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应用荧光定量PCR检测细菌性脑膜炎病原体DNA的研究
目的 应用荧光定量PCR检测细菌性脑膜炎病原体DNA,并对脑膜炎奈瑟菌进行基因分群. 方法 提取脑膜炎患者脑脊液和血标本中待检菌DNA,采用荧光定量PCR扩增ctrA、bexA、lytA基因,对ctrA扩增阳性标本及部分流脑菌株进行基因分群. 结果 685份脑脊液标本中19份检出脑膜炎奈瑟菌、8份检出肺炎链球菌、2份检出b型流感嗜血杆菌DNA基因片段;2份血清标本脑膜炎奈瑟菌DNA基因检测均为阳性.对ctrA基因扩增阳性标本进行A、B、C、W135、X及Y分群,有18份为C群,3份为B群;部分健康人群携带的流脑菌株有14份为B群,2份为C群,1份为X群. 结论 荧光定量PCR灵敏性高,检测快速,可用于细菌性脑膜炎病原体的检测、鉴别及对脑膜炎奈瑟菌的分群.
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高危型人类乳头状瘤病毒负荷量对宫颈上皮细胞DNA倍体的影响
目的 探讨高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)感染对宫颈上皮细胞DNA倍体改变的影响. 方法 按要求选取120例既做薄层液基细胞学检查,同时又做高危型HPV-DNA检查的宫颈病变患者的宫颈脱落细胞学标本,采用二代杂交捕获法检测HPV-DNA(代表病毒负荷量),流式细胞术检测宫颈上皮细胞DNA倍体改变(DNA指数DI和S期细胞峰百分比SPF). 结果 HPV-DNA与宫颈上皮细胞DI及SPF存在正相关性(rs分别为0.755和0.845,P＜0.05)；随着宫颈病变的加重,HPV负荷量和上皮细胞DNA倍体的改变趋势存在一致性. 结论 高危型HPV感染可以促进宫颈上皮细胞的增生或癌变.
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恶性疟原虫FCC1/HN株EBA-175因克隆及序列分析
目的将恶性疟原虫FCC1/HN株175 ku的红细胞结合抗原(EBA-175)基因克隆人测序载体,测定其序列,为以后研究其结构与功能奠定基础.方法利用PCR扩增技术,分两个片段从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中,特异扩增EBA-175全基因编码序列.扩增产物经纯化回收后,T-A克隆入测序载体pMD18-T,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,并进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得含有编码EBA-175基因的重组质粒pMD18-T-EBA.用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定.结果 FCC1/HN株EBA-175基因序列与Camp株基本一致,全长4 308bp,编码1 435个氨基酸,含有与Camp株相似的C片段.利用计算机软件对其RII区的F2亚区以及4肽进行抗原表位分析,结果显示这些区域可能含有抗原表位.结论 EBA-175全基因编码序列的测定,为以后其结构与功能的研究奠定基础.
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不同地区草原革蜱基因组DNA多态性研究
目的研究我国不同地区草原革蜱是否有种型差异.方法从新疆阿尔泰、甘肃省武威、平凉地区采集草原革蜱标本,并分别提取它们的DNA,选取9条随机排列碱基序列片段,利用随机扩增多态DNA技术(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD),确定聚合酶链反应(PCR)总体积、反应条件.将扩增产物制备成DNA图谱,比较不同地区草原革蜱基因组DNA的多态性,从分子水平对不同地区草原革蜱进行差异分析.结果3个地区的草原革蜱部分DNA条带相同,但也有完全不同的DNA条带.结论3个地区的草原革蜱DNA存在差异.
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微小按蚊rDNA内转录间隔2区序列差异
目的：比较不同 地株微小按蚊核糖体DNA(rDNA)内转录间隔2区(ITS2)序列差异。方法:通过对PCR扩增rDNA ITS2片段测序，比较其不同地株差异。结果: 对6株微小按蚊测序比较，存在有微小按蚊A和C型。结论:rDNA ITS2 序列差异可用于建立A、C型的分子鉴别方法。
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陡脉冲电场对体外人肝癌细胞SMMC-7721的诱导凋亡作用
为研究陡脉冲电场的诱导凋亡作用,以体外人肝癌细胞SMMC-7721为实验对象,采用Annexin V-FITC/PI双染色并利用流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解片段化.实验发现,陡脉冲电场能有效(P<0.05)地使PS外翻,并且微秒级陡脉冲(μsSPEF)比纳秒级陡脉冲(nsSPEF)更有效(P<0.05);陡脉冲电场能使DNA降解片段化,且nsSPEF比μsSPEF更有效.实验结果表明,陡脉冲电场能有效诱导体外人肝癌细胞凋亡,其机理与陡脉冲电场非热效应及其频谱特性有关.μsSPEF主要作用于细胞膜,而可能通过外源性通路诱导细胞凋亡;nsSPEF主要作用于细胞核和线粒体等胞内细胞器,可能通过内源性通路诱导细胞凋亡.实验结果为陡脉冲电场杀伤肿瘤细胞的机制和参数选择提供了依据.
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禽流感HA基因密码子优化的DNA疫苗构建及其免疫原性的初步研究
目的 构建H5 N1亚型禽流感病毒株密码子优化的血凝素(HA)DNA疫苗并研究其免疫原性.方法 应用MacVector软件分析H5N1亚型禽流感病毒A/Viet Nam1203/04株HA(H5-VN HA)基因序列,对这些序列进行密码子优化处理,人工合成优化后的H5-VN HA基因.将密码子优化H5-VN HA基因与pSW3891质粒连接,并以人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)信号肽取代H5-VNHA信号肽,构建成表达H5-VN HA基因的重组质粒,命名为HA-VN.tPA(即密码子优化的H5-VN HA基因DNA疫苗).以HA-VN.tPA转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中HA蛋白的表达.以HA-VN.tPA对2只新西兰兔进行DNA免疫,用ELISA方法检测分析免疫后兔血清中HA特异性抗体的产生.结果 密码子优化的H5-VN HA基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率高于野生型H5-VN HA基因.蛋白质印迹法分析结果表明,HA-VN.tPA转染293T细胞后,细胞裂解液中检测出HA蛋白的表达.ELISA分析结果表明,以HA-VN.tPA免疫3次后,实验兔体内产生了较高水平的HA特异性抗体(血清中平台期抗体滴度达1:13 500).结论 成功构建了H5N1亚型禽流感病毒密码子优化的HA基因DNA疫苗,该疫苗可引导免疫后宿主体内产生高滴度特异性抗体.
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线粒体多态性检测寡核苷酸芯片的构建
目的 构建用于线粒体DNA(mtDNA)D-环控制区(D-LOOP区)多态性多个位点集成检测的寡核苷酸芯片.方法根据GenBank中人mtDNA D-LOOP区序列设计2组引物[普通引物和N,N'-对羧苄基吲哚三菁(Cy5)标记引物]和55种寡核苷酸探针.将探针固定于醛基修饰载玻片表面,制备mtDNA多态性检测芯片.提取40例健康人外周血标本mtDNA,应用Cy5标记引物不对称PCR扩增mtDNA D-LOOP区片段.取未变性和变性后扩增产物分别与芯片进行杂交,观察二者杂交信号强度差异,并将芯片检测结果与DNA测序结果进行比较.观察等倍稀释的不对称PCR扩增产物的杂交信号强度,检测芯片的灵敏度;将DNA测序结果与探针进行BLAST2比对,找出与PCR扩增产物完全匹配和仅1个碱基不匹配的探针,分析二者在芯片上相应位点杂交信号强度的差异,观察芯片的特异性;以放置6个月后的芯片检测外周血mtDNA,观察杂交信号强度的变化.结果不对称PCR扩增获得的mtDNA D-LOOP区片段(466 bp)与预期表达片段大小一致.不对称PCR扩增产物直接杂交和变性后杂交的信号强度无明显差异,40例健康人外周血标本mtDNA的芯片杂交检测结果均与DNA测序结果完全吻合.灵敏度检测结果显示,杂交信号强度随扩增产物稀释程度的增加而减弱,芯片检测靶分子的灵敏度为0.1ng;与DNA测序结果完全匹配的探针174和仅相差1个碱基"C"的探针174c的杂交信号强度具有明显差异;而保存6个月后的芯片杂交信号强度基本保持不变.结论构建的寡核苷酸芯片可满足对mtDNA D-LOOP区多态性进行多个位点快速通量检测的需要,具有较高的灵敏度和特异性,适用于法医鉴定及线粒体疾病的检测.
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携带肝细胞生长因子基因重组质粒在大鼠体内的组织分布研究
目的 研究携带肝细胞生长因子基因的重组质粒(pUDKH)经肌肉注射给药后在大鼠体内的组织分布及其与大鼠基因组DNA的整合情况.方法 二级Wistar大鼠雌雄各20只,按体重和取样时间的不同随机分为12h、24 h、3 d、7 d、14d、21 d的各实验组(给予pUDKH,2.0mg/kg)和注射后3 d取样的对照组(给予PBS,200μl/只),依次将各组大鼠摘眼球取血后脱臼处死,按脑、心、肺、胸腺、肝、肠系膜淋巴结(MLN)、脾、肾、生殖腺、左腿肌肉、右腿肌肉的顺序取样.经典酚,氯仿抽提法提取各组织总DNA,应用紫外分光光度计测定其浓度和纯度,PCR方法检测其中的β肌动蛋白基因;巢式PCR检测各组织总DNA中pUDKH的分布情况;ApaL I酶切分离pUDKH分布阳性各组织中的pUDKHDNA和基因组DNA,巢式PCR检测pUDKH DNA与基因组DNA的整合情况.结果 各组织总DNA浓度与纯度均符合实验需要,并适于采用PCR或巢式PCR方法进行体内组织分布及基因组DNA整合情况检测.巢式PCR检测显示,在各时间点的右腿肌肉与外周血、注射后3和7 d的肝脏、3和14 d的生殖腺、7 d的胸腺、7和14 d的MLN与左腿肌肉等组织中pUDKH分布均呈阳性,而在各时间点的脑、心、肺、脾、肾等组织中pUDKH分布均呈阴性.pUDKH分布阳性的各组织中均未检测到pUDKH DNA与基因组DNA的整合.结论 pUDKH经肌肉注射给药后,在各时间点大鼠体内各组织中呈现不同的分布谱.在pUDKH分布阳性的各组织中,pUDKH DNA与基因组DNA发生随机整合的概率较低.
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反相高效液相色谱法和16S rRNA 序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的比较研究
目的 比较反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和 16S rRNA序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的异同.方法 将<伯杰细菌鉴定手册>中载入的 49 种分枝杆菌模式株接种于改良罗氏培养基上,置于适温度下孵育.挑取生长良好且无污染的培养物,一部分经皂化和酸化提取分枝菌酸并衍生后,采用反相高效液相色谱法进行分枝菌酸指纹图谱构建;另一部分经裂解和 PCR 扩增,获得 DNA,纯化后,采用核酸分析仪进行 16S rRNA 序列测定.结果 49 种分枝杆菌模式株中,采用 RP-HPLC 分析时,单簇峰的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和胃分枝杆菌,双簇峰的爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌,三簇峰的南非分枝杆菌和母牛分枝杆菌共 7 种因各组内相对保留时间和相对峰高比值相近而难以进行鉴别;采用 16S rRNA 序列分析法分析时,产鼻疽分枝杆菌和塞内加尔分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、龟亚分枝杆菌和龟脓分枝杆菌以及结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌)共 12 种因各组内基因序列相似性百分比为 100% 而难以进行鉴别.通过两种分型鉴别方法的比较,可见除结核分枝杆菌和牛分枝杆菌外,两种分型方法相互补充,可将 49 种分枝杆菌模式株中的 47 种进行明确鉴别.结论 分枝菌酸 RP-HPLC 和 16S rRNA 序列分析法均为分枝杆菌的分型鉴定提供了准确和有效的技术方法.两种方法相互借鉴能准确地将大多数分枝杆菌鉴定到种.
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PCV2-ORF2去信号肽基因的克隆与原核表达及对小鼠免疫效力的评价
目的 通过基因工程的方法表达猪圆环病毒2型的ORF2蛋白,并对表达蛋白进行小鼠免疫效力评价,为猪圆环病毒病疫苗的研制提供技术支持.方法 根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物.从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的死亡仔猪病料中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出ORF2去信号肽基因,将该基因克隆至原核表达载体pET32α,获得重组质粒,经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为目的基因,插入的位置、大小和阅读框均正确,成功构建了重组质粒pet32α-ORF2,阳性重组质粒转化大肠杆菌Blgold(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达的佳条件,表达产物经纯化后,以每只小鼠0.2mg免疫5周龄的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况.结果 纯化的重组蛋白能使小鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7d开始产生抗体,第28d抗体水平达到高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性.结论 表达目的蛋白能在小鼠体内产生特异性抗体,为进一步研究猪圆环病毒亚单位疫苗奠定了基础.
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基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用
目的 构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体.方法 通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列；通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体.为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌.提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上.发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC-MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯.结果 构建了1个酵母整合载体,具有如下特点:①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序.酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上.以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC-MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到(91.33±7.57) mg/L朱栾倍半萜当量.结论 初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体.
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脑胶质瘤SHG-44细胞MGMT基因甲基化状态及其与细胞对烷化剂药物耐药性关系的研究
目的 探讨人脑胶质瘤SHG.44细胞O(6)-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子甲基化状态与其蛋白表达以及细胞对烷化剂药物耐药性的相关性.方法取处于对数生长期的人脑胶质瘤SHG-44和U251细胞,分别加入5-氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)培养6 d后收集细胞,同时以未加5-Aza-CdR的正常培养细胞作为对照.提取细胞基因组DNA,采用甲基化特异性PCR(MSP)检测MGMT基因的甲基化状态,并利用蛋白质印迹方法检测MGMT蛋白的表达.将收集的细胞分为3组,分别加入浓度为125、100、75、50、25、15、10μg/ml的尼莫司汀(ACNU)和50、25、15、10、5、2.5、1μg/ml的替莫唑胺(TMZ)以及等量的完全培养液(阴性对照),采用噻唑蓝(MTT)法分别检测细胞对烷化剂药物的敏感性,以细胞存活50%时所对应的药物浓度(IC50值)作为衡量细胞对药物敏感性的指标,实验重复3次.结果正常培养的SHG-44细胞MGMT基因启动子呈甲基化状态,MGMT蛋白表达缺失,对ACNU和TMZ的IC50值分别为30、11μg/ml,表现为对烷化剂药物敏感;用5一Aza-CdR处理后,SHG-44细胞MGMT基因启动子成功脱甲基化,MGMT蛋白恢复表达,其对ACNU和TMZ的IC50值分别升高了2.5和3.1倍(均P<0.05),对烷化剂药物的敏感性发生逆转.而正常培养和5-Aza-CAR处理的U251细胞MGMT基因启动子均呈未甲基化状态,都能表达MGMT蛋白,并且均表现为对ACNU和TMZ烷化剂药物耐药.结论 MGMT基因甲基化状态能稳定地反映细胞诱导MGMT 蛋白表达的能力,并有可能成为预测肿瘤组织对烷化剂化疗药物敏感性的分子标记.
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重组溶瘤腺病毒Ad-CD80-TPE-GM对Hep2细胞移植瘤的杀伤效应
目的 研究自行构建的重组溶瘤腺病毒Ad-CD80-TPE-GM对裸鼠Hep2细胞移植瘤的杀伤效应.方法 裸鼠皮下接种Hep2细胞悬液建立荷人喉癌动物模型.将裸鼠分为单次治疗组和连续治疗(每天1次、连续5 d)组,每组据治疗药物不同再分为PBS组、携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的复制缺陷型5型重组腺病毒(Ad-GFP)组、Ad-CD80-TPE-GM组,以PBS、Ad-GFP组为对照组.单次治疗组于治疗后4 d取外周血并剥离肿瘤,分别用有限稀释法、BCA蛋白质定量试剂盒和流式细胞术检测肿瘤组织中的病毒感染滴度、总蛋白浓度和CD80表达阳性率,ELISA法检测血清和肿瘤组织中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CS)表达水平,并计算肿瘤组织中病毒感染滴度量和总蛋白中GM-CSF的表达量.连续治疗组于首次给药后观察裸鼠肿瘤体积的变化,待对照组肿瘤直径>1 cm,或肿瘤表面出现明显溃疡时剥离肿瘤,计算Ad-CD80-TPE-GM组分别与2个对照组相比的相对肿瘤增殖率和抑瘤率.结果 单次治疗组中,Ad-CDS0-TPE-GM组肿瘤组织中病毒感染滴度量(IU/tumor)为1.13×106(1.40×105～7.25×107),明显高于Ad-GFP组[1.17×102(7.80×101～2.40×102),P=0.01],而PBS组未检测到病毒;GM-CSF表达量(pg/mg)为397.32±179.67,明显高于PBS组(4.02 4±0.93,P<0.01)和Ad-GFP组(6.92±2.79,P<0.01):CD80表达阳性率为31.6%±9.0%,而PBS和Ad-GFP组均基本不表达(均P<0.001).连续治疗组中,Ad-CD80-TPE-GM组与PBS和Ad-GFP组相比,相对肿瘤增殖率分别为31.8%(P<0.05)、25.9%(P<0.01);抑瘤率分别为73.4%、77.9%(均P<0.001).结论 Ad-CD80-TPE-GM能在端粒酶阳性的人喉癌Hep2细胞移植瘤组织内大量复制并有效表达目的 基因,具有明显的抗肿瘤效应.
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H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究
目的 研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗.方法 根据马 A 型流感病毒 A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列,经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段,并将该片段克隆到核酸疫苗载体pJW4303中,构建带有天然信号肽的H3HA核酸疫苗,命名为H3HA/XJ3-08-wt;进一步对HA基因进行修饰,以人组织纤维蛋白酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,tPA)取代H3HA天然信号肽,命名为H3HA/XJ3-08-tPA,或切除部分HA的基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域,命名为H3HA/XJ3-08-dTM.用这3种重组质粒分别转染293T细胞,蛋白表达经蛋白质印迹检测得到确认.采用电转录法免疫新西兰白兔.ELISA方法检测免疫后兔血清中抗H3HA抗体滴度,血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测保护性抗体水平.结果 3种H3HA核酸疫苗均可在293T细胞中高效表达,并能够在新西兰白兔体内诱导产生特异性抗H3HA抗体,HI检测到不同水平的保护性抗体.其中以H3HA/XJ3-08-tPA的免疫原性强.结论 新构建的H3N8型马流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性,为此类疫苗的进一步研发奠定了基础.
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羊种布鲁菌05/43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建
目的 构建羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA 文库.方法 培养的绵羊肺泡巨噬细胞经羊种布鲁菌 05/43 株侵染后,以 Trizol 试剂提取其总 RNA,用 cDNA 文库构建试剂盒构建巨噬细胞的 cDNA 文库.随机选取 cDNA 文库中的 18 个克隆进行表达序列标签 (EST) 序列测定,测序结果 用 BlastX 和 BlastN 软件在 GenBank 蛋白质库和核酸库中进行序列同源性比对.结果 构建的 cDNA 文库的库容量为1.192×106,重组率为 95.65%.18 个 EST 测序,12 个与 CD 抗原基因、细胞因子基因、蛋白酶基因等已知功能的基因序列相关,6 个为未知功能基因的 EST 序列.结论 成功构建了羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的 cDNA 文库,这将有助于阐明该菌株的致病机制.
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细胞人基因组DNA 对荧光实时定量PCR检测细胞培养液中HBV DNA 的影响
目的 研究细胞人基因组DNA 对荧光实时定量PCR(FQ-PCR)检测细胞培养上清液中HBV DNA 含量的可能干扰影响,提高细胞培养上清液中HBV DNA 定量检测的准确性.方法 取HBV DNA 阳性血清,以DMEM 培养基分别配制出HBV DNA 拷贝数为5×107/ml(高拷贝组)、5×105/ml(中拷贝组)、5×103/ml(低拷贝组)的不同样本组;各组内再分5 个亚组,分别加入终浓度为0(对照组)、12.5、25、50、100 μg/ml 的细胞人基因组DNA(提取自人肝癌细胞系HepG2).以不含HBV DNA 阳性血清的DMEM 培养基加入上述浓度细胞人基因组DNA 为空白组.采用基于TaqMan 技术的FQ-PCR 检测各组样本的HBV DNA 拷贝数并绘制HBV DNA 定量曲线.每组均重复检测10 次.根据HBV DNA 定量检测结果确定受干扰样本和未受干扰样本,分别计算其定量曲线线性期斜率和平均扩增效率.结果 高拷贝组中加入不同浓度细胞人基因组DNA 的各个亚组与相应对照组比较,HBV DNA 拷贝数差异均无统计学意义.中拷贝组中加入细胞人基因组DNA 浓度为50和100 μg/ml 的2个亚组,其HBV DNA 拷贝数结果明显高于相应对照组,增高可达50～100倍,且重复性差.低拷贝组中只有加入细胞人基因组DNA 浓度为12.5μg/ml的亚组可通过提高基线值取得与相应对照组接近的定量检测结果,而其他亚组HBV DNA 定量曲线指数扩增期斜率明显异常,无法确定其定量检测结果.空白组各亚组均未观察到明显的HBV DNA 指数扩增期.受干扰样本线性期斜率(-1.01±0.06)和平均扩增效率(90.0%±2.1%)与对照组样本(分别为-1.52±0.06,97.0%±0.4%)比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 细胞人基因组DNA 对应用FQ-PCR 技术进行的HBV DNA 定量检测可产生非特异性干扰,尤其在HBVDNA 拷贝水平较低时.在细胞培养上清液作HBV DNA 定量检测时应尽量去除细胞人基因组DNA.
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生物样本库中血液样本microRNA和DNA的检测方法学探讨
目的：探讨建立南京医科大学第一附属医院生物样本库中血液生物样本 microRNA的检测方法以及血凝块中 DNA的鉴定方法。方法随机选取本院生物样本库自2012–2014年存储的胃癌、肝癌血浆标本进行 microRNA的提取，后经 Q-PCR验证 miR-21和 miR-387的表达情况以及将对应的血凝块样本进行全血样本 DNA的提取，通过全自动核酸分析仪鉴定提取的 DNA的完整性。结果 Q-PCR结果表明，冻存血浆在保存了1、2、3年后都能检测到相关的 microRNA的表达，同时血凝块中提取的 DNA，经全自动核酸分析仪鉴定，DNA完整性也较好。结论该方法能够初步验证我院生物样本库中冻存的血样标本中的 RNA和 DNA的保存质量，血样质量基本能满足后续科研实验的需求。本研究中的血样标本质量鉴定的方法切实、可行，能较准确地反映生物样本库中血样本的质量，为今后我院组织样本的质量控制体系的建立奠定基础。
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儿童肾透明细胞癌的病理及其癌细胞DNA定量分析
目的探讨儿童肾透明细胞癌病理形态特点及癌细胞DNA含量和倍体的关系.方法对4例儿童肾透明细胞癌组织进行病理形态观察,并用图象分析仪对癌细胞DNA进行定量分析.结果 4例癌细胞胞质透明呈透明细胞且有乳头状结构,其中2例乳头状结构超过50%,3例均见钙化小体及明显出血坏死;DNA检测:DNA平均指数1.31,呈2倍体型,高2倍体型或亚4倍体型.结论儿童肾透明细胞癌病理形态特点为癌细胞胞质透明,以乳头状结构为主,可见钙化小体,常伴出血、坏死,癌周肾小球、肾小管基本正常为特征.癌细胞DNA呈2倍体或高2倍体型或亚4倍体型.
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非小细胞肺癌中Axin与β-连环素异常表达的关系
目的探讨Axin(axis inhibition protein)和β-连环素(β-catenin)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达、β-catenin突变及它们与各临床病理因素的关系.方法采用免疫组织化学(SP法)和直接测序方法对100例NSCLC标本中Axin和β-catenin的表达和β-catenin基因突变进行了检测.结果β-catenin的细胞膜表达降低率为80.0%,细胞核表达率为26.0%.高、中分化和低分化NSCLC中,β-catenin的表达降低率分别为70.0%(35/50)和90.0%(45/50),差异有统计学意义(P＝0.012).有淋巴结转移和无淋巴结转移NSCLC中β-catenin表达降低率分别为87.3%(48/55)和71.1%(32/45),差异有统计学意义(P＝0.044).Axin的阳性表达率为48.0%,高、中分化和低分化NSCLC中,Axin的阳性率分别为60.0%(30/50)和36.0%(18/50),差异有统计学意义(P＝0.016).在β-catenin核表达阳性的病例中,Axin阳性表达率为15.4%(4/26),低于β-catenin核表达阴性的病例(59.5%,44/74)(P<0.001).100例肺癌新鲜标本中未发现β-catenin基因第三外显子突变.结论β-catenin的膜表达降低与NSCLC的低分化和淋巴结转移相关,Axin的表达与NSCLC的低分化和β-catenin的细胞核蓄积负相关.β-catenin基因第三外显子的突变可能不是NSCLC中β-catenin蛋白异常表达的主要原因.
