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Real time RT-PCR与直接免疫荧光法对鼠肺中汉坦病毒检测效果比较
目的 比较Real Time RT-PCR与直接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒(hantavirus,HV)带毒率的差异,为进一步完善实验室检测方案提供依据.方法 2015年秋季内蒙古自治区呼伦贝尔市莫力达瓦旗肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫区捕获啮齿类动物,对捕获的啮齿类动物进行分类鉴定.取122只鉴定后的鼠进行无菌解剖取肺组织,提取RNA,用Real Time RT-PCR扩增汉坦病毒目的基因,同时将122份肺组织冷冻切片,进行直接免疫荧光试验(direct immunofluorescenee,DIF).结果 呼伦贝尔市莫力达瓦旗HFRS疫区是以黑线姬鼠为主的混合疫区,捕获鼠类8种共422只,鼠类平均密度为14.81％.在检测的122份鼠肺中,Real Time RT-PCR结果显示:27份鼠肺样品检测到HV核酸阳性,且均为HTNV型,鼠带毒率为22.13％,其中黑线姬鼠16份,占阳性鼠的59.26％.直接免疫荧光法结果为:3份鼠肺样本为阳性,鼠带毒率为2.459％,3份阳性鼠肺均为黑线姬鼠.利用统计软件SPSS 14.0进行统计学分析,两种方法检测结果有统计学差异(x2=21.892,P＜0.01).结论 与DIF法相比,Real Time RT-PCR检测HV阳性率更高,采用DIF方法可能会低估内蒙古自治区肾综合征出血热疫区的疫情情况.
关键词： 肾综合征出血热 汉坦病毒 直接免疫荧光法 实时荧光反转录聚合酶链式反应 -
2001～2003年浙江省肾综合征出血热监测分析
目的分析浙江省肾综合征出血热(HFRS)监测数据,提出预防策略.方法描述流行病学方法分析HFRS疫情,调查宿主动物,用直接免疫荧光法(FA)检测HFRS抗原,用间接免疫荧光法(IFA)测特异性IgG抗体.结果近3年来全省HFRS病例总数为4 240例,死亡19例,发病率为3.12/10万,病死率为0.45%.其中2003年发病数和死亡数与2002年相比分别下降36.76%和50.00%.2002年比2001年发病下降24.00%.全省HFRS发病仍具有相对集中和稳定的特点,主要分布在钱塘江沿岸的浙东、浙西丘陵地带和浙南山区.绍兴、宁波和台州发病多,占全省发病总数的56.30%.全年均有发病,其中5～7月份(1 276例)和11至翌年1月份(1 341例)发病较多,分别占总数的30.09%和31.63%.发病以20～50岁人群为主,占发病总数的68.35%.职业以农民为主,占79.34%.男女性别比2.5:1.病例的临床诊断符合率为82.51%;健康人群隐性感染率为2.04%.鼠类血清阳性率11.76%;鸭血清阳性率23.26%.野外以黑线姬鼠为优势鼠种,其次为褐家鼠;室内以褐家鼠为优势鼠种.鼠肺带毒率15.55%.结论宿主动物带毒率较高,需要继续加强监测.
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宁夏首次从社鼠鼠肺中分离到汉坦病毒
汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属,是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)的病原体[1].在我国流行的是HFRS,鼠类为其自然宿主和主要传染源.2009年,笔者从1只社鼠鼠肺中分离到汉坦病毒,经鉴定为汉滩型(HTN),现报告如下.一、材料与方法1.标本来源:于2009年在宁夏回族自治区泾源县HFRS监测点,采用夹夜法捕鼠,共捕鼠266只.捕获鼠类经分类鉴定和登记后,无菌解剖采集鼠肺标本,共采集266份鼠肺标本.2.鼠肺组织抗原检测:采用直接免疫荧光法,将采集的鼠肺标本用冷冻切片机制成3～5 μm厚的切片,冷丙酮固定10 min后吹干.玻片上滴加用伊文思兰PBS稀释的抗汉坦病毒单克隆荧光抗体(由国家出血热实验室提供)15 μl/孔,置湿盒内37℃水浴30 min.反应后的玻片用 pH 7.2～7.4,浓度为0.02 mol/L PBS冲洗3次,蒸馏水漂洗1次,吹干,荧光显微镜观察结果.
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七种呼吸道病毒抗原检测在儿童呼吸道感染中的分析
目的 了解广东清远地区儿童呼吸道病毒感染情况,为儿童呼吸道病毒感染的诊断提供依据.方法 收集我院2014年2月-2015年1月住院的呼吸道疾病患儿5121例,采用直接免疫荧光法对其鼻咽部分泌物进行流感病毒 (influenza virus, IF)A、IFB、 副流感病毒 (parainfluenza virus, PIV)1、PIV2、PIV3、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)以及腺病毒(adenovirus, ADV)进行抗原检测, 并对数据进行统计学分析. 结果 5121例呼吸道感染患儿中检出呼吸道病毒1801例, 阳性率为35.17%. 其中,RSV为937例(52.03%)、IFA为312例(17.32%)、ADV为209例(11.60%)、PIV3为186例(10.33%)、PIV1 为 60 例(3.33%)、IFB 为 38 例(2.11%)、PIV2 为 5 例(0.28%)、混合感染为 54 例(3.00%).男、女感染呼吸道病毒患儿的阳性率经比较,差异无统计学意义(P>0.05).≤1岁和2~3岁患儿感染病毒的阳性率均高于4~5岁、6~7岁和8~12岁患儿, 且各组间比较差异有统计学意义 (P均<0.05).≤1岁和2~3岁患儿感染RSV的阳性率高(61.84%,44.99%),其余三组患儿感染ADV的阳性率高(44.52%,36.84%,53.49%). 5121例患儿在春季感染病毒的阳性率高于夏、秋、冬季,经比较差异有统计学意义(P<0.05),其中春、夏、秋季均以感染RSV的阳性率高(52.26%,73.61%,33.12%),冬季以感染ADV的阳性率高(23.34%).5121例患儿中,患急性气管炎的患儿感染病毒的阳性率高于患上呼吸道感染、肺炎和支气管炎的患儿,经比较差异有统计学意义(P<0.05),其中上呼吸道感染、急性气管炎和肺炎患儿感染RSV的阳性率高(66.53%,38.81%,61.25%),支气管炎患儿感染IFA的阳性率高(37.58%).54例混合感染患儿中,以感染RSV的患儿多(26例).结论 RSV是清远地区儿童呼吸道病毒感染的主要病原体,3岁以下儿童呼吸道病毒感染率高,春季为呼吸道病毒感染高发季节.
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直接免疫荧光法与多重逆转录聚合酶链反应对呼吸道感染常见病毒的诊断价值
目的 探讨直接免疫荧光法(DFA)和多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对呼吸道常见病毒人鼻病毒(HRV)感染患者分泌物的检测,判断其临床诊断价值.方法 选取2010年2月-2011年12月收集的急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物210例,分别用DFA和RT-PCR进行检测,对两组测定方法的检测结果进行判定.结果 多重RT-PCR检出112份阳性标本,阳性率为53.33％,DFA检测出89份阳性标本,阳性率为42.38％,两组比较,差异有统计学意义(x2=27.623,P＜0.01).结论 DFA检测方法可以广泛适用于临床检测中；多重RTPCR检测方法的敏感性高,检测病毒的范围广,可以做亚型鉴定方法,适用于呼吸道病毒流行病学的调查研究.
关键词： 直接免疫荧光法 多重逆转录聚合酶链反应 呼吸道 人鼻病毒 -
直接免疫荧光法对住院患儿肺炎衣原体的诊断意义
目的 探讨一种快速诊断住院患儿呼吸道肺炎衣原体感染的方法.方法 应用直接免疫荧光法,对因呼吸道感染而住院的婴幼儿鼻咽部分泌物肺炎衣原体抗原进行检测.结果 1022例婴幼儿中有82例肺炎衣原体检测阳性,阳性率为8.02％,其中男62例,阳性率为9.23％,女20例,阳性率为5.71％,差异有统计学意义(x2=3.85,P＜0.05)；从年龄分布情况看,12～24月的婴幼儿感染率高,达14.77％;4-6月为肺炎衣原体的高发季节,检出阳性率为12.74％.结论 肺炎衣原体是婴幼儿呼吸道感染的重要病原体之一,应用直接免疫荧光法可以直接、快速对其进行诊断.
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2001-2006年苏州地区急性呼吸道感染儿童副流感病毒检出情况
我们运用直接免疫荧光法,对2001-2006年苏州地区儿童急性呼吸道感染的副流感病毒(PIV)进行病原学监测研究,了解近6年来苏州地区儿科急性呼吸道感染中PIV的感染状况.
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苏州地区急性呼吸道感染儿童中腺病毒感染特点
腺病毒(Adenovims,ADV)是儿童急性呼吸道感染重要病毒病原之一,其明确诊断依赖于实验室的病原学检测.我们运用直接免疫荧光法,对2001年1月-2007年12月苏州地区儿童急性呼吸道感染进行ADV病原学监测,了解近7年来苏州地区儿科急性呼吸道感染中ADV的感染状况.同时2006年起对部分确诊ADV患儿进行人类偏肺病毒(hMPV)混合感染的监测,探讨其病原学特点.
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沙眼衣原体细胞培养法在临床诊断中的应用
泌尿生殖道沙眼衣原体感染是近年来在我国发病率迅速上升的性传播疾病之一.它引起的疾病范围广泛,并能导致诸如盆腔炎及异位妊娠等严重并发症.因此,如何正确诊断该病就显得十分必要.实验室诊断方法能够发现有症状或无症状感染者的病原体,国内已开展的有聚合酶链反应(PCR)法、直接免疫荧光法(DFA)、酶免疫法(EIA)和细胞培养等.我们开展沙眼衣原体细胞培养已有十几年,本文结合工作评述这种方法在临床诊断中的应用价值.
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基于人IL-6受体空间结构设计的小分子化合物的生物筛选及其亲和力的初步分析
多项临床研究已证实人IL-6及其受体的异常表达与类风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤的发生密切相关[1].因此对其拮抗剂的研究日益受到人们的关注.目前,国外对人IL-6受体拮抗剂的研究主要集中于单克隆抗体和突变体两个方面[1,2],小分子拮抗剂的研究相对较少.
关键词： M1细胞系 R2细胞系 MTT检测法 直接免疫荧光法 小分子人IL-6受体拮抗剂 -
孕妇沙眼衣原体感染危险因素和筛检策略分析
沙眼衣原体感染是常见的性传播疾病之一.孕妇感染沙眼衣原体危害严重,除引起宫颈炎、尿道炎、子宫内膜炎等疾病外,还会发生早产、胎膜早破等不良妊娠结局,严重影响孕妇和新生儿健康[1,2].我国目前还没有将沙眼衣原体检测列入孕妇产前常规检查项目,因而有必要在进行产前检查的孕妇中开展有重点的筛检.为了解孕妇沙眼衣原体感染的危险因素,为产科医生在工作中对孕妇进行有重点的沙眼衣原体筛检提供参考,我们自2000年1月至2002年12月采用直接免疫荧光法,对825例孕妇进行沙眼衣原体检测,其中67例为阳性,报告如下.
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直接免疫荧光法用于多种呼吸道病毒抗原的快速检测分析
目的 研究分析直接免疫荧光法用于多种呼吸道病毒抗原的快速检测.方法 该院接诊呼吸道感染患者230例,将其分为成人组(105例)和儿童组(125例),均通过直接免疫荧光法对7种病毒抗原进行检测,其中包括流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、腺病毒.结果 230例呼吸道感染的病毒检出呈阳性85例,检出率为37.0％,其中高为呼吸道合胞病毒50例(21.7％),其次为流感病毒A(16例,6.9％)、流感病毒B(14例、6.0％).呼吸道病毒的阳性检出率随着年龄增长而下降,其中儿童组检出阳性55例,阳性率为44.0％,明显高于成人组(30例,28.6％),差异有统计学意义(P＜0.05),且两者的高检出率均为呼吸道合胞病毒,分别为27.2％和15.2％.结论 呼吸道感染与流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、合胞病毒、腺病毒等7种病毒密切相关,直接免疫荧光法可对其进行快速检测,并且灵敏度及特异性均较高,易于标准化,能满足实验室对病毒检测要求,应在临床中推广应用.
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2014～2016年温岭急性呼吸道感染患儿病毒流行特征分析
目的 了解温岭市儿童患者中甲型流感病毒(IVA)、乙型流感病毒(IVB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和副流感病毒1、2、3型(PIV 1、2、3)共7种常见呼吸道病毒的流行特征,为临床诊断、治疗、疫情监控和预防提供病原学依据.方法 收集2014年1月～2016年12月来自温岭市的急性呼吸道感染的1826例患儿鼻咽拭子样本,采用直接免疫荧光法(DFA)对上述7种病毒的抗原进行检测,分析不同病毒的阳性检出率及在不同月份、不同年龄段的分布特点.结果 在检测的1826例患儿标本中,阳性病毒标本496例,总阳性率为27.16％.RSV阳性率高,PIV 2阳性率低,7种病毒不同性别检出阳性率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).病毒检出阳性率全年均有出现,其中1～3月病原检出率均大于40％,2月份高(48.6％),10月份低(21.4％).RSV、PIV 3、ADV及PIV1在0～1岁组和1～3岁组患儿中的阳性检出率明显高于3～6岁组和＞6岁组患儿,各年龄组间比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 RSV和PIV 3是温岭地区儿童呼吸道感染的主要病原体,ARI病毒感染具有明显的季节特征,2月份是温岭儿童呼吸道病毒感染的高发月份,0～3岁儿童是呼吸道病毒的易感人群.
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皮肤组织冰冻切片在直接免疫荧光法中包埋剂的改良应用
目的 用普通胶水代替OCT包埋皮肤组织来制作冰冻切片,不仅降低了成本,而且所制切片与用OCT包埋剂包埋所制切片在制片质量与染色效果上无异.方法 行冰冻切片时,用普通胶水代替OCT对皮肤组织起支托固定作用.结果 用普通胶水包埋制作的冰冻切片,在制片质量及染色效果上均与用OCT包埋剂包埋制片无异.结论 冰冻切片行直接免疫荧光法要求冰冻切片质量优良,且在制片过程中快捷、力求保持抗原的完整性.质量优良的包埋剂在制片过程中可以达到以上要求,但其价格昂贵;用普通胶水代替质量优良的包埋剂,不仅在制片质量及染色效果上与前者无异,且价格便宜,值得推广使用.
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四种呼吸道合胞病毒检测方法的临床应用比较
呼吸道合胞病毒（respiratory sycytial virus ， RSV ）是婴幼儿呼吸道严重感染的重要的病毒病原之一，流行面广、发病率高［1］。目前尚无特异预防措施，RS V 感染及其预后是严重的公共健康问题［2］。临床迫切需要一种快速、敏感的RS V 早期诊断方法，以尽早诊断，限制其流行。本研究选择50例聚合酶链反应（PCR）‐荧光探针和临床确诊的RSV感染患儿鼻咽分泌物，分别用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA ）、直接免疫荧光法（DFA ）、免疫层析金标法（ICA ）、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法（APAAP），检测呼吸道RSV抗原（RSV‐Ag），以期筛选出快速、准确、方便的检测方法。
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检测沙眼衣原体感染的ELISA方法建立
沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,Ct),是人类眼部和生殖道感染的主要致病体.目前,国内对沙眼衣原体感染实验室诊断以直接免疫荧光法和聚合酶链式反应(PCR))为主,这两种方法本身的局限性限制了其在广大基层医院的应用,使其难以成为一种临床常规检查项目.酶免疫检测法以其快速、简单、经济和可同时检测大量标本而受广大基层医院的欢迎.本文建立的方法将会满足国内广大基层医院的需求.
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771例小儿下呼吸道感染的病毒病原检测分析
目的 通过检测和分析下呼吸道感染住院患儿的病毒病原学,掌握,小儿病毒感染的病原学特点.方法 对临床诊断为下呼吸道感染的771例住院患儿下呼吸道分泌物采用直接免疫荧光法进行常见的七种呼吸道病毒抗原检测.结果 771例患儿中共有243例病毒检测阳性,总阳性率占31.52%.呼吸道病毒感染与年龄和季节有明显的相关性.哮喘急性发作患儿病毒检出率高(72.73%);其次为毛细支气管炎,病毒检出率达58.80%,主要病原为呼吸道合胞病毒;第三位是喘息性支气管炎患儿,病毒检出率为35.56%.结论 小儿在不同年龄、不同季节存在不同的病毒感染率.婴幼儿感染率明显高于其他年龄儿童.呼吸道合胞病毒、副流感病毒Ⅲ是小儿下呼吸道感染的主要病毒.病毒感染是喘息的主要原因.
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荧光定量聚合酶链反应方法检测呼吸道标本人偏肺病毒临床研究
目的 建立实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测呼吸道标本人偏肺病毒(HMPV)方法；探讨HMPV感染现状及其临床特征.方法 自行设计引物,建立检测HMPV荧光定量PCR的方法并与直接免疫荧光检测法(DFA)比较,对2009年12月至2010年3月浙江大学附属儿童医院623例下呼吸道感染患儿的临床标本进行检测与分析.结果 (1)建立的RT-PCR以HMPV为模板获得阳性结果,对其他常见呼吸道病毒均阴性；(2) 623例样本中DFA检出HMPV感染10例,检出率1.61％,RT-PCR检出HMPV感染28例,检出率4.49％；(x2=16.05,P＜0.01)；(3)DFA阳性者10份RT-PCR均阳性,595份两者均阴性,18份标本DFA阴性RT-PCR呈阳性,显示很好的相关性(r=0.59,P＜0.01)；(4)哮喘患儿中HMPV检出率为15.4％(4/26),显著高于肺炎组(20/515,3.9％)及气管支气管炎组( 0/36,0％),差异有统计意义(x2=11.22,P=0.011)；(5)HMPV检出率与年龄有关,0～1岁阳性率2.2％(9/404),＞1～3岁组13.1％(16/122),＞3～6岁组3.4％(2/58),＞6岁组2.6％ (1/39),其中＞1～3岁年龄组患儿HMPV检出率明显高于其他组(x2=26.44,P=0.000).结论 选择HMPV N基因保守区域设计了一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HMPV荧光定量RT-PCR方法；荧光定量RT-PCR检测HMPV敏感性明显高于直接免疫荧光法；哮喘患儿中HMPV检出率明显高于肺炎患儿；HMPV感染以＞1～3岁幼儿发生率高.
关键词： 人偏肺病毒 荧光定量RT-PCR 直接免疫荧光法 -
牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法的建立及验证
目的 建立牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法,并进行验证.方法 建立直接免疫荧光法检测牛血清中牛病毒,对细胞接种浓度和血清浓度、病毒接种量、荧光抗体浓度、染色温度及时间进行优化;对优化的方法进行重复性、特异性、灵敏度验证,并与细胞培养法的检测结果进行比较.结果 优化的试验条件为:Vero和BT细胞的接种浓度分别为0.5×105和1.0× 105个/ml,血清浓度为5％,病毒接种量为100～300 CCID50,荧光抗体1∶10稀释,4℃染色12h以上,但不超过24 h.2名实验人员按建立的方对3批牛血清分别进行3次检测,均未检出6种牛病毒;每种病毒仅在相应抗体进行染色时出现荧光;该方法检测6种牛病毒的灵敏度较高.分别采用细胞培养法和直接免疫荧光法检测15批新生牛血清和5批胎牛血清,结果均未检出牛病毒.结论 建立的牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法重复性好,特异性强,灵敏度高,操作简便,与细胞培养法的检测结果无差异,可应用于牛血清中牛病毒的检测.
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直接免疫荧光法检测狂犬病病毒滴度条件的优化及验证
目的 对直接免疫荧光法检测狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的条件进行优化及验证.方法 考察直接免疫荧光法中细胞不同接种方式(分步接种法、一步接种法)、病毒不同培养温度(34、37℃)及培养时间(6、12、24、48、72、96 h)对狂犬病病毒滴度的影响;对优化的方法进行试验间精密性和特异性验证,并与小鼠脑内滴定法的检测结果进行比较.结果 选择一步接种法作为直接免疫荧光法的细胞接种方式;34℃作为病毒培养温度;病毒培养至96 h时进行染色,判定实验结果;病毒培养至第3天时进行荧光灶计数,计算病毒液中病毒的数量.两名操作人员12次检测结果的变异系数仅为0.05％;用该方法检测不同病毒,仅狂犬病病毒组出现特异性荧光,而犬瘟热病毒和犬细小病毒组未观察到荧光灶.采用直接免疫荧光法和小鼠脑内滴定法检测狂犬病病毒样品的病毒滴度结果差异无统计学意义(P＞0.05),具有较好的一致性.结论 优化的直接免疫荧光法精密性良好,特异性强,操作简便,检测周期短,可用于狂犬病病毒滴度的定量检测.
