首页 > 文献资料
-
探讨疑难生物检材法医DNA检验的现状与进展
法医DNA检验对于疑难生物检材非常重要,有利于案件侦破,而常见的疑难生物检材主要包括微量检材、降解生物检材及混合生物检材三个方面.本文对降解生物检材、微量检材及混合性检材的影响因素、来源及适用范围简要阐述,并提出相对应解决措施.
-
无创产前检测在胎儿性染色体检测中的应用价值
目的:研究利用母体的外周血中游离的DNA来进行基因测序的技术,对于胎儿的性染色体检测的应用价值.方法:选取自2015年5月至2017年5月我市的妊娠期妇女3000例,作为本次实验的研究对象,年龄在17-45岁之间.所有参加本次实验的患者均在完全知情的情况下,自愿进行无创产前检测.抽取孕妇10毫升的外周静脉血,提取其中游离的胎儿的DNA,进行基因测序.通过所测数据与数据库相比较而判断胎儿性染色体是否异常,若出现异常的情况,应该给予孕妇及其家人相关的遗传知识宣教,在其完全知情的前提下对其进行羊水穿刺,来进行核型分析.结果:在本次实验过程中,无创产前检测的结果显示有22位孕妇出现性染色体异常的情况,其中chrX-(Y)者3例;chrX-者12例;chrX+(Y)者6例;chrY+者1例.经过沟通后,有18例患者接受羊水穿刺.其中13例患者的羊水穿刺结果与NIPT(无创产前基因检测)的结果保持一致.这就说明NIPT(无创产前基因检测)的预测准确率在59.1％左右.结论:NIPT技术可以用来检测胎儿的性染色体是否存在异常,但是其准确性不高,不可作为唯一检测标准.
-
不同剂量结核病DNA疫苗的电转染免疫原性研究
目的 研究不同剂量结核病DNA疫苗电转染后的免疫原性.方法 40只BALB/c小鼠通过随机数字表法分为8组,每组5只.其中4组分别用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μg结核分枝杆菌Ag85A DNA肌内注射免疫小鼠;另4组用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μgAg85ADNA肌内注射加电转染免疫小鼠.每2周免疫1次,共3次.后1次免疫后2周杀死小鼠.用ELISA方法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)水平;用流式细胞术检测小鼠外周血单个核细胞(PBMC)分泌IFN-γ的辅助性T细胞(helper T cell,Th)1细胞百分比、分泌IL-4的Th2细胞百分比,以及Th1与Th2的细胞比值.用SAS 9.2软件处理数据,实验数据以“-x±s”表示,对有关数据进行两因素析因设计的方差分析,两两比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 免疫结束后2周,小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平,50 μg[(646.05±342.53) pg/ml]和100 μgAg85ADNA肌内注射组[(738.61±372.68) pg/ml]显著高于生理盐水组[(1.73±3.88)pg/ml](f值分别为4.065、4.647,P值均＜0.05)和10 μg Ag85A DNA组[(87.83±120.82)pg/ml](t值分别为3.513、4.094,P值均＜0.05);10 μg Ag85A DNA电转染组[(357.06±105.18) pg/ml]显著高于生理盐水组(t=2.247,P＜0.05),高于100 μg Ag85ADNA电转染组[(86.08±135.73) pg/ml],但差异无统计学意义(t=1.706,P＞0.05);50 μg Ag85ADNA电转染组[(648.60±439.41)pg/ml]显著高于生理盐水组(t=4.081,P＜0.05)和100 μg Ag85A DNA电转染组(t=3.539,P＜0.05).与直接肌内注射组IFN-γ水平[(87.83±120.82) pg/ml]比较,10 μg Ag85A DNA电转染组增高3倍[(357.06 pg/ml)/(87.83 pg/ml)]; 50 μg Ag85A DNA肌内注射组[(646.05±342.53) pg/ml]与电转染组[(648.60±439.41)pg/ml]比较,差异无统计学意义(t=-0.016,P＞0.05);100 μg Ag85A DNA电转染组[(86.08±135.73)pg/ml]较肌内注射组[(738.61±372.68) pg/ml]降低88.35％(t=4.105,P＜0.05).小鼠PBMC分泌IFN-γ的Th1细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA:(1.39±0.84)％;50 μg Ag85A DNA:(1.55±0.33)％;100 μg Ag85A DNA:(2.13±0.47)％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA:(1.42±0.47)％; 50 μg Ag85A DNA:(1.88±0.51)％; 100 μg Ag85ADNA:(1.43±0.68)％]均高于生理盐水组[(0.65±0.31)％](t值分别为2.002、2.431、4.015、2.084、3.332和2.105,P值均＜0.05),但不同剂量Ag85A DNA电转染组与肌内注射组之间差异均无统计学意义(t值分别为0.081、0.901和-1.91,P值均＞0.05).小鼠PBMC分泌IL-4的Th2细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA:(1.42±1.18)％; 50 μg Ag85A DNA:(1.14±0.78)％; 100 μg Ag85A DNA:(1.24±0.76)％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA:(1.19±1.09)％; 50 μg Ag85A DNA:(2.06±0.96)％;100 μgAg85A DNA:(1.47±0.65)％]均显著低于生理盐水电转染组[(4.14±2.55)％](t值分别为-3.392、-3.738、-3.616、-3.676、-2.599和-3.325,P值均＜0.05),但不同剂量DNA肌内注射组与DNA电转染组之间差异无统计学意义(t值分别为0.284、-1.139和-0.292,P值均＞0.05).结论 DNA电转染免疫可以增强低剂量DNA疫苗的免疫应答,使用少量的DNA疫苗就可以产生较好的免疫效果.
-
实时荧光PCR检测儿童肺结核粪便中Mtb-DNA的效果评价
目的 应用实时荧光PCR快速检测肺结核患儿粪便中Mtb-DNA,并初步评估其临床效果.方法 收集肺结核住院儿童粪便标本76份,应用实时荧光PCR检测Mtb-DNA,检测结果与20例其他呼吸系统疾病患儿的炎便实时荧光PCR检测Mtb-DNA、76例炎便抗酸杆菌涂片检查以及41例患儿痰标本的涂片和(或)培养、实时荧光PCR检测结果进行比较.结果 粪便实时荧光PCR检测敏感度达到23.68％(18/76),特异度为100.00％(20/20),肺结核患儿粪便PCR阳性率[23.68％(18/76)]明显高于涂片阳性率[6.58％(5/76)],41例患儿中痰涂片和(或)培养阳性例数(15例)和痰PCR检测阳性例数(18例)高于粪便PCR检测阳性例数(11例).结论 实时荧光PCR检测儿童粪便Mtb-DNA,是一种特异度高、比较敏感、非侵入性且相对安全的儿童肺结核快速诊断方法.
-
深圳市耐多药结核分枝杆菌流行株耐药基因序列分析
目的 了解深圳市耐多药结核分枝杆菌(multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis,MDR-TB)的分子流行病学特征.方法 参照WHO/IUATLD标准,使用L-J药敏培养基,采用l%比例法药敏试验筛选出敏感株和异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)双耐药临床分离株,通过DNA测序检测深圳地区153株敏感株与132株MDR-TB的INH耐药基因katG、inh A、oxyR-ahpC基因间区域及RFP耐药基因rpoB碱基排列顺序,运用DNASTAR和blastn进行序列分析.结果 153株敏感株突变率为27.5%(42/153),132株MDR-TB突变率为98.5% (130/132),其中katG基因突变率为73.5%(97/132),68.9%(91/132)为kat G315位突变;inh A基因突变率为18.2%(24/132),11.4%(15/132)为启动子区域突变,未发现inh A94特异突变株;ahpC基因突变率为16.7%(22/132),10.6%(14/132)为启动子区域突变;rpoB基因81 bp核心区域突变率为93.2%(123/132).结论 katG315、inhA启动子区域、ahpC启动子区域以及rpoB81bp核心区域突变为深圳地区耐多药结核分枝杆菌主要突变类型,与其他国家和地区差异无统计学意义;但深圳地区未见inh A94突变株.
-
DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究
目的 研究结核分枝杆菌DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的效果.方法 用结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射60只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为6组,感染后第3 d开始,分别用生理盐水(A组)、pVAX1载体(B组)、利福平(C组)、HSP65DNA疫苗(D组)、Ag85A DNA疫苗(E组)、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗(F组)治疗60 d,DNA疫苗每隔15 d肌肉注射1次,共5次.治疗结束后3周,分别取肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数.结果 治疗结束后3周,与对照组比较,D组、E组和F组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,2/3区域可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰,细胞分布均匀.与A组相比,D组、E组和F组肺脏菌落数分别减少了0.34、0.50和0.26 logs;脾脏菌落数依次减少了0.37、0.46和0.28 logs(P＜0.05,P＜0.01).结论 Ag85A DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病效果优于HSP65 DNA和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗.
-
痰与支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌FQ-PCR检测对涂阴肺结核诊断价值的比较
目的 探讨呼吸道痰标本和支气管肺泡灌洗液(BALF) Mtb-DNA检测对涂阴肺结核的诊断价值.方法 选择福州肺科医院2009年7月至2009年12月胸部影像学疑为肺结核但至少3份痰涂片镜检Mtb阴性,或胸部影像学无法排除肺结核需进一步检查的患者共51例,所有入选患者初诊根据临床症状、体征、胸部影像学结果分为疑似结核组(24例)和待排结核组(27例).均行抗结核抗体、红细胞沉降率检测及PPD试验,应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定性及定量检测两组患者痰和BALF中的Mtb-DNA.结果 疑似结核组和待排结核组各有22例和2例确诊肺结核,确诊的24例中痰FQ-PCR敏感度为45.8％(11/24),特异度为96.3％(26/27),Youden指数42.1％；BALF FQ-PCR的敏感度为75.0％(18/24),特异度96.3％(26/27),Youden指数71.3％.结论 FQ-PCR检测BALF Mtb较痰更为敏感,对影像学疑诊但痰涂片阴性的结核患者有很高的实用价值,尤其适用于无痰的患者.
-
HBVM阳性肺结核患者HBVDNA检测的临床意义
目的 探讨HBVDNA(乙型肝炎病毒DNA)、HBVM(乙型肝炎病毒标志物)阳性肺结核患者抗结核治疗时对肝损害的影响.方法 肺结核患者HBVM阳性且HBVDNA阳性为观察组A,HBVM阳性、HBVDNA阴性者为观察组B,HBVM阴性为对照组C,观察各组抗结核药物肝损害发生率、停药率及A组HBVDNA水平与肝损害发生率、停药率有无相关.结果 各组肝损害发生率两两比较均有显著性差异(P＜0.01);A组停药率与其他两组均有显著性差异(P＜0.01),B组与C组无显著性差异(P＞0.05);A组HBVDNA水平与肝损害发生率、停药率无相关(P＞0.05).结论 HBVM阳性尤其HBVDNA阳性肺结核化疗应重视,HBVDNA阴性者可短程化疗,HBVDNA阳性者都应慎行短程化疗.
-
结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究
目的 评价Mtb复苏因子DNA疫苗(resuscitation-promoting factor DNA,Rpf-DNA)对Mtb感染宿主的免疫保护作用.方法 构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗,180只BALB/c 小鼠(4周龄)分为6组,每组30只,分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫,H37Rv标准株气溶胶感染.检测血清复苏因子(Rpf)抗体、IFN-γ; RpfD、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验；检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2;对肺组织进行病理学检测和细菌负荷(CFU)计数.结果 (1)疫苗免疫组血清Rpf D、Rpf E抗体水平；Rpf D组0.32±0.1,Rpf E组0.39±0.1,BCG组0.02±0.01,空质粒组0.01±0.0,生理盐水组0.09±0.04,空白对照组0.03±0.01,RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D:45.6,43.2,45.1,45.7；Rpf E:51.6,53.6,51.0,52.2;P值均＜0.01.血清IFN-γ:Rpf D组(43.9±24.8)pg/ml,Rpf E组(45.9±21.0)pg/ml,BCG组(21.0±11.0)pg/ml,空质粒组(7.9±4.9) pg/ml,生理盐水组(4.7±2.1) pg/ml,空白对照组(5.8±4.7)pg/ml,RpfD、RpfE质粒组与BCG组比较差异有统计学意义(F值分别为Rpf D:10.2；Rpf E:12.4;P值均＜0.05),与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D:15.6,17.8,17.3;Rpf E:17.5,21.1,20.7;P值均＜0.01.(2)淋巴细胞增殖实验CCK-8:Rpf D组176.0±4.2,Rpf E组183.0±4.3,BCG组101.0±1.1,空质粒组100.0±6.8,生理盐水组104.0±8.4,空白对照组116.0±2.2,RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:9.5,10.1,10.0,9.0;Rpf E:11.2,12.9,11.7,10.3;P值均＜0.05.细胞杀伤实验:Rpf D组32.0±3.2,Rpf E组30.0±4.2,BCG组16.0±5.9,空质粒组3.3±1.5,生理盐水组6.7±0.5,空白对照组7.3±3.5,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:8.8,14.5,13.7,11.9;Rpf E:8.1,12.5,11.6,11.1;P值均＜0.05.(3) Rpf D、Rpf E蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测:IL-2:Rpf D组9.5±2.4,RpfE组9.2±1.2,BCG组2.4±2.1,空质粒组1.2±0.3,生理盐水组1.8±1.0,空白对照组1.5±0.7,Rpf D、Rpf E质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:12.5,14.6,13.5,13.9；Rpf E:12.0,13.6,13.1,13.2;P值均＜0.05.IFN-γ:Rpf D组22.2±5.7,Rpf E组28.7± 14.4,BCG组16.1±10.1,空质粒组9.8±1.6,生理盐水组13.2±2.1,空白对照组15.7±2.9,RpffD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:7.8,12.6,8.7,8.3;Rpf E:11.3,16.4,14.7,14.2;P值均＜0.05.结论 实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫,有希望成为结核病候选疫苗之一.
-
结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733c DNA疫苗的构建及免疫学特性研究
目的 构建结核分枝杆菌(Mtb)休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性.方法 利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c.将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达.采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组.pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次.BCG组采用皮下免疫一次.各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值.初次免疫8周后,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 H-etrazolium,inner salt](四氮唑蓝盐化合物)法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平.流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞所占比率；LDH法检测CTL(cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞)活性.结果 成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c.间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白.pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡；脾淋巴细胞增殖指数(2.00±0.36)高于BCG组(1.1±0.06)(t=3.096,P＜0.05)；特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30)SFC/ 106高于生理盐水组(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P＜0.05)；然而脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞所占比率[分别为(18.15±2.30)％、(7.68±1.34)％]、CTL杀伤活性[(29.52±1.96)％]都与生理盐水组相当[(16.43±2.02)％ (t=0.571,P＞0.05)、(7.32±0.42)％(t=0.234,P＞0.05)、(25.28±2.51)％(t=0.726,P＞0.05)].结论 成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义.
-
重组表达萤火虫荧光素酶结核分枝杆菌的构建及其用于低抑菌浓度测定的研究
目的 构建萤火虫荧光素酶(FFLuc)重组表达的结核分枝杆菌菌株,利用其建立抗结核药物低抑菌浓度(MIC)检测方法,并应用该方法测定目前主要的抗结核药物的MIC.方法 (1)以质粒pMV306hsp+FFLuc为模板,PCR扩增FFLuc基因.构建重组表达质粒pMV361+FFLuc,电转化至结核分枝杆菌标准株H37Rv中,应用小动物活体成像系统鉴定FFLuc表达.比较结核分枝杆菌与重组结核分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线.(2)检测不同浓度的异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、莫西沙星(Mfx)、链霉素(Sm)、左氧氟沙星(Lfx)、利奈唑胺(Lzd)作用不同时间的表达荧光量变化,考察在不同药物作用下FFLuc表达的稳定性,建立以FFLuc标记结核分枝杆菌为基础的测定抗结核药物MIC的方法并测定INH、RFP、EMB、Mfx、Sm、Lfx、Lzd等7种药物的MIC.结果 (1)pMV361+ FFLuc重组表达载体构建的稳定表达FFLuc的结核分枝杆菌菌株的菌量与荧光表达量(相对荧光强度)呈线性关系[x2=0.994,lg(y)=0.905×lg(x)+0.832].(2)应用新方法检测的7种药物的MIC与微孔培养显色(MABA)法MIC测定结果基本相同.第4天时荧光检测INH、RFP、Mfx、EMB、Sm、Lfx和Lzd的MIC值分别是0.05、0.05、0.09375、4、0.8、0.15、0.15μg/ml;与MABA法检测结果相比,结果在相差1～2倍MIC值的可接受范围内.结论 建立了FFLuc重组表达的结核分枝杆菌菌株检测抗结核药物MIC的方法与MABA法相比,所需时间更短,第4天即可检测结果.
-
卡介菌CpG DNA复合佐剂-02系统(BC-C02)有效性与安全性评价
目的 对卡介菌(BCG) CpG DNA复合佐剂-02系统(BC-C02)的有效性及安全性进行评价,为其应用提供研究基础.方法 以流式细胞法检测经CpG DNA与细胞体外共培养后B细胞内TLR-9,巨噬细胞内IL-12、TLR-9表达,以酶联免疫斑点法检测人外周血单个核细胞(PBMC)经CpG DNA刺激后IL-12的分泌.单纯H1N1抗原低、中、高三个剂量组及三个剂量抗原添加CpG DNA后免疫小鼠,每组20只动物,免疫后测定其抗体效价及H1N1病毒感染后死亡率.经Mtb感染后豚鼠,以Ag85B+ BC-C02疫苗低、中、高组与BC-C02及生理盐水(NS)进行免疫治疗,每组10只豚鼠,观察动物脏器结核病变指数.同时分别检测CpG DNA注射小鼠后IgE产生和复合佐剂BC-C02注射豚鼠后全身过敏毒性.结果 BC-C02中的生物佐剂可刺激B细胞增殖[佐剂组CD19+％为41％,培养基对照组(NCS)组为27％；t=-4.40,P＜0.05]；促进B细胞内TLR-9表达(佐剂组CD19+ TLR-9+％为2.8％,NCS组为1.1％;t=-5.92,P＜0.05)；上调巨噬细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达(佐剂组F4/80+I-A/I-E+％为82％,NCS组为31％;t=-4.32,P＜0.05)；可促进巨噬细胞内TLR-9和IL-12的分泌(佐剂组F4/80+ I-A/I-E+TLR-9+ IL-12+％为2.1％,NCS组为0.1％；t=4.80 P＜0.05).BC-C02中的生物佐剂作为H1N1疫苗佐剂,在检测时间内(5、7、14、28 d),PBS组4个时间点血凝抑制(HI)抗体滴度均＜10; H1N1低剂量组滴度＜中剂量组滴度＜高剂量组滴度,抗原复合CpG组均高于单纯抗原组,且佐剂可促进抗原特异性IgG2a的提高.H1N1保护力实验中,PBS组、H1N1低剂量组、H1N1低剂量+CpG DNA组、H1N1高剂量组、H1N1高剂量+CpG DNA组存活率分别为30％、50％、90％、100％、100％,显示佐剂可提高40％动物存活率.Mtb潜伏感染动物经疫苗治疗后,对照组动物100％病变,疫苗组完全转阴的动物达到30％,而且病变指数＜30的动物达到60％～70％.佐剂注射小鼠后IgE抗体与NS无区别,豚鼠过敏毒性试验显示佐剂不会引起动物全身过敏反应.结论 BC-C02既能诱导细胞免疫反应,也能诱导体液免疫反应,并能提高疫苗保护效力,可作为一种新型疫苗用佐利的候选佐剂.
-
荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中TbDNA对涂阴肺结核的诊断价值
目的 探讨纤支镜肺泡灌洗液中结核分枝杆菌DNA在涂阴肺结核诊断中的价值.方法 应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术对300例涂阴肺结核,178例菌阳肺结核及119例肺炎或肺癌患者的纤支镜肺泡灌洗液标本进行结核分枝杆菌DNA检测.结果 3种病因肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA阳性检出率分别为:74.3%(223/300)、94.9%(169/178)、17.6%(21/119).结论 荧光定量聚合酶链反应检测肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA,用于肺结核诊断可提高肺结核诊断的敏感性和准确性,明显优于痰抗酸染色,亦较痰结核菌培养诊断灵敏、快速,可作为肺结核诊断较可靠指标.
-
中试生产的结核DNA疫苗免疫效能研究
目的 以300L发酵罐中试规模生产的冻干Mtb Ag85A质粒DNA疫苗为基础免疫小鼠,对该疫苗的免疫效能进行研究.方法 将4～6周龄的BALB/c小鼠20只通过数字表法随机分为2组,一组免疫MtbAg85A质粒DNA疫苗(结核DNA疫苗免疫组),另一组免疫PBS作为阴性对照(PBS对照组)；于免疫前采血,肌内注射免疫3次.在第3次免疫后3周摘眼球处死小鼠,收集血清,进行血清特异性抗体检测和细胞因子(IFN-γ、IL-4)检测；同时对每只小鼠取脾细胞进行特异性γ干扰素(IFN-γ)分泌检测和脾细胞CD4+、CD8+百分率检测.结果 (1)免疫前后免疫组与对照组抗体水平吸光度A值均小于0.2.(2)结核DNA疫苗免疫组血清细胞因子IL-4水平[(146.2±34.3) pg/ml]低于PBS对照组[(177.7±28.1)pg/ml],差异有统计学意义(t=2.244,P=0.038),而IFN-γ水平[(129.6±159.0) pg/ml]虽然高于PBS对照组[(76.5±21.5) pg/ml],但差异无统计学意义(t=-1.047,P=0.309).(3)酶联免疫斑点检测结果表明结核DNA疫苗免疫组脾细胞特异性IFN-γ分泌水平(分泌IFN-γ细胞个数)(103.60±112.14)高于PBS对照组(5.78±5.83),差异有统计学意义(t=36.538,P=0.018).(4)结核DNA疫苗免疫组CD4+细胞百分率均值(21.57％)高于PBS对照组(12.17％),差异有统计学意义(t=3.043,P=0.038)；CD8+细胞百分率均值(13.70％)与PBS对照组(10.57％)相比,差异无统计学意义(t=0.847,P=0.445).结论 Mtb Ag85A质粒DNA疫苗主要刺激机体Th1型细胞免疫,而对诱导机体产生Th2型细胞免疫应答没有显著的促进作用.
-
DNA指纹技术检测耐多药结核分枝杆菌的应用研究
目的 应用结核分枝杆菌DNA指纹技术,了解耐多药结核分枝杆菌的基因型状况并探讨耐多药结核病的分子流行病学.方法 以结核分枝杆菌插入序列IS6110序列为模板,设计一对特异外向引物,建立一种结核分枝杆菌DNA指纹技术方法,对临床标本中分离的220株耐多药结核分枝杆菌进行DNA指纹基因分析.同时对实验数据进行聚类分析,进行耐多药结核病分子流行病学研究.结果 根据结核分枝杆菌DNA指纹图谱分析,220株耐多药结核分枝杆菌均产生特征DNA指纹图谱,DNA指纹图谱变异很大.每一菌株DNA指纹的拷贝数介于3至18之间.其中大部分菌株,即205株(93.2%)包含6～13个拷贝,平均为11个带.这205株DNA指纹图谱中,162株为特异的,提示它们在流行病学上是独立的.有58株(26.4%)指纹图谱组成了15个簇,每簇2～8株,它们的IDNA指纹图谱相同,可能代表了近期的传播.尤其是在此DNA指纹图谱中,其中分子量为200 bp扩增带频率大,在220株耐多药结核分枝杆菌均出现.结论 结核杆菌DNA指纹技术检测可应用耐多药结核分枝杆菌DNA指纹图谱分型,并可用于耐多药结核病分子流行病学调查.
-
结核分枝杆菌Ag85复合物相关疫苗研究进展
目前全球TB疫情呈上升趋势,而惟一使用的结核病疫苗-BCG的保护效力大不如前,因此新型结核病疫苗的开发迫在眉睫.利用Ag85复合物在Mtb感染中具有明显保护性效应为基础而研制的疫苗受到广泛关注.笔者对Ag85复合物相关亚单位疫苗、重组BCG和基因疫苗研究取得的成果进行综述,结果表明少数Ag85复合物相关疫苗的保护作用超过BCG,某些新疫苗作为初种疫苗给予新生儿、儿童和青少年接种是安全、有效的；作为增强剂给予成人接种,可以提高机体免疫力；某些疫苗与化疗药物联合可以提高机体的免疫力,提高化疗效果,但能否取代BCG尚需大规模临床实验证实.
-
结核分枝杆菌基因突变检测方法研究进展
结核分枝杆菌全基因组测序工作的完成,为开展结核病基因研究提供了理论基础,对结核分枝杆菌基因突变的研究也成为当前结核病研究领域的热点之一.高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)、基因芯片、DNA直接测序等分子生物学新技术的发展和应用,为结核分枝杆菌基因突变研究提供了更有效的方法.现综合国内外近年来的文献,分类介绍应用于结核分枝杆菌基因突变检测的各种方法的原理、应用情况等,同时也对GeneXpert、结核分枝杆菌线性探针(1ine probe assay,LiPA)、基因芯片等当前比较成熟并有望得到广泛应用的商品化基因突变检测技术进行介绍.
-
结核分枝杆菌复合群脱氧核糖核酸检测试剂分析性能评估浅析
结核分枝杆菌复合群脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)检测试剂的分析性能评估资料是该类试剂注册申报资料的一项重要的技术资料.作者总结分析性能评估资料需要包括的主要项目与相关的技术细节,指导生产企业科学合理地进行试剂研发.
-
结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究
结核病是由Mtb引起的一种呼吸道传染病,全球结核病疫情仍然十分严峻,而卡介苗预防结核病的效果并不理想,研究新型结核病疫苗已成为国内外结核病研究的热点之一.将本课题组自1998年至今研究MtbAg85A DNA疫苗的免疫原性、治疗效果进行综合与概述,结果表明Mtb Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答,可减少小鼠组织中的Mtb尤其是耐多药Mtb的数目,该疫苗与常规化疗联合不仅可提高机体免疫力,并可有效地杀灭或抑制Mtb,从而提高化疗效果.
-
不同方法对陈旧鼠标本DNA提取效果比较
目的 寻求一种适用于从风干和腐败的鼠类标本提取DNA的有效办法.方法 采用改进的毛囊酚-氯仿抽提法、水煮抽提法、酚-氯仿抽提法、Chelex-100法和硅珠法,对风干和腐败的鼠毛、皮张和骨骼等材料进行DNA提取.提取后的DNA经PCR扩增、测序判定鼠类陈旧标本DNA提取方法的有效性.结果 新鲜鼠类标本用上述方法能从毛、皮张和骨骼中提取到满足实验要求的DNA,风干标本可以用酚-氯仿抽提法纯化从皮张中获得高质量的DNA;而对于腐败标本,可用Chelex-100法从骨骼中获得质量较好的DNA.结论 选择适当的方法,可以从自然环境中风干或腐败的鼠类标本中提取到高质量的DNA满足后续研究的需要.
