2种CCK-8试剂佳实验条件比较

在细胞学实验中,MTT(噻唑蓝)比色法常用于细胞毒性、细胞活性和细胞增殖的检测.因MTT法具有简便、经济、安全等特点,而被广泛使用,但其操作较繁琐,需加入二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜颗粒,且往往因溶解不全而对实验结果造成影响,为克服MTT法的不足,近年来出现了另外一些检测试剂,如XTI试剂[1]、MTS试剂[2],国外研发出了1种新型的检测方法CCK-8( cell counting kit-8)[3],其原理为活细胞线粒体脱氢酶转化的黄色结晶为高度水溶性,不需要裂解细胞,可直接进行比色.该法步骤简便,且准确性得到提高,近几年,中国市场上也出现了许多同类产品,但由于各个厂家的生产工艺不同导致在实验中实验方法不尽相同,另外厂家给的试剂说明书上并未对实验步骤进行详细描述,为了得到佳的实验效果,我们对各个具体品牌CCK-8试剂进行实验条件摸索,为同行研究提供参考,结合本实验室具体情况,选取碧云天和凯基2家品牌进行实验条件摸索和结果比较,结果如下.

高同型半胱氨酸血症对晚期肾病患者内皮细胞活性及其功能的影响

检测血清白细胞介素4、白细胞介素16和内皮素1在哮喘患者中的意义

支气管哮喘(简称哮喘)是以气道高反应性和慢性气道炎症为特征的变态反应性疾病,有多种炎症细胞和细胞因子参与.变态反应中T细胞活性是哮喘炎症特征的关键.T细胞及其分泌产物(细胞因子)导致了气道炎症的持续存在,导致了黏膜下水肿、气道阻力增加和引起气道高反应性[1].

结肠同时性多原发类癌伴脾脏转移1例报道

患者,女,71岁.因大便次数增多伴便血10个月入院.就诊前一直按痔疮诊治.自感消瘦,乏力,纳减.5年前曾行卵巢囊肿切除术.查体: 贫血貌,浅表淋巴结未触及.腹部饱满,左上腹可触及4 cm×3 cm大肿块.CT检查提示脾脏数个结节样影,结肠脾曲见分叶状肿块; 右肾盂积水,右输尿管扩张; 乙状结肠处见密度不均肿块影.结肠镜检查: 见距肛缘32 cm降乙部有一菜花样肿块,占据肠腔1周,肠腔狭窄; 距肛缘15 cm处有一菜花样肿块,占据肠腔1/2周; 距肛缘10 cm处有一枚1.5 cm×1.5 cm大的息肉.临床诊断: 结肠同时性多原发癌伴脾脏转移.治疗: 行左半结肠切除术+脾脏切除术.术中见: 横结肠脾曲有一约9 cm×8 cm×8 cm大肿块,降乙交界处有一5 cm×4 cm×4 cm大肿块,脾脏呈结节状; 腹腔可触及多个肿大淋巴结; 肝脏无明显转移灶.术后病理诊断: 结肠同时性多原发类癌伴脾脏转移,淋巴结转移(+).结肠肿瘤免疫组化标记结果: CEA(-),P物质(-),Chr(-),CA-199(+),p53(+++),Sy(-),NSE(-),p16(++),PCNA(++).免疫病理诊断: 结肠类癌,p53高水平表达,p16中等水平表达,增殖细胞活性为中度.

轴状脂肪移植的实验和初步临床研究

目的 通过与Coleman方法比较,探讨轴状脂肪移植方法的可行性.方法 采用Coleman方法及轴状脂肪移植方法,分别于11例拟行头面部脂肪移植患者的下腹部抽取脂肪.取3～4周龄免疫缺陷裸鼠48只,雌雄不限,体重8.6～12.2 g;随机分为两组,每组24只.以背部皮下间隙为移植受区,实验组移植0.5 mL轴状脂肪移植方法获得的人体脂肪组织,对照组移植0.5 mL Coleman方法获得的人体脂肪组织.术后大体观察实验动物背部外观,于1、2、4、8周两组随机处死6只裸鼠,取出背部皮下移植脂肪进行大体、组织学及免疫组织化学染色观察,并于取出脂肪前后对裸鼠称重,计算移植脂肪重量.脂肪抽取术后即刻取脂肪组织进行葡萄糖转移实验和脂肪细胞活性测定.2010年5月-2011年10月,临床应用面部轴状脂肪移植治疗11例局部凹陷性畸形.结果 术后实验组裸鼠背部隆起样外观基本维持,对照组2周时已趋于平坦.两组植入脂肪重量相似(P＞0.05);除术后2周外,其余各时间点实验组残余脂肪重量均显著高于对照组(P＜0.05).组织学观察示实验组细胞形态保持良好,血管分布均匀;对照组细胞破坏再吸收显著,血管集中分布于移植组织边缘.术后实验组完整脂肪细胞计数均明显多于对照组,除术后2周外其余各时间点组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).实验组毛细血管计数均少于对照组,术后1、2周比较差异有统计学意义(P＜0.05),但4、8周时差异无统计学意义(P＞0.05).轴状脂肪移植方法抽取的脂肪组织葡萄糖转移量为(1.462±0.080)mmol/L,显著高于Coleman方法抽取的脂肪组织(1.153±0.199)mmol/L(t=3.317,P=0.021);且轴状脂肪移植方法抽取的脂肪组织细胞活性更佳.临床应用患者均获随访,随访时间2～9个月;随访期间受区未见明显萎缩及塌陷.结论 与Coleman方法比较,轴状脂肪移植方法获得的脂肪组织可保持原结构和良好活性,移植术后能更早与受区建立血液循环,术后组织再吸收率低,形态维持时间长.

液氮冷冻保存对大月龄人胎儿带瓣血管细胞活性的影响

目的 探讨液氮冷冻保存对大月龄人胎儿带瓣血管细胞活性的影响.方法 以脑死亡大月龄人胎儿带瓣主动脉为研究对象,胎龄24周以上,热缺血时间小于6h.每份标本一分为二,设新鲜对照组(对照组)和冷冻实验组(实验组),实验组在液氮内保存1周后取出.通过形态学观察、细胞培养和四甲基偶氮唑盐(MTT )比色,评价液氮冷冻后的大月龄人胎儿带瓣血管细胞的活性.结果 共采集12个大月龄人胎儿带瓣主动脉,冷冻保存的主动脉壁成纤维细胞及平滑肌细胞形态正常,胶原纤维排列整齐,但内皮细胞层部分脱落.冷冻前后血管组织块均有大量细胞生长,但实验组细胞增殖速度稍慢.对照组细胞在490nm波长的OD值为0.442±0.046,实验组细胞在490nm波长的OD值为0.424±0.041,二者比较差异无统计学意义(t＝1.617, P=0.328).结论 液氮冷冻保存的大月龄人胎儿带瓣血管具有细胞活性.

经液氮保存有活性同种带支架瓣膜的实验研究

目的 检测经液氮保存的人同种带支架瓣膜的细胞活性和流体力学性能.方法 制作同种带支架瓣膜经液氮保存3个月后,利用流式细胞仪技术定量检测瓣叶细胞活性(实验组,n=6),采集新鲜同种瓣膜作为对照(对照组,n=6).利用国产脉动流实验装置,分别测试实验组21#、23#、25#同种带支架瓣膜的流体力学性能,测试各流量下的跨瓣压差、有效瓣口面积和回流百分比;并使用相应型号的国产Perfect牛心包生物瓣膜进行对比研究.结果 实验组内皮细胞死亡率与对照组比较差异无统计学意义(10.24%±1.71% vs.9.09%±2.72%,P=0.441);实验组平滑肌细胞死亡率与对照组比较差异无统计学意义(8.76%±1.82% vs.7.84%±0.59%,P=0.178);实验组总细胞死亡率与对照组比较差异无统计学意义(8.79%±1.44% vs.7.40%±0.49%,P=0.072).两种21#、23#、25#人工生物瓣膜的跨瓣压差对流量具有非常大的依赖性,随着流量的增大而增大.同种带支架瓣膜的跨瓣压差较Perfect牛心包生物瓣膜的大.两种各型号瓣膜的回流百分比均随测试流量的增大而略有减小,同样,同种带支架瓣膜的回流百分比较Perfect牛心包生物瓣膜的大.两种各型号瓣膜的有效瓣口面积均有随流量增加而增大的趋势,同种带支架瓣膜的有效瓣口面积较Perfect牛心包生物瓣膜的略小.结论 经液氮保存同种带支架瓣膜的细胞活性保存良好,流体力学性能较满意.

再次液氮冷冻保存对猪主动脉瓣膜细胞活性及组织结构的影响

目的了解再次冷冻保存对主动脉瓣膜细胞活性及组织结构的影响,探讨液氮冷冻保存的主动脉瓣解冻后再次冷冻保存使用的可行性.方法将猪主动脉瓣叶在抗菌处理后按随机数字表法分成三组,每组6个瓣叶,组Ⅰ作对照,组Ⅱ、组Ⅲ控制降温速率降至-80℃后在液氮中保存,1个月后融化解冻.组Ⅲ解冻并在室温下放置15分钟后更换保存液,再次降温至-80℃后放入液氮中保存,2个月后再融化解冻.采用XTT比色法测定各组瓣膜细胞活性,用免疫荧光组织化学染色、光学显微镜、透射电子显微镜行组织学检测.结果组Ⅱ冷冻保存后瓣膜细胞活性下降到组Ⅰ的63.97%,组织结构一定程度受损;组Ⅲ瓣膜细胞活性下降至组Ⅰ的38.60%,组织结构损害也进一步加重.结论液氮冷冻保存的猪主动脉瓣一经解冻融化,不宜再次冷冻保存使用.

重香口服液的免疫调节作用研究

目的:探讨抗病毒复方重香口服液的免疫调节机制.方法:采用环磷酰胺遣模免疫抑制模型鼠,运用重香口服液的不同溶媒(水、醇以及水醇双提)所获得的提取液加以治疗后,检测各组动物免疫功能.结果:成功地复制了环磷酰胺免疫抑制模型鼠,在胸腺重、NK细胞、IL-2与TNF活性、C3bR和ICR等各项指标上,都显示出与正常对照组的显著性差异.复方重香口服液的3种提取液都具有针对免疫抑制鼠之胸腺结构与功能的显著恢复作用.水提液对免疫抑制鼠NK细胞活性、TNF活性、C3bR的提升作用明显;醇提液对NK细胞活性、TNF活性、IL-2有明显提升作用,但对免疫抑制鼠红细胞免疫功能影响不大;水醇双提液对免疫抑制鼠IL-2活性以及ICR两项指标的改善效果较好,同时通过抑制TNF活性而显示出明显的抗炎症作用,但对NK细胞活性以及C3bR等指标的修复作用不如前两者明显.结论:重香口服液复杂的免疫调控机制、以及针对不同临床证候的用药选择性等问题,还有待进一步深入研究.

肝纤维化中MAPK信号转导通路对肝星状细胞活性的影响

肝纤维化(liver fibrosis)作为共同的病理学基础存在于一切慢性肝病中,肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)在所有肝纤维化病变的形成过程中起至关重要的作用[1,2].引起肝纤维化的细胞外基质(extracellularmatrixc,ECM)主要来源于HSC,它能在炎症、外界的物理化学因素、缺氧、肝损伤等刺激下分泌一些细胞因子,通过相应的信号通路调节HSC的活性,使其转化为具有增殖性、成纤维性和收缩性的肌成纤维细胞表型(活化的HSC),大量分泌以胶原蛋白为主的ECM,打破ECM合成与降解的正常平衡,过度沉积于肝脏中,重构肝脏结构而引起纤维化,但肝纤维化的早期可以逆转[3,4].丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPK)是一类丝氨酸蛋白激酶[5口],位于真核生物细胞浆中,基因序列高度保守,能介导细胞中的多种生物学反应.它作为主要的信号传递系统之一,在介导多种病理、生理过程(如细胞间功能同步、细胞生长、分裂、分化、增殖、凋亡以及转化)中起重要作用[6,7].本文就肝纤维化发生中MAPK信号转导通路对HSC活性的影响作一综述,为进一步研究肝纤维化的防治提供参考.

miR-16通过调节Bcl-2的表达活性影响胃癌田胞的生物学行为

目的 探讨miR-16调节Bcl-2的表达活性影响胃癌细胞生物学行为的机制.方法 qPCR检测miR-16在胃癌SGC7901细胞中的转染效率,CCK-8检测miR-16对SGC7901细胞活性的影响,划痕实验检测miR-16对SGC7901细胞迁移能力的影响,流式细胞仪检测miR-16对SGC7901细胞凋亡的影响,Western blotting检测miR-16对Bcl-2蛋白表达的影响以及对凋亡相关蛋白表达的影响.结果 通过miR-16 mimic使miR-16在胃癌SGC7901细胞中过表达后,其细胞活性、迁移能力明显下降,而细胞凋亡率显著上升,同时相关凋亡蛋白表达也增高;Bcl-2 siRNA与miR-16 inhibitor共转染后,能改变miR-16对SGC7901细胞迁移能力、细胞活性和凋亡的影响.结论 miR-16通过调节Bcl-2的表达,抑制细胞活性和迁移能力,诱导胃癌SGC7901细胞凋亡.

微囊化hES/293细胞生物学性状研究

目的:检测海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)微囊化人内皮抑素/293(human Endostatin/293,hES/293)细胞体外培养状况下的生物学性状.方法:实验研究分为两组:A组:hES/293细胞未用ACA微囊包裹;B组:hES/293细胞用ACA微囊包裹,每组6个样本.采用聚电解质络合法制作ACA微囊化hES/293细胞,台盼兰染色计数微囊化细胞的存活率和细胞总数.MTT法测定细胞生长状况,流式细胞术检测细胞周期.结果:在实验观察的14d内,hES/293细胞可在微囊内以细胞团的形式生长,囊内细胞总数随培养时间的延长而增加,但细胞存活率呈下降趋势;B组细胞在前3d生长缓慢,第5d以后生长速率基本上相当于A组;MTT法检测两组在1、3,5、7d的OD值差异无统计学意义(t1=0.208,P1=0.843;t3=0.447,P3=0.674;t5=0.917,P5=0.401;t7=1.956,P7=0.108);流式细胞术显示,B组细胞处于S期的百分比在第7天高于A组,差别有统计学意义(t=3.341,P=0.020),持续时问可迭14d,且第14d二者百分比差异有显著性(t=10.115,P=0.002).结论:微囊化hES/293细胞具有较高的增殖和代谢活性,且能较长时间保持此活性.

MTT法与CC K-8法检测兔视网膜色素上皮细胞活性的比较研究

目的:探讨MTT法和CCK-8法对细胞活性检测的佳实验条件,并比较二者的优缺点.方法:取传至第5代的兔视网膜色素上皮细胞为研究对象,分别用MTT试剂和CCK-8试剂检测兔视网膜色素上皮细胞的增殖情况.结果:MTT法佳检测波长为570nm,佳检测时间在加入试剂后4h,细胞数量在1.25×103~2×104之间检测较好;CCK-8法佳检测波长在450nm,佳检测时间在加入试剂4~6h,适宜的细胞检测范围为1.25×103~1×104.结论:MTT法较CCK-8法细胞检测范围更广,孵育时间更短,是一种优于CCK-8法的细胞活性检测方法.

兔骨髓间充质干细胞促进乳鼠损伤神经元修复的研究

[目的]探讨骨髓间充质干细胞对损伤神经元的作用.[方法]培养骨髓间充质干细胞融合达90%时更换培养基培养24 h,收集细胞培养液即为BMMSC条件培养基,用谷氨酸建立离体大鼠皮质神经元损伤模型,用MSC条件培养基进行对谷氨酸损伤神经元的修复,倒置显微镜观察细胞生长及形态的变化,用四唑盐比色法(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测各组神经元的活性和细胞损伤后修复的程度. [结果]谷氨酸(O.8 mmol/L)对神经元有明显的损伤作用(P＜O.05),骨髓间充质干细胞条件培养基能提高正常及损伤神经元细胞活性,MTT值明显升高(P＜O.05),LDH渗漏量明显下降(P＜O.05). [结论]骨髓间充质干细胞条件培养基能促进损伤神经元的修复.

孙家明保证细胞活性，提升自体脂肪移植效果

较之假体隆乳，爱美女性更倾向于选择自体脂肪，首先这是自己的东西，更安全，而且自体脂肪移植隆乳既能能减肥又能丰胸，一举两得。但自体脂肪移植隆胸时吸收率和存活率的问题一直备受关注和质疑，在此乳房整形大师孙家明提醒大家--想要促成脂肪移植的高成活率，首先就要从脂肪的采取、处理过程来优化提取脂肪细胞的活性。

内服外用“七白散”配合氢锟乳膏治疗黄褐斑75例临床疗效观察

黄褐斑是一种常见的获得性色素增多性皮肤病，中医学属“肝斑”、“黧黑斑”、“蝴蝶斑”等范畴，在自然人群中患病率较高，好发于中青年女性，育龄期女性较多［1］，以颜面部位的对称性分布、大小不一、形态不定、无自觉症状的淡褐色至淡黑斑片为临床特征，通常分布于颧部、颊部、眼眶周围、鼻部以及前额等，皮损表面光滑，不高于表皮，没有炎症，无脱屑，无痛痒感，日晒后加重。黄褐斑发展缓慢，病程较长，具有顽固和复发的特点，是临床常见而又难以治愈的皮肤病之一。黄褐斑的病因及发病机制还不明确，现代医学对其治疗多停留在治标阶段，以外治法为主。旨在抑制黑色素细胞增生、防止黑色素颗粒形成、加速黑色素颗粒降解以及降低黑色素细胞活性等［2］。

富血小板血浆对脂肪移植物存活作用的研究进展

自体脂肪组织移植因其良好的生物相容性,易于在患者自身大量获取,且移植后形态自然,手感接近正常组织等优点而被广泛应用于软组织重建.然而,移植后脂肪组织存活的不确定性,较高的回吸收率,以及脂肪液化坏死、硬结形成、感染等风险又使其临床应用受到限制.为了解决这一问题,从1893年,自体脂肪移植首次被Neuer提出以来[1],临床与实验研究从脂肪组织的获取、处理、植入等方面不断改进方法,做出新的尝试,以期增加脂肪细胞活性,提高其存活率和维持移植脂肪的体积,但至今仍未达成共识[2].目前,许多研究尝试辅助添加胰岛素、β-成纤维细胞生长因子、纤维蛋白胶、脂肪干细胞等物质来促进移植脂肪组织存活[3-6],但均未达到令人满意的效果.近年来,因富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)对各种软硬组织的生长和修复具有一定的促进作用,国内外学者尝试将其应用于脂肪组织移植,PRP对脂肪移植物存活的作用成为研究热点,现将相关研究进展综述如下.

豚鼠耳蜗Hensen细胞的分离、活性鉴定及其胞内静态游离Ca2+分布

使用酶消化法及机械分离法对Hensen细胞进行分离,置于倒置显微镜下用碘化丙啶及钙敏荧光染料Fluo-3进行细胞活性鉴定并在激光扫描共聚焦显微镜下观察静息状态Hensen细胞内的游离Ca2+的时空分布.结果证明,每个豚鼠耳蜗可以得到单离的Hensen细胞5～12个.细胞活性良好,可保持5～6 h.当细胞变性、坏死时可见一系列的形态学变化.对此得出几点判断Hensen细胞活性的标准:(1)细胞体呈卵圆形或椭圆形,大小可不一致;(2)细胞膜完整,细胞边界清楚,折光现象明显;(3)细胞浆清澈透明,无布朗运动,无溢出;(4)细胞浆内的脂滴清晰可辨,折光现象明显;(5)细胞无水肿(即无气球样变).在静息状态下,Hensen细胞内的Ca2+在细胞内分布不均匀,脂滴所在部位没有Ca2+的分布.随时间延长,细胞内的[Ca2+]i可小幅度振荡,但基本处于一种稳定状态.本工作为进一步对Hensen细胞的其他特性进行研究打下了基础.

一种获得小鼠背侧齿状回健康颗粒细胞的脑片制备方法

目的:研究获得背侧齿状回健康颗粒细胞的制片方法.方法:成年小鼠.(1)控制切片角度,尽量保留颗粒细胞顶树突的完整,沿水平20 ～ 30°切片角度获取海马横向(transverse)脑片;(2)注意区分脑片的正、反面,选择海马脑片反面的背侧齿状回上片;(3)合并使用其它保护脑片细胞活性的措施,如采用无钠切片液,切片液中添加抗氧化剂等.结果:本方法所得特定角度的海马横向脑片,其上有大量颗粒细胞表现出轮廓清晰、柔和、胞体圆润的健康状态,且记录出颗粒细胞兴奋性微小突触后电流(mEPSCs)的频率和幅度,均较传统海马横向脑片方法有明显增加.结论:适当的切片角度可保持颗粒细胞远端树突末梢的完整,提高细胞的活性,获得大量健康颗粒细胞.提示在制备脑片时要考虑感兴趣细胞整体的走行,保证切片时细胞整体的完整性.

白藜芦醇预处理对神经干细胞氧糖剥夺损伤的保护作用

目的 探讨白藜芦醇预处理对神经干细胞氧糖剥夺损伤的保护作用.方法 用含有白藜芦醇的细胞培养基预培养神经干细胞1h,更换低糖培养基后将细胞培养在缺氧培养盒内6h进行氧糖剥夺实验(OGD);采用噻唑蓝(MTT)比色实验检测细胞活性;用LDH试剂盒测细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性.结果 白藜芦醇预处理(PRC)组细胞MTT值高于对照组(n=7,P＜0.01),PRC组细胞培养基上清中LDH低于对照组(n=5,P＜0.01).结论 白藜芦醇预处理对神经干细胞氧糖剥夺损伤有保护作用.