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基于二代测序技术的循环肿瘤DNA检测在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药肺癌患者耐药基因检测中的应用
目的 通过对晚期肺癌初治及耐药患者的血浆循环肿瘤DNA( ctDNA)标本应用高通量二代测序(NGS)技术进行基因检测分析来评估基于ctDNA的NGS技术的临床应用价值.方法共纳入381例2017年3月至2018年5月期间在中国医学科学院肿瘤医院就诊的肺部恶性肿瘤患者的血液标本,采用基于杂交捕获法的NGS技术,检测患者血浆ctDNA中与肺癌相关的10个驱动基因的变异状态.通过对比分析39例血浆-组织/细胞学配对标本,分析基于NGS方法检测ctDNA中驱动基因变异的灵敏度及特异度.另外分析了一代及三代表皮生长因子受体( EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向耐药患者的ctDNA检测基因变异的耐药机制.结果 该研究中39例血液标本有抽血2周内的组织/细胞学配对标本,均来自非小细胞肺癌患者,其中21例为女性,18例男性;年龄小者29岁,大者82岁,平均年龄59岁.血浆与组织NGS检测一致率为84. 62%(33/39);39例配对标本中有34例为Ⅲ～Ⅳ期的晚期肺癌患者,晚期病例血浆与组织NGS检测一致率为88. 24%(30/34).未接受过靶向治疗的基线检测患者231例,其中10例为肺鳞癌,未检出驱动基因突变;221例肺腺癌中EGFR基因突变为常见(32. 58%,72/221),其次为ALK基因变异(7. 69%,17/221)及KRAS基因突变(5. 81%,13/221).接受过一代TKI治疗并已耐药的病例133例,其中39. 10%(52/133)的患者检出T790M突变;另外有3. 01%(4/133)的患者检出耐药原因为旁路激活.在能够检测出原敏感突变的耐药患者中,约53. 06%(52/98)的患者能检测出T790M突变.接受过三代TKI治疗并已耐药的病例17例,其中4例患者检出耐药原因为出现与原T790M突变位点顺式的C797S错义突变.结论虽然基于血浆ctDNA的二代测序检测存在一定的假阴性率,但其与组织基因突变检测的一致性较高. EGFR-TKI耐药肺癌患者中约有近一半可通过血浆ctDNA二代测序检测找到耐药原因,为基于二代测序的液体活检技术在临床的应用提供了直接证据.
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基于 Ion Proton 半导体测序平台的无创产前基因检测技术的可行性研究
目的：探讨基于Ion Proton半导体测序平台的无创基因检测技术应用于产前诊断的可行性。方法选取2013年1至12月在郑州大学第三附属医院产检的孕龄12～32周的1000例单胎妊娠孕妇为研究对象，采用Ion Proton半导体测序平台的无创产前基因检测技术对其外周血游离胎儿DNA进行分析，其中72例行羊膜腔穿刺技术进行确诊。结果1000份标本中，染色体非整倍体高风险18例（1．8％），其中7例21-三体，4例18-三体，2例13-三体，4例性染色体异常及1例15-三体。72例孕妇经羊水穿刺确诊，胎儿21-三体、18-三体和13-三体的无创产前检出率及正确率均为100％，误诊率均为0；性染色体异常的检出率为2／2，假阳性率为1／3，1例15-三体高风险孕妇经核型确诊为假阳性。经55例核型分析和493例随访研究，该方法检测21-三体、18-三体和13-三体的特异度均为100％。采用Ion PITM芯片每次可检测12～15份标本，上机测序时间为1．5 h，整个无创检测流程为1～1．5 d。结论利用基于Ion Proton高通量测序平台的无创产前基因检测技术可快速、准确地检测出胎儿染色体非整倍体异常，该平台检测速度快、无须积累大样本量进行上机，为将来临床规范化独立开展无创性基因检测筛查胎儿染色体非整倍体异常疾病奠定了基础。
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乙型肝炎病毒耐药基因测序检测性能验证
目的：探讨在ISO15189以及美国病理学家协会（ CAP）实验室认可体系下，建立使用一代测序（Sanger测序法）进行乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因检测的项目性能验证标准。方法方法学建立。2012年8至12月收集复旦大学附属华山医院肝炎门诊及住院患者中临床表现HBV耐药患者25例。从测定下限、精密度、正确性、分析特异性、可报告范围/参考范围等方面进行性能评估。测序质量的验证基于整体测序图谱的荧光信号值、性噪比、测序峰图、QV值等评估参数进行。结果可检测出正常背景下10％～20％的突变；有较好的精密度；正确性100％；未发现有明显干扰及交叉污染。结论测序方法的性能验证要结合实际应用。特别是测序分析的质量评估需要针对不同的检测目的以及检测对象建立相关标准并适当进行调整以符合临床需要。本试验方法检测乙型肝炎耐药基因可应用于临床检测。（中华检验医学杂志，2014，37：776-779）
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乙型肝炎病毒准种的研究进展
乙型肝炎病毒（HBV）以准种的形式存在，准种是乙型肝炎（HB）发病机制和耐药研究的重要基础。 HBV准种的研究对HB疾病进展的评估、HBV耐药的预测、治疗方案的调整及个体化治疗的实施具有重要意义。本文对HBV准种的研究进展做一综述。（中华检验医学杂志，2016，39：646－649）
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测序技术在缺失型脊髓性肌萎缩症基因诊断中的应用
目的：探索将测序技术应用于缺失型脊髓性肌萎缩症（SMA）基因诊断的可行性。方法设计2对引物，PCR扩增SMA致病基因运动神经元生存基因（SMN1）与其同源基因SMN2之间5个不同碱基所在区域，第1对引物正向扩增SMN1内含子6至7间长度为501 bp片段，包含4个不同碱基位点g.31957、32006、32154及32269；第2对引物反向扩增SMN1外显子8区域，长度为189 bp，包含1个不同碱基位点g.32734。根据测序图谱区分SMA患者与携带者和（或）正常人。将此方法应用于7个临床疑似SMA家系的诊断，并与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）法进行比较。结果6例测序图谱显示SMN内含子6至外显子8之间5个SMN1和SMN2差异位点g.31957、32006、32154、32269及32734均只有SMN2特有碱基a、T、g、g和A，患儿父母（携带者）相同位点显示为a/g、T/C、g/a、g/a和A/G。说明患者缺失SMN1基因，缺失范围包括内含子6至外显子8；携带者则既有SMN1基因，又有SMN2基因，与患者能区分开。1例检测结果为a、T、g、g和A/G，说明其缺失范围不含外显子8。测序法与PCR-RFLP方法结果一致。结论测序技术在缺失型SMA患者的基因诊断上优于经典PCR-RFLP法，更方便快捷，结果更明确，建议替代常用的PCR-RFLP法。
