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肝细胞癌8号染色体微卫星变异及其与临床病理特征的关系
目的探讨肝细胞癌(HCC)微卫星变异的特点及其与临床病理表现的相关性.方法采用毛细管电泳DNA分析系统,对56例HCC中8号染色体上10个微卫星的杂合子丢失(LOH)、微卫星不稳定性(MSI)和等位基因失衡(AI)3种变异特征进行检测.结果 56例HCC在8号染色体上10个基因位点发生LOH的总频率为66.1% (37/56),LOH以D8S261高为53.5%(23/43),其次为D8S1721(52.5%)和D8S1771(52.5%).D8S277基因位点,血清HBsAg阳性患者的LOH频率显著高于HBsAg阴性者(P<0.01),D8S261、D8S298和D8S1733基因位点,血清HBsAg阴性患者的LOH频率显著高于HBsAg阳性者(P<0.01);D8S298和D8S1771基因位点,直径＞3 cm肿瘤的LOH率明显高于≤3 cm组(P<0.05和P<0.01);在D8S1721基因位点,无包膜或包膜不完整的肿瘤的LOH显著高于包膜完整的肿瘤(P<0.01);D8S298和D8S1771基因位点,肝内转移者的LOH明显高于无肝内转移者(P<0.05).MSI的频率为12.5%(7/56),AI的频率为19.6%(11/56).结论HCC在8号染色体上存在广泛的微卫星变异,其中LOH方式在HCC的发生和发展过程中起重要作用,MSI的作用次之.特定基因位点的LOH与临床和病理学参数有一定的相关性.
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肝细胞癌肿瘤抑制基因的杂合性缺失和微卫星不稳定性研究
目的了解肿瘤抑制基因(TSG)杂合性缺失(LOH)与微卫星不稳定性(MSI)在肝细胞癌发生机制中的作用,并探讨其临床病理学意义.方法采用显微组织切割基础上的DNA直接测序法,从92例手术切除肝细胞癌中筛选出36例信息性肝细胞癌进行6种TSG(APC、DCC、MCC、OGG 1、p53和RB1)的LOH检测,对其中15例肝细胞癌进行13个多态性微卫星位点的LOH和MSI检测,并与临床病理学参数的相关性进行统计学分析.结果 TSG的LOH总发生率为41.7%(15/36),仅MCC基因未出现LOH.15例肝细胞癌中有9例(60%)发生微卫星LOH,占检测微卫星的46.2%(6/13),但无1例肝细胞癌出现MSI.若将 APC、OGG1和DCC基因LOH作为Ⅰ型(n=7),将p53 和 RB1基因LOH作为Ⅱ型(n=8)进行统计学处理,则两组肝细胞癌的平均瘤体直径分别为(2.9 ± 1.7) cm 和(7.2 ± 3.4) cm (P<0.01),两组患者术后平均生存期分别为 (72.0 ± 38.6)个月和(51.0± 30.4)个月(P<0.05).肝细胞癌基因变异型与患者的年龄、性别、血清甲胎蛋白水平、HBsAg阳性率、合并肝炎/肝硬化、肝细胞癌分化程度和组织学类型之间无明显相关性.结论在肝细胞癌发生的多阶段演进与多基因变异过程中,LOH路径所起的作用要比MSI路径更大.Ⅰ型基因变异(APC、OGG1和DCC)主要在肝细胞癌早期阶段起作用,Ⅱ型基因变异(p53和RB1)主要在晚期阶段起作用,而MCC基因在肝细胞癌发生中起的作用较小.
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胃黏膜线粒体DNA不稳定与白细胞介素8活性的关系
目的评价胃黏膜线粒体DNA不稳定(mtMSI)与组织白细胞介素8(IL-8)活性的关系.方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法检测mtMSI;组织IL-8含量测定采用ELISA方法.结果 30例胃癌检出mtMSI 11 例(36.7%),15例肠化胃黏膜组织中有2例为mtMSI,10例异型增生黏膜组织有2例为mtMSI,10例萎缩性胃炎黏膜组织有1例检出mtMSI.胃黏膜细胞IL-8水平在mtMSI阳性组[(76.8±3.8) pg/mg]显著高于mtMSI阴性组[(48.3±3.6)pg/mg,P<0.05].结论胃黏膜细胞mtMSI可能与IL-8释放有关,并参与了胃癌的发生.
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结直肠癌前病变与结直肠腺癌免疫表型及基因突变分析
目的 分析结直肠癌前病变与结直肠腺癌免疫表型及基因突变特征,比较两种结直肠癌前病变癌变机制的差异.方法 收集2006年1月至2012年6月间诊断的53例结直肠锯齿状病变,包括30例增生性息肉、20例广基锯齿状腺瘤(SSA)及3例混合性息肉；同时选取45例传统腺瘤、50例结直肠腺癌.采用免疫组织化学EnVision法检测30例增生性息肉、20例SSA、3例混合性息肉以及45例传统腺瘤DNA错配修复(MMR)蛋白MLH1、MSH2、MSH6及甲基转移酶MGMT蛋白的表达情况；采用Sanger直接测序法检测10例SSA、10例传统腺瘤、l例混合性息肉及50例结直肠腺癌中KRAS、BRAF及PIK3CA基因的突变情况.结果 (1)MLH1蛋白在增生性息肉中仅3例阴性(10％),在SSA、传统腺瘤中均呈阳性.MSH2、MSH6及MGMT蛋白在增生性息肉及SSA中的阴性率明显高于传统腺瘤,差异均具有统计学意义(P＜O.01).(2)结直肠SSA和传统腺瘤中KRAS基因突变比例为5/10,5/10；1例混合性息肉存在KRAS基因突变.(3)结直肠腺癌中,KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变率分别为48％ (24/50)、6％ (3/50)及4％(2/50).结论 结直肠锯齿状病变与传统腺瘤在免疫表型及基因突变等方面存在着一定的差异,MMR与MGMT在“锯齿状肿瘤”癌变通路中起着重要的作用.KRAS基因突变是结直肠腺癌癌变过程中发生较早的重要遗传学改变.
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即时定量PCR-Sanger测序与TaqMan探针法检测结直肠癌KRAS、BRAF基因突变的对比分析
目的 对比分析即时定量PCR-Sanger测序与TaqMan探针法检测KRAS、BRAF基因突变的应用价值；探讨结直肠癌KRAS和BRAF基因突变与临床及病理的相关关系.方法 收集2008至2012年344例结直肠癌标本,经4％中性甲醛液固定、石蜡包埋组织后切片、刮取富集肿瘤细胞后提取DNA,应用即时定量PCR-Sanger测序与TaqMan探针两种方法检测分析KRAS、BRAF基因的突变阳性率、突变类型及其与临床病理特征和生存时间的相关性等.结果 即时定量PCR-Sanger测序与TaqMan探针法检出KRAS基因突变率分别为39.8％ (137/344)和38.7％(133/344),BRAF基因突变阳性率分别为4.7％ (16/344)和4.1％(14/344),两种方法结果差异无统计学意义(P＞0.05).KRAS基因突变阳性率女性高于男性；BRAF基因突变阳性率结肠高于直肠,Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期,印戒细胞癌高于黏液癌,非特殊类型腺癌低,Ⅲ级高于Ⅱ级,差异均有统计学意义(P＜0.05).两种方法总符合率为98.8％(Kappa值0.976).BRAF基因突变型与KRAS基因突变型的患者生存时间差异有统计学意义(P =0.039),BRAF基因突变型与BRAF/KRAS野生型的患者生存时间差异无统计学意义(P=0.058).结论 (1)与Sanger测序法相比,TaqMan探针法具有操作简便、耗时短、效率高、重复性好、费用低以及不需特别仪器设备等优点,具有更高的临床应用价值；(2)结直肠癌中KRAS基因突变率与性别具有相关性,而BRAF基因突变率与原发部位、临床分期、组织学类型及组织学分级具有相关性；(3) BRAF基因突变是结直肠癌患者的独立预后因素.
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165例胃肠道间质瘤中c-kit和PDGFRA基因突变的检测和临床诊断意义
目的探讨在中国较大样本的胃肠道间质瘤(GIST)中c-kit基因和PDGFRA基因的突变状况,为进一步的生物靶向治疗提供依据.方法用免疫组织化学EnVision法、聚合酶链反应(PCR)扩增和直接测序的方法,检测165例GIST c-kit基因9、11、13和17号外显子突变以及PDGFRA基因12和18号外显子突变.结果病理组织学诊断的165例GIST病例中有155例(94%)免疫组织化学显示CD117阳性.在CD117阳性的GIST中,c-kit基因总突变率为76.1%(118/155):分别为11号外显子67.1%(104/155)、9号外显子7.1%(11/155)、13号外显子1.3%(2/155)和17号外显子0.6%(1/155).绝大多数为杂合性突变,少数为纯合性突变.11号外显子的突变位点多集中在5'端的经典热点,其次为3'端的框内串联重复.后者主要以核分裂象少的老年女性胃部病例多见.9号外显子突变代表一类发生在年轻男性体积较大的小肠病变.13号外显子发现一处新的突变点L641P.PDGFRA基因突变见于50%(5/10)CD117阴性病例,均为18号外显子突变,包括常见的D842V点突变和一个框内843～846处IMHD缺失伴有S847T的新突变.PDGFRA基因突变多见于发生在后腹膜/网膜的具有高度侵袭危险性的病例.结论中国GIST病例大多数存在c-kit基因和PDGFRA基因的突变,且在基因突变类型和肿瘤原发部位间有非随机的联系.除了发现几个新的突变形式外,国人的GIST似乎和西方国家有些不同的突变特点.靶向治疗需要基因突变分型的启示和指导.
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DNA倍体分析及Ki-67检测对肾实质小肿瘤性质和意义的探讨
目的 探讨肾实质小肿瘤的性质及其生物学行为，为临床进一步治疗和预后判断提供病理学依据。方法 应用流式细胞术和免疫组织化学方法，对48个直径≤3 cm的小肿瘤和39个直径＞3 cm的大肾癌的DNA倍体形式及Ki-67增殖状态进行了比较研究。结果 48个小肿瘤中，6个腺瘤均为二倍体，Ki-67增殖指数(PR)均＜1%。42个透明、颗粒细胞型小肿瘤异倍体出现率为16.7%，与39例大肾癌的33.3%差异无统计学意义；42个小肿瘤总Ki-67 PR均数明显低于大肾癌。DNA倍体形式与分级、分期、组织类型相关。Ki-67 PR与分级相关。结论 小肿瘤中既有腺瘤也有腺癌，肿瘤大小不能作为区分它们的标准。DNA倍体及Ki-67 PR可作为肾实质肿瘤生物学行为和预后判断的重要指标。
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典型遗传性非息肉病性结直肠癌家系临床病理及分子遗传学分析
目的了解国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)的临床病理及分子遗传学特征.方法用微解剖、微卫星不稳定性分析、免疫组织化学及直接DNA测序方法,检测4例HNPCC患者的肿瘤组织微卫星不稳定性状态、错配修复基因hMSH2及hMLH1蛋白水平的表达变化以及生殖细胞突变.结果4例先证者5个肿瘤组织均表现为高度微卫星不稳定性,3例表现为hMSH2蛋白表达异常,1例表现为hMLH1蛋白表达异常.检测出3个生殖细胞病理性突变.结论中国人典型HNPCC病例中错配修复基因突变率较高.高度微卫星不稳定性、错配修复基因hMSH2及hMLH1蛋白表达异常与错配修复基因生殖细胞突变密切相关.微卫星不稳定性和错配修复基因蛋白分析可作为DNA测序前的筛选手段.
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结直肠癌患者 KRAS、NRAS 及 BRAF基因突变检测分析
目的：研究结直肠癌KRAS、NRAS及BRAF基因突变情况，分析KRAS、NRAS及BRAF基因突变在结直肠癌中的分布。方法收集2014年4月至8月于广东省人民医院首诊的200例结直肠患者的肿瘤组织，运用PCR＋直接测序的方法检测KRAS基因第2、3和4号外显子，NRAS基因第2、3和4号外显子及BRAF基因第15号外显子。结果 KRAS、NRAS、BRAF基因突变率分别为44％（88／200）、2％（4／200）和5％（10／200）。 KRAS基因突变主要集中在第2号外显子的第12和13位密码子，分别占总突变的64．8％（57／88）和12．5％（11／88），KRAS基因第3号外显子的突变主要集中在第59和61位密码子，KRAS基因第4号外显子的突变主要集中在第117和146位密码子。结论结直肠癌中KRAS基因第2号外显子突变率较高，增加检测KRAS基因位点和联合检测NRAS、BRAF基因有助于筛查出有可能从靶向治疗中获益的结直肠癌患者。
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基于二代测序技术的循环肿瘤DNA检测在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药肺癌患者耐药基因检测中的应用
目的 通过对晚期肺癌初治及耐药患者的血浆循环肿瘤DNA( ctDNA)标本应用高通量二代测序(NGS)技术进行基因检测分析来评估基于ctDNA的NGS技术的临床应用价值.方法共纳入381例2017年3月至2018年5月期间在中国医学科学院肿瘤医院就诊的肺部恶性肿瘤患者的血液标本,采用基于杂交捕获法的NGS技术,检测患者血浆ctDNA中与肺癌相关的10个驱动基因的变异状态.通过对比分析39例血浆-组织/细胞学配对标本,分析基于NGS方法检测ctDNA中驱动基因变异的灵敏度及特异度.另外分析了一代及三代表皮生长因子受体( EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向耐药患者的ctDNA检测基因变异的耐药机制.结果 该研究中39例血液标本有抽血2周内的组织/细胞学配对标本,均来自非小细胞肺癌患者,其中21例为女性,18例男性;年龄小者29岁,大者82岁,平均年龄59岁.血浆与组织NGS检测一致率为84. 62%(33/39);39例配对标本中有34例为Ⅲ～Ⅳ期的晚期肺癌患者,晚期病例血浆与组织NGS检测一致率为88. 24%(30/34).未接受过靶向治疗的基线检测患者231例,其中10例为肺鳞癌,未检出驱动基因突变;221例肺腺癌中EGFR基因突变为常见(32. 58%,72/221),其次为ALK基因变异(7. 69%,17/221)及KRAS基因突变(5. 81%,13/221).接受过一代TKI治疗并已耐药的病例133例,其中39. 10%(52/133)的患者检出T790M突变;另外有3. 01%(4/133)的患者检出耐药原因为旁路激活.在能够检测出原敏感突变的耐药患者中,约53. 06%(52/98)的患者能检测出T790M突变.接受过三代TKI治疗并已耐药的病例17例,其中4例患者检出耐药原因为出现与原T790M突变位点顺式的C797S错义突变.结论虽然基于血浆ctDNA的二代测序检测存在一定的假阴性率,但其与组织基因突变检测的一致性较高. EGFR-TKI耐药肺癌患者中约有近一半可通过血浆ctDNA二代测序检测找到耐药原因,为基于二代测序的液体活检技术在临床的应用提供了直接证据.
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结直肠粘膜隐窝异常病灶K-ras、APC基因突变的研究
目的 分析隐窝异常病灶（aberrant crypt foci，ACF）的基因水平变化特点及其作为结直肠癌早期形态变化的分子依据，探讨ACF与腺瘤之间的关系。方法 经微解剖分离提取15例正常粘膜腺体、34例ACF、15例腺瘤和35例结直肠癌组织进行DNA测序，检测K-ras第12、13、61密码子和APC第15外显子“突变密集区”的突变。结果 正常粘膜无K-ras和APC基因突变，ACF、腺瘤和癌组织K-ras突变率分别为17.6%（6/34）、13.3%（2/15）和14.3%（5/35），3者突变率相近。4例ACF、腺瘤和癌组织的突变位于12密码子的第2碱基（GGT→GAT），2例ACF突变发生在13密码子的第2碱基（GGC→GAC）。ACF中K-ras的突变特点与同来源的癌组织保持一致，即患者年龄较大，大体以隆起型为主，所有组织未发现有61密码子的突变。癌和腺瘤APC基因突变率相近，癌为22.9%（8/35），腺瘤为26.7%（4/15）明显高于ACF的2.9%（1/34，P<0.05)，癌组织APC与患者的年龄、肿瘤位置、大体类型、组织分化程度无关。结论 ACF可能是结直肠癌早期的形态改变，ACF的形态学变化、部分基因的改变均有别于腺瘤，提示：（1）ACF有可能是腺瘤前的形态改变；（2） 结直肠癌的发生可能存在“正常上皮→ACF→癌变”这一途径。
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应用基因表达谱芯片筛选IgA肾病患者肾穿组织相关基因
已有学者发现在IgA肾病的发生发展中,遗传因素发挥着重要作用[1].基因芯片技术已被广泛应用于多种疾病相关基因的筛选[2].为全面了解IgA肾病相关基因的表达情况,我们应用基因芯片检测IgA肾病和正常肾组织基因的差异表达,寻找差异表达基因与IgA肾病之间可能的内在联系.为进一步探讨IgA肾病的发病机制及临床诊断提供理论依据.
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小鼠肿瘤线粒体DNA突变研究
目的探讨线粒体DNA(mtDNA)突变与肿瘤发生发展的关系.方法采用聚合酶链反应(PCR)技术结合限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术了解Lewis肺癌、LA795、Hca-F、Hca-P、CT26、SCC891共6个小鼠肿瘤细胞系mtDNA的基因变异.结果经PCR-RFLP分析发现,这些肿瘤细胞系mtDNA编码区的tRNAIle+Glu+Met及ND1基因核酸序列,在27个限制性内切酶酶切位点上均无差异.而在非编码区(D-loop),与对照小鼠相比,Hca-F出现了 Hinf I的新酶切位点; 用PCR-SSCP分析方法对这些肿瘤细胞系mtDNA的D-loop的5′及3′端作进一步分析,在6个肿瘤细胞系中,有4个在mtDNA非编码区上存在着突变.结论 D-loop是肿瘤细胞mtDNA突变的高发区,mtDNA突变在肿瘤的发生发展中可能起作用.
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荧光原位杂交检测精子细胞膨胀成功的改良方法
近些年,在研究精子非整倍体与流产、畸形、不育及环境化学物质对人类生殖功能等影响时,荧光原位杂交(FISH)方法因适合大量间期核精子的检测得到广泛应用.因为精细胞变形成蝌蚪状时,核组蛋白被精蛋白替代,DNA以一种特殊方式被压缩、凝聚,正常情况下很难实现杂交,因此DNA去凝聚是精子杂交前期处理的关键步骤.
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抗病毒治疗对慢性乙型肝炎肝组织HBV DNA及病理的影响
目的 探讨抗病毒治疗对慢乙肝肝组织HBV DNA及病理的影响.方法 75例HBeAg阳性的慢乙肝患者分别接受拉米夫定-干扰素序贯治疗24例、拉米夫定35例或干扰素α2b16例,抗病毒治疗,检测治疗前48周患者肝组织HBV DNA及炎症指数(HAI).结果 抗病毒治疗48周,三组患者血、肝组织HBV DNA及HAI均值明显下降(P＜0.05),序贯治疗组HBeAg血清转换率(38.1%)稍高于其他两组(P=0.1352).HBeAg血清转化患者(17例)和HBV DNA阴转患者(21例)肝组织HBVDNA基线值明显低于其他患者(P＜0.05).结论 抗病毒治疗可以抑制肝组织HBV的复制,改善肝细胞的炎症坏死;肝组织HBV DNA水平低者抗病毒疗效好.序贯治疗可能获得较高的HBeAg血清转化率.
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血清HBV标志物阴性肾炎肾组织中HBV-DNA的原位杂交检测
目的 对血清HBV标志物阴性肾炎患者肾组织进行HBV-DNA的检测,为临床诊疗提供理论依据.方法 应用原位杂交(ISH)技术检测37份血清HBVAg阴性和18份血清HBVAg阳性的肾炎患者肾活检石蜡包埋组织切片中的HBV-DNA.结果 在血清HBVAg阳性的18例标本中HBV-DNA的检出率为88.9%(16/18),血清HBVAg阴性37例中检测出HBV-DNA 5例(13.5%).原位杂交显示两组检出的HBV-DNA均以肾小管上皮细胞质分布为主,与组织中HBVAg阳性颗粒的分布基本一致.结论 血清HBVAg阴性的HBV相关性肾炎临床上并非少见,应给予足够的关注.HBV-DNA在肾组织中的检出,表明HBV在HBV相关性肾炎的发病机理中有着重要作用.
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乙型肝炎肝硬化患者病毒基因型与滤泡辅助性T淋巴细胞及白细胞介素-21的关系和意义
目的 探讨乙型肝炎肝硬化患者不同HBV基因型与外周血滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh)及白细胞介素-21 (IL-21)的关系和意义.方法 59例人白细胞抗原(HLA)-A2阳性的乙型肝炎肝硬化患者作HBV基因型检测,比较B、C基因型感染者之间Tfh、IL-21的差别,并探讨其意义.结果 59例乙型肝炎肝硬化患者中,C基因型36例(61.02％),B基因型22例(37.29％),B、C混合型1例(1.69％),C基因型外周血Tfh水平(2.89％±1.44％),低于B基因型(4.65％±1.37％),t=3.01,P＜0.01,IL-21水平(14.62±2.12 ng/L),低于B基因型(32.27±11.25 ng/L),=4.12,P＜0.01,HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)水平(0.17％±0.02％),低于B基因型(0.37％±0.03％),t=3.12,P＜0.01,HBV DNA水平(6.95±0.75log10拷贝/ml),高于B基因型(5.02 ±0.36log10拷贝/ml),=3.03,P＜0.01.结论 与乙型肝炎肝硬化B基因型感染者相比,C基因型感染者的外周血Tfh水平较低,引起IL-21和HBV特异性CTL水平降低,导致HBV DNA水平较高.
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围产期母血与脐血乙肝标志物及DNA载量关联性研究
目的 研究围产期母血与新生儿脐血乙肝病毒标志物及核酸DNA载量的关联性,探索脐血乙肝五项模式与HBV-DNA载量之间关系,用于评估新生儿宫内感染乙肝病毒的风险性.方法 在知情同意的原则下选择住院分娩产妇612例作为乙肝研究对象,根据产妇乙肝五项不同模式共分为五组,均采用ELISA法检测产妇血清、新生儿脐血HBV标志物,同时用实时荧光定量PCR检测产妇血清和脐血新鲜血清HBV-DNA载量,探讨围产期母血与脐血间HBV-DNA载量的关联性.结果 年龄在18 ～ 44岁围产期妇女,A组传染性强的乙肝“大三阳”或1,3阳性者149例,产妇血清和脐血HBV-DNA阳性率分别为99.33％和32.21％;B组260例乙肝“小三阳”,产妇血清和脐血HBV-DNA阳性率分别为20.00％和3.08％;C组乙肝1、5阳性者58例,产妇血清和脐血HBV-DNA阳性率分别为65.52％和12.07％;D组乙肝病毒第5阳性者59例,产妇血清和脐血HBV-DNA阳性率分别为13.56％和1.69％;E组对照组:乙肝五项全阴性86例,产妇血清和脐血HBV-DNA阳性率分别为1.16％和0.A组与B组间脐血HBV-DNA阳性率,差别有统计学意义(x2=54.09,P＜0.01).乙肝产妇所生新生儿脐血HBeAg阳性率高达82.55％,脐血HBsAg的阳性率为32.89％,A组即HBsAg HBeAg阳性的产妇经胎盘传播乙肝病毒的概率(32.21％)明显高于B组“小三阳”产妇的脐血HBV-DNA感染率(3.02％),A组是B组的10.67倍;传染性强的A组母血是脐血HBV-DNA平均载量的6345倍.结论 ①新生儿宫内感染乙肝病毒阳性率与围产期母体内HBV-DNA载量呈正相关.②乙肝产妇生产的新生儿脐血HBeAg阳性率是HBsAg的2.51倍,要研制复合型乙型肝炎人免疫球蛋白:即增加高效价HBeAb成分可结合HBeAg,原有的HBsAb也可结合相应的HBsAg,增强阻断乙肝病毒垂直传播作用;③我国应加强乙肝知识的宣教工作,完善围产保健制度.
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甲型流感病毒分支状M2e多肽疫苗不同途径免疫效果的研究
目的 比较甲型流感病毒分支状多肽疫苗佳免疫途径.方法 通过化学方法合成(M2e) 4-tuftsin,与Al(OH)3佐剂混合,肌注途径免疫小鼠;与JY佐剂混合,滴鼻免疫小鼠,观察两种途径的免疫效果.结果 肌内注射免疫途径诱导产生抗体的能力高于滴鼻免疫,(M2e) 4-tuftsin滴鼻免疫诱导细胞免疫的能力强,(M2e)4-tuftsin通过肌肉注射和滴鼻免疫途径均对小鼠有一定的保护效果,但肌注免疫效果好.结论 分支状M2e多肽肌内注射比滴鼻免疫保护效果好.
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HPV16 L1/E6-E7基因嵌和DNA疫苗质粒构建及其在CHO细胞表达的初步研究
目的构建HPV 16 L1-E6、HPV16 L1-E7预防、治疗性DNA疫苗质粒.方法运用PCR大引物定点诱变法逐个突变E6、E7基因与转化作用有关的位点,PCR产物连接至pGEMT-Easy质粒,测序鉴定突变基因正确后,分别均与L1基因共同连接并至真核表达载体pVAX1,得到真核表达质粒1MpVAX1-L1E6,2MpVAX1-L1E6,1MpVAX1-L1E7,2MpVAX1-L1E7,3MpVAX1-L1E7.运用磷酸钙法将所获得的质粒转染CHO细胞,以HPV-16 L1特异性单克隆抗体进行转染细胞中L1蛋白表达的ELISA和免疫组化的检测.结果 ELISA检测显示转染各种L1-E6、L1-E7融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P/N值均>2.1;免疫组化检测在胞质胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积.结论所构建的L1-E6、L1-E7融合蛋白表达质粒可在体外表达L1蛋白,为今后进行DNA疫苗动物实验和临床试验研究做好准备.
