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B族链球菌C5a肽酶蛋白表位的克隆、表达和免疫学分析
目的 应用生物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白表位,结合基因工程手段进行表位重组、表达和免疫原性分析.方法 用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测B族链球菌C5a肽酶蛋白的表位,应用PCR技术扩增出编码该表位基因片段,克隆PCR产物构建重组质粒,测序验证.在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白.表达的蛋白经质谱分析和Western blot鉴定.纯化该融合蛋白并免疫C57/BL小鼠,萃取GBS表面蛋白,双向琼脂扩散试验检测抗体水平.结果 在SCPB中预测到1个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段.重组和表达了这一肽段,质谱得出与SCPB蛋白的相似性分数为79,Western blot证实能与抗SCPB的抗体反应,纯化后融合蛋白纯度＞90%.动物实验证实融合蛋白能产生特异性的抗GBS抗体.结论 重组表位具有一定免疫原性,为相关蛋白的毒力机制研究和亚单位疫苗等方面的研究打下了良好的基础.
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B族链球菌表面蛋白C5a肽酶系统及鼻内黏膜免疫的研究
目的 研究B族链球菌表面蛋白C5a肽酶(streptococcal C5a peptidase,ScpB)系统及其鼻内途径免疫后在小鼠血清及肺、直肠、阴道等黏膜部位特异性抗体水平,探讨ScpB蛋白黏膜免疫应答的效果.方法 在大肠杆菌BL21中表达ScpB蛋白,亲和层析法进行纯化,质谱分析法对所纯化的蛋白进行鉴定.小鼠随机分为5组,每组10只.分别为对照组、皮下30μg组、鼻内5μg组、鼻内10μg组和鼻内30μg组.用ELISA法检测小鼠血清及黏膜萃取液中特异性抗体水平;调理吞噬试验检测SepB蛋白抗血清的保护性功能.结果 成功表达并纯化了ScpB蛋白;质谱分析和蛋白质库比较证实其为B族链球菌表面蛋白C5a肽酶的可能性分值为175;ELISA显示ScpB蛋白皮下30μg及鼻内不同剂量(5 μg、10 μg、30μg)免疫后均可诱发小鼠产生高水平特异性IgG抗体(P＜0.01),30 μg剂量组IgG大于5μg及10μg剂量组(P＜0.05);鼻内不同剂量(5μg、10μg、30μg)免疫后均可诱发小鼠产生高水平的黏膜特异性IgA抗体,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);黏膜免疫组间无差异;30 μg ScpB蛋白皮下免疫后黏膜特异性IgA抗体与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).SepB抗血清对细菌具有调理吞噬作用,吞噬指数为12.3,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 B族链球菌表面蛋白C5a肽酶鼻内途径免疫小鼠后可在血清、肺及阴道、直肠等免疫近端和远端黏膜中产生相应高水平IgG及IgA抗体,上述ScpB抗体具有促进吞噬细胞吞噬B族链球菌的功能.
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B族链球菌C5a肽酶功能活性区域的分段表达
目的表达B族链球菌C5a肽酶蛋白功能活性区域,为进一步研究及开发疫苗奠定基础.方法设计引物,从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出含有C5a肽酶蛋白不同功能区域基因的4个目的片段,分别插入T载体,再经酶切后,插入原核表达载体PET32a,进行融合表达.对表达蛋白进行免疫原性检测,并通过镍柱大量纯化.结果成功构建4个目的片段的PET表达质粒.经SDS-PAGE检测表达的融合蛋白相对分子质量分别为80 000、78 000、70 000和36 000.蛋白质谱分析证实,表达的4个蛋白为B族链球菌C5a肽酶蛋白的可能性分数分别为82、152、113和79.免疫印迹证实均能与特异性抗C5a肽酶蛋白的抗体反应,纯化后的蛋白SDS-PAGE纯度达90%.结论已成功地表达了可溶性C5a肽酶蛋白4个功能活性区域,为蛋白免疫表位和毒力机制的研究以及亚单位蛋白疫苗的制备奠定了基础.
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B族链球菌C5a肽酶表位的预测、分段表达及其免疫原性
目的 应用牛物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白(sCPB)的表位,分段表达其中4个功能活性区域,并分析其免疫原性.方法 用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测SCPB的表位;分别构建C5a肽酶4个目的片段的重组表达质粒.经酶切测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量;并经镍柱亲和层析纯化,纯化的重组蛋白进行蛋白质谱分析和Western blot分析后,皮下免疫小鼠.ELISA检测小鼠血清抗体水平.结果 经预测,SCPB含1个既可结合MHC又具有B细胞表位特征的肽段.构建的4个重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,目的蛋白主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%～70%.纯化的重组蛋白纯度可达90%,质谱分析表明与SCPB的相似性很高;Western blot分析表明.可与兔抗全长SCPB多克隆抗体反应.重组F1、FE、Fn蛋白免疫小鼠血清抗体滴度较高,三者差异无统计学意义;F2a蛋白抗体滴度低,与F1、FE和Fn蛋白差异有统计学意义.结论 已成功构建并高效表达了SCPB的4功能活性区域;Fn是重要的免疫优势表位功能区;本文为B族链球菌毒力机制的研究及亚单位蛋白疫苗的研制奠定了基础.
