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引物标记与掺入标记在HBV基因多态性芯片检测中应用的研究
目的研究引物标记与掺入标记在乙型肝炎病毒(HBV)基因多态性芯片检测中的应用.方法用掺入标记或引物标记荧光分子Cy5,扩增HBV P区、前C/C区,制备含荧光分子Cy5的目的片段后,分别与HBV基因多态性芯片杂交、扫描并分析结果.结果掺入标记法信号强度略高于引物标记法,但非特异信号强度也高,两法检测42份乙型肝炎患者血清,结果完全一致,重复性均较好,批内CV 15%～20%,引物标记法用于检测HBV基因多态性灵敏度达104 copies/ml.结论引物标记法信号强度虽略低于掺入标记法,但检测灵敏度、特异性仍满足临床要求.
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HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清病毒载量与肝组织学改变的关系
目的 探讨HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与肝组织损害的关系.方法 以HBeAg阳性慢性乙型肝炎病例为对照,回顾分析HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA水平与肝组织病理炎症分级、纤维化分期之间的关系.结果 HBeAg阴性与阳性组HBV DNA 平均含量分别为(5.38±1.27)log10拷贝/ml和(6.80±1.18)log10拷贝/ml,差异有统计学意义(P<0.01).与HBeAg阳性组比较,HBeAg阴性组肝组织炎症分级及纤维化分期较高(P<0.01).HBeAg 阴性患者HBV DNA水平与肝组织炎症分级及纤维化分期呈正相关(P<0.01).结论 HBeAg阴性慢性乙型肝炎病毒载量低,乙肝病毒载量与肝损害呈正相关.
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重组质粒pVR-S与重组腺病毒rAdV-S诱导特异性免疫反应的研究
目的 研究表达HBsAg的重组质粒pVR-S与表达HBsAg的重组腺病毒rAdV-S在不同免疫策略下的免疫效果.方法 使用BALB/c小鼠,在比较电击与肌注两种方法后,分别单独免疫pVR-S和rAdV-S,使用ELISA和Elispot方法分别检测体液免疫和细胞免疫水平;然后采用联合免疫pVR-S和rAdV-S,比较联合免疫与单独免疫对小鼠产生免疫应答的不同影响.结果 与肌内注射相比较,电击注射pVR-S能更快诱导较高的HBsAb抗体水平.当pVR-S和rAdV-S分别单独免疫时,pVR-S引起体液免疫应答的速度较慢,而rAdV-S可在第2周迅速诱导产生体液免疫应答,rAdV-S诱导的体液免疫应答和细胞免疫应答水平均高于pVR-S;联合免疫pVR-S和rAdV-S时,联合免疫产生的细胞免疫应答是单独免疫的2～3倍,同时还可诱导出相同或更高水平的体液免疫应答.结论 rAdV-S的单独免疫效果高于pVR-S,联合免疫可比单独免疫诱导产生更强的免疫应答,有助于提高机体抗病毒能力.
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慢性乙型肝炎患者树突状细胞表型的研究
目的 探讨慢性乙型肝炎患者外周血来源树突状细胞(Dendritic cell,DC)数量及表型的改变,并对其与肝功能、乙肝病毒复制水平的关系进行研究.方法 检测37例慢性乙肝患者和21例健康人肝功能及血清HBV DNA水平,并提取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)进行体外诱导培养,促使其发育成DC,计数其数量并检测膜表面分子的变化.分析DC数量及表型与肝功能、乙肝病毒复制水平的关系.结果 与正常对照组比较,慢性乙肝患者的树突状细胞数量明显减少(P＜0.05),且其膜表面分子CD83、CD86的表达均明显降低(P＜0.05).在慢性乙肝患者中,DC数量、DC膜表面分子CD83和CD86与血清HBV DNA之间呈负相关关系,而与肝功能之间无明显相关关系.结论 慢性乙肝患者体内存在DC数量减少及成熟障碍,这种改变与肝内炎症反应程度不相关,但与乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)的复制水平呈负相关,提示DC参与慢性乙肝患者体内HBV的清除.
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丁型肝炎病毒核酶反式切割HBV mRNA片段的实验研究
目的探讨反式作用丁型肝炎病毒(HDV)核酶体外切割乙型肝炎病毒(HBV) mRNA片段的可行性.方法将化学合成的核酶cDNA克隆到含有T7启动子的载体PGEM-4Z中.利用体外转录技术转录出核酶及底物,研究其体外切割活性.利用E-H作图法进行核酶的酶促动力学研究.结果在体外实验中显示两酶均能成功的将底物切割,37℃温浴90 min的切割百分率为50%和51%.利用E-H作图法进行的酶促动力学研究中求得Rc1、Rc2的Km值分别为0.61 μmol/L、0.58 μmol/L,Kcat值分别为:0.64*min-1、0.60*min-1.结论反式作用HDV核酶对非HDV底物-HBV mRNA片段的成功切割为寻找新的HBV的反义抑制手段开辟了途径.
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定位表达于溶酶体、泛素的PrP载体的构建及鉴定
目的 构建定位于溶酶体、泛素的PrP表达载体,并进行蛋白表达特点及定位的鉴定.方法 将泛素基因、溶酶体膜定位信号序列基因和PrP基因连接,克隆至pcDNA3.1载体中,构建表达载体pcDNA3.1-UPrP、pcDNA3.1-PrPL;瞬时转染真核表达细胞,经Western Blot和间接免疫荧光技术检测PrP表达特点.结果 构建的各种PrP定位表达载体均可定位表达具有三种类型的糖基化分子的PrP,以双糖基化分子类型多.带有泛素、溶酶体信号的质粒pcDNA3.1-UPrP、pcDNA301-PrPL的PrP表达随着时间的延长蛋白表达量下降,提示泛素、溶酶体信号能加速表达PrP在细胞内的降解.结论 成功构建了溶酶体、泛素定位表达的PRNP核酸疫苗载体pcDNA3.1-UPrP、pcDNA3.1-PrPL,为PRNP核酸疫苗的研究奠定了一定的基础.
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双顺反子载体构建及其在基因联合免疫中的应用
目的为了便于多价DNA疫苗的制备和基因表达的研究.方法以pcDNA3.0为基础构建了pcDNA3.0BA双顺反子载体,将HBV preS2S与HCV pc154基因插入pcDNA3.0BA构建了单价和双价质粒.质粒转染Cos-7细胞瞬时表达,并经肌肉免疫BALB/c小鼠测定抗体应答和淋巴细胞增殖能力.结果pcDNA3.0BA全长为6.4kb,具有两个外源基因表达单元,其调控元件均为CMV启动子和BGH pol A;两个表达单元中多克隆位点单酶切分别为:MCS1为EcoRⅤ、Not Ⅰ、Xho Ⅰ;MCS2为:Kpn Ⅰ、BamHⅠ、EcoRⅠ.双价质粒在Cos-7细胞中preS2S与HCV pc154两个基因都同时表达,诱导小鼠产生了抗HBs和HCV核心蛋白抗体,抗体效价和淋巴细胞对抗原刺激的增殖能力单价和双价质粒相比差异不显著.结论pcDNA3.0BA双顺反子载体可以共表达多个基因,并诱导产生免疫应答.
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HBVcccDNA在乙型肝炎患者血清、外周单核细胞及肝组织中的分布
目的 观察乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBVcccDNA)在乙肝患者血清、外周单核细胞(PBMC)及肝组织中的分布情况.方法 选取血清HBVDNA＞105拷贝/ml的乙肝患者50例,血清HBVDNA＜105拷贝/ml的乙肝患者30例,脂肪肝患者(非乙型肝炎)20例,同时采用实时荧光定量聚合酶链反应检测患者血清、PBMC及肝组织中HBVcccDNA的存在情况.结果 50份血清HBVDNA＞105拷贝/ml的标本中血清HBVcccDNA检出28例,检出率56%,PBMC HBVcccDNA检出29例,检出率58%,肝组织中HBVcccDNA检出44例,检出率88%,血清、PBMC的检出较肝组织检出差异有统计学意义P＜0.005,血清较PBMC检出差异无统计学意义P＞0.005.30份血清HBVDNA＜105拷贝/ml的标本中血清、PBMC HBVcccDNA检出均为2例,检出率6.67%,肝组织中HBVcccDNA检出6例,检出率20%,血清、PBMC、肝组织三者之间检出差异无统计学意义,P＞0.005.20份脂肪肝患者的血清、PBMC及肝组织中均未检出HBVcccDNA.结论 HBVcccDNA主要存在于乙型肝炎患者的肝脏中,乙肝患者血清及PBMC中也有HBVcccDNA的存在但较肝组织中要少的多.
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HIV DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫效果的研究
目的构建含HIV-1 B亚型中国株gagV3基因的DNA疫苗及重组腺病毒伴随病毒(rAAV)疫苗,并研究DNA疫苗和rAAV联合免疫的免疫效果.方法将HIV-1 B亚型中国株gagV3基因克隆入真核表达载体pCI-neo上,构建了含HIV-1 gagV3基因的DNA疫苗pCI-gagV3.采用电击法将pCI-gagV3质粒转染p815细胞,用G418压力筛选,得到转入重组质粒的细胞系p815-gagV3,用免疫酶法检测细胞系中HIV-1基因的表达.用该DNA疫苗进行小鼠免疫实验,检测免疫效果;用该DNA疫苗初次免疫,含同样gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒rAAV-gagV3加强免疫,采用免疫酶法检测免疫小鼠血清中HIV-1特异性的抗体水平,用乳酸脱氢酶法检测免疫小鼠的HIV-1特异性CTL水平. 结果 pCI-gagV3可以在p815细胞中表达HIV-1的基因,免疫BALB/c小鼠后可以在小鼠体内诱发HIV-1特异性的细胞和体液免疫反应.HIV-1特异性抗体滴度为1∶20;效靶比为50∶1时,CTL平均杀伤率为41.7%.pCI-gagV3与rAAV-gagV3联合免疫并不能明显提高抗体水平,但可以提高CTL反应,效靶比为50∶1时,CTL平均杀伤率为61.3%,高于单独用DNA疫苗或重组AAV疫苗免疫后产生的CTL活性.结论 DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫可以提高免疫小鼠产生的HIV-1特异性CTL反应.
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慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与肝纤维化标志物的关系
目的 研究慢性乙型肝炎患者血清HBV复制水平和肝纤维化血清学标志物的关系.方法 入选临床确诊为慢性乙型肝炎的157例患者,其中49例为早期肝硬化,采用荧光定量PCR检测血清HBV DNA水平,放射免疫法和酶免疫法检测肝纤维化血清标志物:透明质酸、层黏蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽和Ⅳ型胶原,对血清HBV DNA水平和肝纤维化标志物的关系进行研究分析,并对49例早期肝硬化患者和108例无肝硬化患者的血清HBV DNA及肝纤维化血清标志物水平进行比较.结果 慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA水平和肝纤维化标志物水平无显著相关性(P＞0.05),早期肝硬化患者的血清肝纤维化标志物水平显著高于无肝硬化的患者,而HBV DNA水平却低于无肝硬化的患者(P＜0.05).结论 慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA水平和肝纤维化标志物水平无显著相关性.
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人偏肺病毒DNA疫苗的构建和小鼠免疫反应的研究
目的 构建人偏肺病毒(hMPV)DNA疫苗,小鼠免疫后评价其细胞和体液免疫水平.方法 利用PCR方法,从hMPV的cDNA中扩增融合蛋白FATM(缺失跨膜区)基因和基质蛋白M基因,构建DNA疫苗pcDNA3.1His-FATM和pcDNA3.1His-M,瞬时转染后用Western Blot和间接免疫荧光方法检测F、M蛋白表达.疫苗肌内注射免疫小鼠,ELISA和ELISPOT方法分别检测血清IgG抗体和小鼠脾细胞CTL水平.结果 Western Blot和间接免疫荧光(IFA)方法证明构建的疫苗可表达FATM和M蛋白.peDNA3.1His-FATM单独免疫小鼠,血清抗体滴度为1:44;与pcDNA3.1His-M联合免疫后,血清抗体滴度为1:64.ELISPOT检测证明,联合免疫组小鼠脾细胞产生IFN-γ的效应CD8+T细胞数为42±8.9,高于单独免疫组32±7.4的水平.结论 DNA疫苗peDNA3.1His-F△TM可以诱导产生特异性的体液和细胞免疫,与pcDNA3.1His-M联合免疫,可以提高免疫水平.
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丙型肝炎病毒全长cDNA模板的构建及鉴定
目的构建具有功能的丙型肝炎病毒(HCV)全长cDNA克隆.方法应用长模板RT-PCR法扩增1份上海地区HCV感染者血清的RNA(基因型为1b),分段扩增、融合拼接成9.2kb的基因片段,克隆入含有HCV基因两端非编码区序列的载体作为模板.为检测此过程是否发生对特定变异株的选择,分析4个独立克隆的HVR1序列.对原核细胞中表达的HCV核心蛋白、NS3蛋白酶及解旋酶,以蛋白印迹实验确证其免疫反应性.并构建NS3/4A-SEAP表达系统检验NS3的蛋白酶活性.结果获得丙型肝炎病毒全长cDNA模板.不同克隆间HVR1序列存在较大差异,提示长模板RT-PCR所制备HCV cDNA具有HCV基因准种(quasispecies)的特性.该模板编码基因在原核细胞内得到高效表达,并具有良好的免疫反应性.在NS3/4A-SEAP表达系统内,NS3可切割、释放其下游的SEAP,具有蛋白酶活性.结论本工作为构建全长功能性HCV cDNA模板及感染性克隆奠定了基础.
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急性乙型肝炎患者血清中HBV-DNA定量的变化规律及其临床意义
目的研究在临床上验证急性乙型肝炎(乙肝)时,血清中HBV-DNA被清除机制.方法总结12例急性乙肝患者血清中HBV-DNA定量和乙肝病毒标志物的动态变化规律.结果 66.7%的患者血清HBV清除发生于患者入院之前.乙肝病毒标志物中HBsAg、HBeAg的吸光度(A值)在住院期间逐渐下降,直至阴转.结论急性乙肝时,绝大部分患者HBV-DNA的清除可能是通过非细胞溶解机制.
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以减毒沙门菌作为DNA疫苗载体的研究
目的以真核表达质粒pCMVβ为报告基因,研究用芳香族氨基酸合成缺陷的沙门菌SL7207为载体以提高DNA疫苗免疫应答的可行性.方法携带质粒pCMVβ的SL7207体外感染小鼠腹腔巨噬细胞后,用X-gal染色方法和RT-PCR方法检测巨噬细胞内β-gal的表达.小鼠口服免疫SL7207(pCMVβ)后,用RT-PCR方法检测β-gal基因在淋巴组织中的转录产物;用ELISA方法检测体液免疫;用3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞增殖;用JAM试验检测杀伤性T淋巴细胞反应.结果 SL7207能有效地将质粒DNA传递到体外培养的巨噬细胞中并进行表达;小鼠口服携带有pCMVβ的SL7207后,能在脾脏、派伊尔结、肠系膜淋巴结中检测到目的基因的转录,并可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫.与肌内注射pCMVβ相比较,口服SL7207(pCMVβ)能更有效地诱导出细胞免疫应答.结论减毒沙门菌SL7207作为DNA疫苗的载体,可经口服途径进行免疫,并可将质粒直接传递给抗原递呈细胞,诱导出以细胞免疫为主的免疫应答.
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优化密码促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应
目的探讨优化密码对人乳头瘤病毒6b型(HPV 6b)基因表达及免疫原性的影响,为治疗性DNA疫苗的研究奠定基础.方法设计合成含优化密码及pRB结合位点突变的HPV 6bE7(hu-mE7)全长基因.测序验证无误后,定向克隆于pcDNA3的KpnⅠ和EcoRⅠ位点,成功构建真核表达质粒pcDNA3-hu-mE7.体外转染COS-1细胞,免疫荧光检测其E7蛋白表达.C57BL/6小鼠胫前肌内接种裸DNA,观察其诱导的细胞免疫反应. 结果 pcDNA3-hu-mE7在COS-1细胞获得明显表达,表达产物主要位于细胞核中.DNA免疫结果显示,与含有野生型E7基因的表达质粒pcDNA3-wtE7比较,pcDNA3-hu-mE7免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ产生明显升高,CD8+和CD4+淋巴细胞活性增强.结论优化密码能促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应.
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抗HBc IgM阳性慢性乙型肝炎临床特性、病毒学和血清学研究
目的 探讨抗HBcAg IgM阳性慢性阳性肝炎患者的临床特性及其与HBV病毒学和血清学的关系.方法 收集河北省张家口市传染病医院和北京地坛医院2004-2006年经Abbott EIA检测试剂证实的所有抗HBcAg IgM阳性和同期随机抽样的抗HBcAg IgM阴性患者的临床资料,包括生化指标、血清HBV DNA载量和血清学指标,分析抗HBcAg IgM阳性和阴性患者的疾病程度和临床转归之间的差异及抗HBcAg IgM状态与HBV DNA载量和HBeAg状态的关系.结果 收集了200例慢性乙型肝炎患者,其中抗HBc IgM阳性70例,阴性130例,轻、中和重度肝脏疾病患者分别为71、83、46例.抗HBc IgM阳性患者的年龄和发病年数高于抗HBc IgM阴性患者,抗HBc IgM阳性的轻度肝脏疾病患者百分比为45.71%,中重度患者为54.29%,低于抗HBc IgM阴性患者(30.00%和70.00%),差异有统计学意义(x2=4.907,P=0.027).抗HBc IgM阳性患者和阴性患者的HBV DNA载量,血清HBeAg/抗Hbe状态、住院天数和转归差异无统计学意义.结论 慢性乙型肝炎患者抗HBcAg IgM的状态与肝脏疾病的程度相关,但与HBV DNA载量和HBeAg/抗Hbe状态无相关性.
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江西省部分吸毒人群HIV-1分子流行病学调查
目的 对江西省吸毒人群进行HIV-1分子流行病学调查研究,了解HIV-1流行情况、亚型种类、毒株来源、变异情况等,为政府部门制定预防控制决策提供技术资料.方法 传统流行病学与分子流行病学相结合,对江西省9例吸毒人员进行流行病相关因素分析和基因序列、系统进化分析.结果 江西省部分吸毒人群不仅共用注射器,同时伴有不洁性交史.流行毒株主要为HIV-1CRF01-AE,序列分析表明与越南和我国广西吸毒人群流行毒株相似性较高,与越南株U90087平均基因距离为9.00±2.27.系统进化分析表明,江西省吸毒人群的毒株来源完全一致.结论 目前江西省吸毒人群中HIV流行已从局部向全省蔓延,流行毒株为HIV-1 CRF01-AE.为阻止蔓延,应加强对吸毒人群和性乱人群的行为干预.
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隐匿性乙型肝炎病毒感染检测的实验研究
目的 了解乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阴性个体HBV DNA检出情况,探讨检测乙型肝炎病毒表面大蛋白(HBLP)用于筛查临床隐匿性HBV感染的血清学检测策略.方法 根据日常检测乙型肝炎病毒血清学模式(HBVM)结果,将HBsAg阴性标本分为乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)阳性和阴性两大类,除外HBVM抗原抗体同时阳性等特殊模式,从临床检测备份管随机收集各1000份共计2000份血清标本,双份分装-20℃冻存;用多管混合的方法实施HBV DNA定量分析,筛选出阳性标本;HBV DNA阳性标本行HBLP检测,再经美国超敏MONOLISA HBsAg ULTRA试剂复检HBsAg.结果 1000份HBsAb阳性标本未检出HBV DNA阳性;1000份HBsAb阴性标本共检出19例HBV DNA阳性;19份HBV DNA阳性标本经HBLP检测和美国超敏试剂复检HBsAg均呈阳性.19份HBV DNA定量分析结果显示:大于500拷贝/ml 2例,400～500拷贝/ml 3例,300～400拷贝/ml 3例,200～300拷贝/ml 7例,100～200拷贝/ml 4例.结论 用国产ELISA试剂常规检测HBsAg漏检标本多来自HBsAb阴性个体;漏检个体HBLP结果可能阳性,检测HBLP有利于筛查隐匿性HBV感染;本研究为积极寻找临床隐匿性HBV感染的检测策略提供了血清学参考.
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B7-2表达质粒对HBV DNA疫苗诱导的特异性免疫应答的影响
目的探讨B7-2分子是否能够增强乙型肝炎病毒(HBV) DNA疫苗诱导的特异性免疫应答.方法将B7-2表达质粒与HBV DNA 疫苗共接种于小鼠腓肠肌内,检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性,迟发性超敏反应(DTH)及抗-HBs滴度.结果 B7-2表达质粒与HBV DNA疫苗共接种组的DTH反应和CTL活性, 明显强于单独接种HBV DNA 疫苗组(P＜0.01).两组的抗-HBs滴度差异无显著性(P＞0.05).结论 B7-2表达质粒与HBV DNA疫苗共接种可显著增强抗-HBV 特异性细胞免疫应答(CMI).
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慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1表达的关系和意义
目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清HBV DNA水平与HBV特异性CTL表面程序性死亡受体-1(PD-1)表达的关系和意义.方法 将133例CHB患者根据血清HBV DNA水平分为甲、乙两组,甲组70例(52.63％),HBV DNA水平为104～105拷贝/ml,乙组63例(47.37％),HBVDNA水平分107 ～ 108拷贝/ml,对两组患者作HBV特异性CTL、非特异性CTL,HBV特异性CTL表面PD-1表达和肝功能的比较.结果 甲组HBV DNA水平为(5.03±1.01)log10拷贝/ml,低于乙组(7.59±0.99) log10拷贝/ml,t=11.23,P＜0.01,HBV特异性CTL表面PD-1表达(26.32±2.56)％,低于乙组(39.35 ±2.86)％,t=18.69,P＜0.01,HBV特异性CTL (0.37±0.02)％,高于乙组(0.22±0.02)％,t=25.80,P＜0.01,非特异性CTL(16.26 ±2.17)％,低于乙组(19.94±2.47)％,t=3.19,P＜0.01,ALT (259.16 ±85.11) U/L,低于乙组(501.16±86.15) U/L,t=15.10,P＜0.01,TBil(27.99±6.13)μmol/L,低于乙组(44.86±9.51) μmol/L,t=3.92,P＜0.01.结论 CHB患者HBV DNA水平低者,HBV特异性CTL表面PD-1表达也低,HBV特异性CTL水平高,HBV DNA水平高者,HBV特异性CTL表面PD-1表达也高,导致HBV特异性CTL水平降低,并启动非特异性CTL,引起肝功能损害加重.
