的：通过构建在六邻体中嵌合表达乙肝病毒表面抗原preS1上两个中和抗原表位的人3型重组腺病毒，鉴定应用此策略所展示表位的抗原性。方法利用overlap PCR技术扩增出在HVR1和HVR2中分别引入乙肝病毒表面抗原中和表位KR359和KR127的嵌合六邻体基因，酶切后连接入穿梭质粒pBR322-L/R，然后与骨架质粒pBRAdΔE3GFP共转化至BJ5183中重组，得到阳性克隆pBRAdΔE3GFP-preS1。将其线性化后转染293细胞拯救病毒，再大量扩增并纯化。同时应用表达载体pGEX-4T3表达融合蛋白GST-KR359KR127，将重组病毒和GST融合蛋白分别免疫BALB/c小鼠获得多抗血清。 ELISA、Western blot实验鉴定嵌合表位的抗原特性。结果人3型腺病毒载体成功的在衣壳六邻体表面展示了乙肝病毒表面抗原中和表位KR359和KR127，并且诱导产生的多抗血清能识别GST融合表达抗原以及天然的乙肝病毒表面抗原。结论衣壳融合策略置换高变区来展示外源中和表位的方法可行，并且可以通过同时置换多个高变区来达到加强免疫效果或者多价抗原免疫保护的作用，为人3型腺病毒六邻体嵌合载体系统在疫苗研究中的应用奠定基础，同时也为新型乙肝疫苗的研制奠定基础。
-
1型登革病毒抗原表位嵌合人3型腺病毒六邻体重组病毒的构建及免疫学鉴定
目的：构建六邻体嵌入1型登革病毒（ DENV1）抗原表位的人3型重组腺病毒，鉴定其抗原性。方法以人3型腺病毒骨架质粒pBRAdΔE3GFP为模板，overlap PCR在六邻体高变区HVR1插入DENV1的抗原表位，突变的六邻体片段克隆到穿梭载体，酶切后与线性化的3型腺病毒骨架质粒pBRAdΔE3GFP在大肠杆菌BJ5183同源重组，获得阳性重组腺病毒质粒pBRAdΔE3GFP-DENV1。线性化后转染AD293细胞拯救重组腺病毒rAdΔE3GFP-DENV1并大量培养。纯化后腺病毒免疫BALB／c小鼠，通过ELISA和Western blot检测小鼠的体液免疫应答。结果在人3型腺病毒六邻体成功插入DENV1抗原表位并包装出重组腺病毒，ELISA和Western blot结果显示小鼠免疫后能产生血清识别DENV1。结论成功构建六邻体HVR1嵌入DENV1抗原表位的重组腺病毒，为多价登革病毒疫苗的研究奠定了基础。
-
人腺病毒六邻体蛋白保守区抗原性分析
目的 阐明人腺病毒(HAdV)六邻体蛋白保守区的抗原性的特征,为鉴定六邻体的抗原表位奠定基础.方法 用生物信息学软件ANTHEPROT 5.0和DNAMAN对HAdV3六邻体氨基酸序列进行抗原性预测分析和二级结构的分析,然后由SWISS-MODEL Protein Modelling Server预测出HAdV3六邻体蛋白三维结构.结果 抗原性预测分析显示,在六邻体的前段和中段,该区域含有大量的保守区,可能具有较强的抗原性,而六邻体后段总体抗原性较弱.根据HAdV2六邻体蛋白三维结构模型预测出HAdV3六邻体蛋白三维结构.结论 六邻体的前段和中段的部分保守区域在腺病毒颗粒上可能具有较好的暴露性并可能含有抗原性较强的型间或组特异性抗原表位.
-
腺病毒六邻体蛋白结构、功能及疫苗研究
腺病毒在自然界分布广泛,可引起多种疾病.腺病毒是儿童呼吸系统疾病的常见病原,它有51个血清型,3、7型常引起严重的呼吸道疾病.腺病毒的主要结构蛋白为五邻体和六邻体,其中六邻体-Loop1、Loop2是重要的中和抗原,可以刺激机体产生中和抗体.目前已对腺病毒的中和抗原六邻体蛋白的结构、功能进行了广泛的研究,可为基因工程疫苗的开发奠定良好的基础.
-
人腺病毒3型六邻体基因的克隆与鉴定
目的克隆人腺病毒3型(Ad3)六邻体-L1(Hexon-L1)、六邻体-L2(Hexon-L2)区基因,构建含有该基因的重组质粒,并进行测序鉴定,为进一步构建表达载体,制备基因工程疫苗打下基础.方法从Ad3感染的HeLa细胞中提取 Ad3 DNA, 用PCR方法扩增Hexon-L1、Hexon-L2基因,将得到的片段定向克隆到克隆载体pUC19质粒中,对克隆片段进行DNA测序鉴定.结果构建了重组质粒pUC19Hexon,测序结果与Genebank中该序列进行同源性比较证明克隆的片段为Ad3六邻体序列.结论成功克隆了Ad3的Hexon-L1、Hexon-L2区基因.
-
人3型腺病毒六邻体基底区重组蛋白的克隆表达和纯化
目的 克隆、表达人腺病毒六邻体蛋白基底区片段,为后续研究六邻体蛋白的抗原性及蛋白结构,进而研发腺病毒的基因工程疫苗及诊断试剂奠定基础.方法 以3型人腺病毒核酸为模板,用PCR法扩增六邻体基底区片段,将该片段定向克隆至pQE32质粒,在大肠杆菌表达系统中表达带有组氨酸标签的重组蛋白片段,利用镍亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果 构建出重组表达质粒,通过测序验证了克隆结果的正确性;在大肠杆菌表达体系中获得了高效表达.结论 成功表达并获得了纯化的人3型腺病毒六邻体基底区重组蛋白片段.
-
人腺病毒55型六邻体蛋白同源建模及B细胞抗原表位预测
目的 预测人腺病毒55型六邻体蛋白B细胞抗原表位.方法 使用DNAStar软件Protean模块,PSIPRED在线服务器和SWISS-MODEL在线服务器联合预测人腺病毒55型六邻体蛋白B细胞抗原表位.结果 构建了人腺病毒55型六邻体蛋白三级结构模型和预测得到5个候选的人腺病毒55型六邻体抗原表位.结论 成功预测人腺病毒55型六邻体蛋白B细胞抗原表位,为进一步研制疫苗和检测试剂奠定了基础.
-
重组人3型腺病毒六邻体蛋白纯化及抗原性检测
目的纯化重组人3型腺病毒六邻体蛋白并检测其抗原性.方法在原核表达系统中高效表达重组人3型腺病毒六邻体蛋白.利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行蛋白纯化.用纯化的重组六邻体蛋白免疫新西兰家兔,利用免疫印迹技术检测其血清中抗体效价以鉴定该蛋白的免疫原性和反应原性.结果得到纯化的重组人3型腺病毒六邻体蛋白,该蛋白免疫后产生高效价抗体,该抗体能与重组六邻体蛋白、含有该蛋白的重组工程菌株以及人3型腺病毒发生特异性的免疫印迹反应,证明该重组六邻体蛋白具有良好的抗原性和3型腺病毒特异性.结论所获得的重组人3型腺病毒六邻体蛋白具有良好的抗原性和特异性,为开发基因工程疫苗奠定了基础.
-
人3型腺病毒六邻体基因表达质粒的构建及表达
目的表达人腺病毒3型六邻体蛋白,为制备基因工程疫苗打下基础.方法 BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组克隆质粒pUC19Hexon和载体pQE31,将得到的目的片段定向连接到表达载体pQE31中,对目的片段进行DNA测序鉴定,IPTG诱导高效表达.结果构建了表达重组质粒pQE31 Hexon,测序鉴定了克隆序列的准确性.在大肠杆菌中成功地表达了Ad3六邻体蛋白.结论成功表达了Ad3的六邻体蛋白.
-
重组人3型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备抗人3型腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体并对单抗进行鉴定.方法 用纯化的重组六邻体蛋白免疫BALB/c小鼠.取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合.经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗.使用ELISA、Western blot和中和实验等方法鉴定单抗的敏感性、特异性以及中和活性.结果 ELISA和免疫印迹结果表明这4株单抗与腺病毒六邻体蛋白可以特异性结合.而且,4C6株单抗具有中和活性.结论 获得了4个单抗为腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体,可用于3型腺病毒的早期诊断和药物治疗的研究.
-
人5型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的：制备抗人5型腺病毒（HAdV5）六邻体（Hexon）蛋白的单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用纯化的Hexon蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经ELISA间接法筛选和克隆化培养，获得4株分泌抗 HAdV5的Hexon蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。纯化获得单克隆抗体，使用ELISA 和Western blot鉴定单克隆抗体的敏感性和特异性。结果 ELISA和Western blot结果表明这4株单克隆抗体与 HAdV5的Hexon蛋白可以特异性结合。单克隆抗体株4A9-HRP标记和8D6建立的ELISA夹心法具备较高灵敏度和特异性。结论获得4株抗 HAdV5的 Hexon蛋白的单克隆抗体，为 HAdV5相关的疫苗研制和 HAdV5感染性疾病的早期快速诊断奠定了基础。
-
2004年广州地区流行的3型腺病毒六邻体基因序列分析
[目的]分析2004年夏广州市某幼儿园流行的3型腺病毒(adenovirus type 3,Ad3)的六邻体基因序列,为Ad3的基础及临床研究提供依据.[方法]采集急性咽结膜炎患儿急性期的眼、咽拭子,提取腺病毒DNA,分两段进行PCR,扩增腺病毒六邻体基因,将扩增的片断进行T-载体克隆及序列分析.[结果]成功地测出了Ad3六邻体基因序列,并在Genebank登记注册,注册号AY878716,与Genebank中Ad3六邻体基因序列进行同源性比较,同源性为99%.[结论]腺病毒(Ad3)六邻体基因序列,并与Genebank中Ad3六邻体基因序列变异是否与其毒力的改变和致病性、传染性相关,尚需作进一步的研究探索.
