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虫草素对A549细胞增殖、凋亡及核转录因子NF-κB活性的影响
目的:研究虫草素对A549细胞增殖、凋亡及核转录因子NF-κB的影响,并探讨其诱导凋亡的机制.方法:采用MTS法检测不同浓度虫草素对A549细胞的增殖抑制作用,并计算24h的IC50;用Hoechst 33258染色法及流式细胞术检测24 h不同浓度虫草素诱导A549细胞凋亡的情况;Western blot法检测虫草素对A549细胞核内NF-κB p65及凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、cleaved Caspase-3表达的影响.结果:虫草素能明显抑制A549细胞增殖,促进其凋亡;随着虫草素浓度的升高,BAX和cleaved Caspase-3的表达上调,而BCL-2表达下调;Western blot检测结果显示,虫草素能抑制A549细胞质中的NF-κB p65向核内转位.以上作用均呈现量效关系.结论:虫草素能抑制A549细胞增殖并促进其凋亡,机制可能与抑制NF-κB通路相关.
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高乌甲素对非小细胞肺癌体外杀伤作用及其分子机制
目的:探讨高乌甲素对人非小细胞肺癌A549细胞株增殖、凋亡、细胞周期的影响及其可能机制.方法:体外培养人非小细胞肺癌细胞株A549细胞,以不同浓度高乌甲素干预,采用MTT法、流式细胞术、实时荧光定量PCR法检测等技术,研究不同浓度高乌甲素对其增生、凋亡、细胞周期及Cyclin E1 mRNA表达的影响.结果:高乌甲素可呈剂量依赖性抑制A549细胞增殖.随着高乌甲素浓度的增加,A549细胞G1+G0期细胞所占比例逐渐上升,而S期和G2+M期所占比例逐渐下降;凋亡率逐渐升高,同时Cyclin E1表达下调.结论:高乌甲素具有抗肿瘤作用,其机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞,下调Cyclin E1表达有关.
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环氧合酶-2抑制剂对非小细胞肺癌A549细胞VEGF表达的影响
目的 探讨环氧合酶-2抑制剂对非小细胞肺癌A549细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 加不同浓度塞来昔布与A549肺癌细胞共培养,MTT法检测细胞增殖,50μmol/L塞来昔布作用于A549细胞48 h,RT-PCR方法检测各组细胞的VEGF基因表达水平,Western blot方法检测各组细胞的VEGF蛋白表达.结果 塞来昔布在体外对细胞株A549的生长抑制作用呈剂量、时间依赖性;各组细胞培养48 h后,相比于对照组,RT-PCR方法检测发现塞来昔布组细胞VEGF mRNA表达显著降低(P＜0.01),Western blot方法检测发现塞来昔布组细胞VEGF蛋白表达显著降低(P＜0.01).结论 塞来昔布可能通过调节VEGF的表达抑制A549细胞增殖.
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ID1启动子的构建及其在不同细胞系中的表达
目的 观察不同细胞系中ID1启动子活性的表达的不同.方法 以大鼠的基因组DNA为模板克隆了长度为1742 bp(-1765/+88)的大鼠ID1启动子序列,将其连接到带有luciferase报告基因的PGL3-basic载体上,构建PGL3-ID1启动子序列.测序正确后,用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、A549细胞、F10细胞、MEF细胞和MC3T3细胞.转染36 h后,收取细胞应用荧光素酶报告基因系统检测PGL3-ID1报告基因的表达.结果 构建成功的PGL3-ID1启动子在A549细胞、F10细胞、MSCs细胞、MEF细胞中的表达明显增高,尤以4549和F10的表达为显著;在MC3T3细胞中表达不明显.结论 ID1启动子的活性与细胞的分化程度密切相关,可能对细胞的增殖和分化起了关键性的调控作用.
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低毒性磁性纳米颗粒搭载喜树碱的抗肺癌作用
目的:研究磁性纳米材料搭载喜树碱(MNC-Camp)的制备、药物释放、细胞吸收及抗肺癌作用.方法:紫外分光光度法监测MNC-Camp的药物释放能力,普鲁兰染色法检测A549肺癌细胞对磁性纳米材料的吸收能力的影响,利用MTT法测定游离Camp和MNC-Camp对A549细胞株和白细胞生长的抑制能力,细胞侵袭法分析游离Camp和MNC-Camp对A549细胞转移能力的影响,酶标仪吸光度法检测细胞凋亡蛋白caspase-3的活性.结果:MNC-Camp的药物释放随着时间的增加而增加,A549肺癌细胞对磁性纳米材料具有良好的吸收能力;与MNC组比较,游离Camp和MNC-Camp能够使A549细胞生长能力降低,IC50分别为(35.14±3.21)和(7.16±2.54)mg/L,且A549细胞转移的数目下降,凋亡蛋白caspase-3活性增加,以上作用效果MNC-Camp明显强于游离Camp(P＜0.05).结论:磁性纳米材料搭载喜树碱比游离的喜树碱更能显著降低人肺癌A549细胞的生长和转移能力,提示磁性纳米材料能增强喜树碱的抗肺癌作用.
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人γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因E-box元件功能初步分析
目的:探讨人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列E-box元件的功能.方法:利用PCR法克隆人GCLC基因上游调控序列,PCR重叠延伸法对2个E-box元件分别和同时进行定点突变.扩增获得的突变体片段克隆入PMD18-T载体,DNA测序鉴定后,亚克隆入野生型GCLC*Luc荧光素酶报道载体.将3个突变体质粒和野生型质粒转染人肺泡上皮细胞A 549和人支气管上皮细胞16HBE,检测转染后细胞荧光素酶活性值.结果:测序结果证实,成功将E-box1 CACGC,G突变为AGCGGG;E-box2 CACGTG突变为CACG93A.GCLC-Luc、GCLC-mEbox1-Luc(突变E-box1)、GCLC-mEbox2-Luc(突变E-box2)、GCLC-mEbox12-Luc(突变E-box1和E-box2)转染A549细胞后荧光素酶活性值分别为(5 197 852±132 206)U、(5 455 692±127 431)U、(5 315 722±244 197)U、(5 174 303±183 179)U,转染16HBE细胞后荧光素酶活性值分别为(141 157±18 907)U、(126 454±23 724)U、(137 315±22 179)U、(132 441±28 970)u.经过统计学分析,各组荧光酶活性没有显著差别,均P>0.05.结论:E-box元件不参与基础状态下A549细胞和16HBE细胞GCLC基因转录调控.
关键词： 16HBE细胞 A549细胞 基因 GCLC γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 -
CD40信号通过TNFR I途径抑制肺癌细胞增殖的研究
背景与目的:CD40活化信号可抑制多种肿瘤细胞体外生长,但其分子机制尚不明确,本研究旨在探讨激发CD40信号对肺癌细胞株NC1-H460、A549的增殖及肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)、膜型TNF-α(mTNF-α)表达的影响及相关机制.方法:免疫荧光标记和流式细胞术检测肺癌细胞表面CD40的表达以及激发CD40对细胞表面TNFR和mTNF-α表达谱的影响;Western blot检测激发CD40对细胞TNFR和mTNF-α蛋白含量表达的影响;采用四氮唑盐(MTTr)比色法抗体中和实验分析阻断TNFR I及TNF-α对CD40激发效应的影响:酶联免疫吸附(ELISA)法检测激发CD40对肺癌细胞培养上清中可溶性TNF-α(sTNF-α)含量的影响.结果:(1)肺癌细胞株NCI-H460、A549表面CD40表达分别为(89.0±3.2)%、(62.2±4.5)%.(2)免疫荧光和流式细胞术示,激发NCI-H460和A549细胞表面CD40分子48 h后.其表面TNFRI表达率分别为(36.2±4.6)%、(38.5±5.9)%,较对照组分别为(7.2±1.9)%、(15.2±3.1)%明显升高(P＜0.05);而其表面TNFRⅡ表达率分别为(5.8±1.2)%、(18.0±1.6)%,较对照组分别为(38.8±4.3)%、(58.1±3.6)%明显降低(P＜0.05);其表面TNF-α表达率分别为(7.0±0.9)%、(8.7±1.1)%,较对照组分别为(15.0±2.1)%、(26.5±3.2)%也明显降低(P＜0.05).(3)Western blot示,激发CD40可使NCI-H460和A549细胞TNFR I蛋白表达增强,TNFRⅡ蛋白表达减弱,而mTNF-α 蛋白表达无明显变化.(4)CD40激发前后肺癌细胞培养上清中未检测到sTNF-α的存在.(5)激发CD40能明显抑制NCI-H460、A549细胞的增殖(P＜0.05).而阻断TNFR I后CIM0信号的细胞增殖抑制效应消失.(6)阻断TNF-α亦可明显抑制两肺癌细胞株增殖(P＜0.05).而同时激发CD40未见两者存在协同效应.结论:CD40信号是通过mTNF-α/TNFR I途径抑制CD40表达阳性肺癌细胞株的体外增殖.
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转染IkBα基因抑制NF-kB活性对A549细胞侵袭行为的影响
背景与目的:近年来的研究显示核因子-KB(nuclear factor-kB, NF-kB)的活化能够调节肿瘤细胞的侵袭和转移.本研究探讨抑制NF-kB的活性对A549细胞侵袭能力的影响及其可能的机制.方法:构建表达NF-kB抑制物a同分异构体(inhibitor of NF-kB, α isoform, IkBα)的真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)/IkBα.体外培养A549细胞,分为未转染组(不转染质粒)、转染pcDNA3.1(+)组、转染pcDNA3.1(+)/IkBα组,分别转染相应的质粒.应用RT-PCR、Western blot检测各组细胞IkBα的表达情况,应用凝胶电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)检测各组细胞NF-kB的活性,应用Transwell侵袭小室检测各组细胞的侵袭能力,应用RT-PCR方法检测各组细胞MMP-2、MMP-9的mRNA水平,应用明胶酶谱法检测各组细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的活性.结果:酶切鉴定结果显示pcDNA3.1(+)/IkBα质粒构建成功.RT-PCR和Western blot检测结果表明构建的pcDNA3.1(+)/IkBα质粒能够在A549细胞中表达IkBα.转染pcDNA3.1(+)/IkBα组A549细胞NF-kB活性、侵袭细胞数目、MMP-2活性及MMP-9活性均低于未转染组和转染pcDNA3.1(+)组(P值均<0.05),而转染pcDNA3.1(+)组与未转染组之间的差异均无统计学意义(P值均>0.05).结论:转染IkBα基因能够抑制A549细胞中NF-KB的活性.NF-kB的活性下降能够抑制A549细胞的侵袭能力,其机制可能与MMP-2、MMP-9表达下调有关.
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腺相关病毒携带hTERT启动子调控的TRAIL基因特异性杀伤肿瘤细胞
背景与目的:腺相关病毒(adeno-associated virus)作为载体已被广泛用于肿瘤的基因治疗研究.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factorrelated apoptosis.inducing ligand,TRAIL)基因可迅速诱导多种肿瘤细胞的凋亡.是一个安全有效的肿瘤杀伤基因.本研究旨在构建能在肿瘤细胞内特异性表达TRAIL基因的靶向腺相关病毒,并探讨其体外抗肿瘤效应的可能机制.方法:利用肿瘤特异性启动子端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcfiptase,hTERT)构建特异性杀伤肿瘤细胞的腺相关病毒载体pAAV-hTERT-TRAIL.通过与pAAV-Rc、pHelper共转染HEK293细胞包装出病毒AAV-hTERT-TRAIL.将该病毒体外转染人结肠癌SW620细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞和正常细胞NHLF、MRC5后,检测TRAIL基因的肿瘤特异性表达.MTT法检测其对细胞增殖的影响,ELISA、Western blot法以及流式细胞仪检测细胞的凋亡,并分析其体外抗肿瘤效应的可能机制.结果:成功包装出病毒AAVhTERT-TRAIL.RT-PCR、Western blot和免疫组化法均证实AAV-hTERT-TRAIL能介导TRAIL基因在肿瘤细胞内特异性表达,但在正常细胞内不表达.以100 MOI AAV-IlTERTTRAIL感染细胞96 h后,SW620、A549和HepG2细胞的增殖率分别是41.55%、44.29%、49.95%,NHLF和MRC5细胞的增殖率分别是84.59%和87.22%.Western blot检测发现AAV-hTERT-TRAIL可激活Caspase通路.流式细胞仪和ELISA方法检测证实AAV-hTERT-TRAIL可诱导细胞凋亡.结论:hTERT的存在增强了腺相关病毒所携带TRAIL基因表达的肿瘤靶向性和对正常细胞的安全性.由它调控的杀伤基因可介导肿瘤细胞特异性的细胞毒效应.
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STAT3反义核酸对A549细胞增殖和凋亡的影响
背景与目的:研究表明,STAT3(signal transducer and activator of trarscription 3)蛋白在多种肿瘤组织或细胞中高表达,STAT3蛋白可能参与了肿瘤的发生与发展.本研究拟设计筛选出针对STAT3的高效反义核酸,研究STAT3反义核酸对人肺腺癌细胞A549增殖及凋亡的影响.方法:用RNAStructure4.2软件和STAT3 mRNA全长序列设计出10组反义STAT3序列,并分别转染A549细胞;Cell Count Kit(CCK-8)检测细胞增殖变化,倒置相差显微镜观察细胞增殖和凋亡的变化;Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态变化,AnnexinV/PI复染检测细胞早期凋亡,Western blot检测STAT3蛋白表达和磷酸化,及其下游Bcl-xL蛋白表达的变化,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)单染结合流式细胞仪检测细胞周期变化.结果:设计出的10条反义序列对A549细胞增殖有明显抑制作用,AS10对细胞的增殖抑制率达到75.46%;反义核酸浓度越高,对A549细胞的增殖抑制效应越强(P＜0.01).反义转染后,胞膜皱缩和核固缩形态的典型细胞凋亡明显增多,Annexin V/PI双标流式细胞仪检测发现,反义转染后能够促进细胞的早期凋亡(P＜0.01),早期凋亡率达11.51%;而正常对照组细胞的早期凋亡率为5.18%.STAT3蛋白及其下游Bcl-xL蛋白表达变化明显下降,STAT3蛋白磷酸化水平也降低.PI单染结合流式细胞仪检测发现,正常对照组的S期细胞为44.47%,G1期的细胞则为48.49%;反义转染后的S期细胞明显减少(23.70%),G1期细胞明显增多(63.96%).结论:通过计算机辅助设计筛选得到的高效STAT3反义序列对A549细胞有强烈的增殖抑制作用,能有效促进A549细胞的凋亡,其机理与反义STAT3抑制STAT3蛋白表达、降低磷酸化水平、下调Bcl-xL基因以及使细胞发生G1期阻滞有关.
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表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂ZD1839与奥沙利铂联合对人肺癌A549细胞的作用
背景与目的:ZD1839是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶的小分子抑制剂,是目前肺癌分子靶向治疗中较为成熟的药物,因其单药临床有效率低,如何与化疗联合提高抗癌效应受到关注.本实验通过研究ZD1839联合奥沙利铂的不同给药方案对人肺腺癌细胞A549的杀伤作用,探讨两药联合的佳模式.方法:以药物联合效应测定方法,评价ZD1839和奥沙利铂不同给药顺序对A549细胞的抑制作用,以流式细胞仪测定不同联合方案对A549细胞周期分布及凋亡率的影响.观察ZD1839、奥沙利铂不同给药方案作用时,裸鼠A549细胞移植瘤生长情况,测定肿瘤生长抑制率.结果:先奥沙利铂后ZD1839的序贯给药方案表现出明显的协同作用,药物联合指数为0.51±0.01;而先ZD1839后给予奥沙利铂时,药物联合指数为1.56±0.03,两药间为拮抗作用.先奥沙利铂后ZD1839组G2/M期细胞比例与其他组相比明显增加,达到37.9%(P＜0.05),细胞凋亡率达到22.3%.体内实验表明,先奥沙利铂后ZD1839组抑瘤率高,达到58.9%;而先奥沙利铂+ZD1839 24 h后ZD1839 48 h组的抑瘤率为52.4%,ZD1839后奥沙利铂组的抑瘤率为30.6%.结论:先奥沙利铂后ZD1839序贯给药对A549细胞增殖的抑制作用更强.
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端锚酶反义寡核苷酸联合反义端粒酶催化亚单位对人肺腺癌A549细胞端粒动力学的影响
背景与目的:端锚酶是真核生物体内的一种重要的功能蛋白,对调节细胞端粒长度及参与细胞衰老和永生化过程起着重要的作用.本研究探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译的影响,以及对端粒缩短效能和细胞周期的作用.方法:将培养的A549细胞分为空白对照组、端锚酶正义寡核苷酸对照(tankyrase sense oligonucleotide,sTANKS)、端粒酶催化亚单位正义寡核苷酸对照组(human telomerase reverse transcriptase sense oligonucleotide,shTERT)、端锚酶反义寡核苷酸实验组(tankyrase antisense oligonucleotide,asTANKS)、端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸实验组(human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide,ashTERT)、端锚酶及端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸联合实验组(asTANKS+ashTERT).分别与不同的正、反义寡核苷酸作用,采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法观察端粒酶催化亚单位的mRNA表达,ELISAPCR法测定端粒酶活性,Western blot法观察端锚酶活性,Q-FISH法检测各组端粒的平均长度;并通过传代实验观察不同正、反义寡核苷酸对A549细胞传代寿命的影响.结果:ashTERT能明显抑制端粒酶催化亚单位的mRNA表达及蛋白质活性,不影响端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.59±0.07)kb];细胞在经过56.92±0.46个倍增时间(population double,PD)连续培养终止.asTANKS不影响端粒酶催化亚单位mRNA表达及蛋白质活性,却能明显抑制端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.33±0.09)kb];细胞在经过(53.33±0.57)PD连续培养终止.ashTERT+asTANKS联合作用同时抑制端粒酶和端锚酶.其细胞平均端粒长度缩短更为明显[(3.55±0.08)kb],流式直方图上FITC荧光"左偏"更显著,与ashTERT、asTANKS比较差异有显著性(t=37.33、32.50,P＜0.001);ashTERT+asTANKS组细胞在经(24.53±0.40)PD后培养终止,与ashTERT、asTANKS比较差异也有显著性(t=53.38、43.39,P＜0.001).结论:端锚酶反义寡核苷酸对A549细胞端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,它不仅能通过影响端锚酶活性,缩短A549细胞端粒的平均长度,而达到缩短肿瘤细胞生存寿命的目的;而且可与端粒酶抑制剂产生协同作用,明显缩短肿瘤细胞的生存周期,可能成为抗癌作用的新靶点.
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p73基因过量表达对人肺癌细胞A549凋亡及其化疗敏感性的作用
背景与目的:部分非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)表达野生型p53基因(wild-type p53,wt-p53),因此在基因治疗中克服这些NSCLC对wt-p53的抵抗机制就非常重要.P53基因家族的新成员p73是p53的同源体,本研究旨在探讨对wt-p53基因治疗抵抗的人肺腺癌细胞A549在外源p73基因转染或联用化疗药后凋亡程度和对化疗药物敏感性的变化.方法:将真核表达重组质粒pcDNA3-HA-p53或pcDNA3-HA-p73α转染入A549细胞,G418筛选,Western blot检测P53或P73α的表达.MTT法分析转染细胞对顺铂和阿霉素的敏感性,用流式细胞术、TUNEL法和DNA片段法分析化疗药作用下转染细胞的凋亡变化,克隆形成实验观察细胞生物学性状的改变.结果:转染p53或p73α基因的A549细胞可以稳定高表达p53或p73α蛋白.转染p73α的A549细胞在原本没有明显抑制和杀伤作用的药物浓度(6.25μmol/L的顺铂或0.25 μmol/L的阿霉素)作用下生长明显受到抑制,顺铂的IC50值从22.65 μmoL/L降至3.75μmol/L,阿霉素的IC50值从4.20 μmol/L降至0.06 μmol/L.p73能使A549细胞受顺铂和阿霉素诱导的细胞凋亡增加,而p53没有明显作用.流式细胞术显示p73α基因转染后,顺铂诱导的细胞凋亡率从10.6%升高到36.8%(P＜0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率从13.0%升高到41.1%(P＜0.01).克隆形成实验显示,p73α基因转染能明显降低顺铂和阿霉素作用后A549细胞的克隆形成数(P＜0.01),对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为2.0和2.4倍.结论:外源性p73基因的导入增加了wt-p53型A549细胞对顺铂和阿霉素等化疗药的敏感性,该作用可能与p73基因能不依赖于p53基因诱导细胞凋亡有关.p73基因可用于治疗wt-p53不能发挥作用的恶性肿瘤.
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Polo-like激酶1反义RNA对肺癌细胞A549细胞周期的影响
背景与目的:Polo-Like激酶1(Polo-like kinase 1,Plk1)是参与有丝分裂调控的重要分子,已在肺腺癌细胞株A549中检测到Plk1的高表达,并认为Plk1高表达与肺癌患者的放化疗耐受和预后相关.本研究利用反义RNA技术,探讨Plk1基因表达下调对肺癌细胞细胞周期的影响.方法:培养肺腺癌细胞株A549,构建表达Plk1反义RNA的质粒pcDNA3.0-Plk1(pc3.0P),通过脂质体介导转入A549细胞,Western blot、RT-PCR检测Plk1的表达,BrdU脉冲标记和流式细胞术分析细胞周期变化;免疫荧光染色检测α微管蛋白的表达.结果:A549细胞转染pc3.0P后,Plk1 mRNA的表达较对照组显著下降(P＜0.05),转染24 h后Plk1 mRNA的表达下降46.75%,转染48 h后下降61.84%;蛋白表达亦有下降;S期细胞百分数(BrdU标记指数)较对照组明显下降(P＜0.05),转染后48 h仅有25.59%;转染后72 h出现G2/M期阻滞(P＜0.05),并出现细胞凋亡;微管染色显示细胞周边缺乏微管的聚集,单极纺锤体形成.结论:Plk1影响纺锤体微管的形成,使A549细胞增殖速度减慢,细胞周期阻滞并发生凋亡.
关键词： Polo-like激酶1 反义RNA 肺肿瘤 A549细胞 细胞周期 -
低氧对人肺腺癌A549细胞HIF-1α、P53和CyclinD1表达的影响
背景与目的:研究表明低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α ,HIF 1α )是低氧诱导细胞周期阻滞的必需元件,但其具体作用机理及对细胞周期阻滞的影响程度目前尚不清楚.本研究旨在探讨低氧导致肿瘤细胞周期阻滞的作用及机制.材料与方法:将人肺腺癌细胞 A549分成 3组:低氧 12 h组、低氧 24 h组及对照组.低氧组分别在低氧条件下( 37℃, 5% CO2、 2.0% O2饱和度)培养 12 h和 24h,对照组置于正常氧浓度条件下( 37 ℃, 5% CO2、 21% O2饱和度)培养 24 h.流式细胞仪分别测定 3组细胞周期分布及 cyclin D1表达,免疫组织化学 SP法分别测定 3组细胞 HIF 1α及 P53蛋白表达.结果:( 1)低氧 12 h组、低氧 24 h组的 G0/G1期细胞比例分别为( 70.20± 3.33)%、( 82.85± 1.75)%,对照组为( 50.36± 4.09)%,其差异有显著性( F=202.34,P< 0.01); (2)低氧 12 h组、低氧 24 h组、对照组 cyclin D1表达分别为( 80.22± 1.55)%、( 73.65± 2.10)%、( 90.35± 2.68)%,三组间的差异有显著性( F=100.45, P< 0.01); (3)低氧 12 h组、 24 h组 HIF 1α表达为 0.16± 0.02、 0.26± 0.05,对照组 HIF 1α表达为 0.01± 0.00,其差异有显著性 (F=105.28, P< 0.01); (4)低氧组 cyclin D1表达与 G0/G1阻滞呈显著性负相关 (r=0.91,P< 0.01),低氧组 HIF 1α表达与 P53表达呈显著性正相关 (r=- 0.84, P< 0.01),低氧组 HIF 1α表达与 cyclin D1表达呈负显著性相关 (r=- 0.90, P< 0.01), P53表达和 cyclin D1表达呈显著性负相关( r=- 0.78, P< 0.01).结论:低氧使人肺腺癌细胞 A549发生 G0/G1期阻滞, HIF 1α p53 cyclin D1途径在低氧导致人肺腺癌细胞 A549 G0/G1期阻滞中可能起重要作用.
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SOCS3基因转染对人肺腺癌细胞株A549增殖的影响
背景与目的: 已证实在多种肿瘤细胞中存在着持续激活的信号转导与转录活化因子 3( signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)蛋白,持续激活的 STAT3与正常细胞恶性转化及肿瘤细胞恶性增殖密切相关.而新近研究发现的细胞因子信号负调控因子家族( suppressors of cytokine signaling,SOCS)可通过抑制 STAT酪氨酸磷酸化过程从而负性调控 STATs介导的信号通路 ,终影响细胞的存活、增殖和凋亡.但关于 SOCS与肺癌细胞的生物学行为是否相关尚未见报道.本实验拟研究 SOCS家族成员 SOCS3对人肺腺癌细胞株 A549增殖的影响.方法:以脂质体为载体将 pEFSOCS3和 pSV2neo 共转染至人肺腺癌细胞株 A549,应用 RT PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中 SOCS3 mRNA 和蛋白表达, Western blot检测 STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平变化;采用四甲基偶氮唑蓝( MTT)显色法、 3H TdR 掺入法检测基因转染前后细胞增殖情况.结果: RT PCR和免疫细胞化学证实转染后细胞中有 SOCS3稳定表达;与对照组(包括未转染组和转染空载体组)相比,转染组细胞中 STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平显著下降( P< 0.01),转染 pEFSOCS3细胞生长抑制率转染组为 40.58%对照组为 32.23%;转染 pEFSOCS3组细胞 3H TdR掺入量 cpm值 48 056± 1 331较未转染组 81 481± 2 584和转染空载体组 75 590± 2 678显著降低( P< 0.001).结论: SOCS3蛋白可能通过降低 STAT3酪氨酸磷酸化水平,抑制肺癌细胞增殖.
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肿瘤细胞基因转导载体聚乙烯亚胺的合成及筛选
背景与目的:选择合适的载体是基因治疗成功的关键之一,近年来一种新型多聚阳离子化合物--聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为高效低毒的基因转导载体得到广泛重视.本研究应用光化学法制备系列不同粒径的PEI纳米凝胶,初步探讨其转导效率与粒径之间的关系,筛选理想的肿瘤基因转导载体.方法:光化学法制备PEI,光相干光谱仪测定粒径,并用扫描电子显微镜和原子力显微镜表征;以PEI为载体将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)报告基因分别转入Bel7402细胞和A549细胞,荧光显微镜下计数和流式细胞仪检测转染率.结果:光相干光谱仪检测PEI粒径38～200 nm,扫描电子显微镜和原子力显微镜检测其形貌多为球形.荧光显微镜下计数和流式细胞仪检测86.9 nm PEI(4 μg)介导EGFP基因(2 μg)时转染率高,Bel7402细胞分别为(32.75±1.01)%、(32.40±1.41)%,A549细胞分别为(29.81±1.84)%、(30.00±1.86)%;与脂质体相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:光化学法合成的PEI是有效的基因转导载体,PEI粒径为86.9 nm转染为有效.
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镰形棘豆脂溶性生物碱含药血清对人肺癌A549细胞活力、凋亡及周期的影响
目的 研究藏药镰形棘豆脂溶性生物碱(OFLA)含药血清对人肺腺癌A549细胞活力、凋亡及生长周期的影响.方法 将SD大鼠随机分为5组:空白对照组,OFLA低、中、高剂量组(90,135,270 mg·kg-1)和阳性药组(环磷酰胺,36 mg· kg-1),连续给药5d,制备含药血清.采用CCK-8法检测细胞活力;Annexin-VFITC/PI双染法检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期.结果 与空白对照组比较,OFLA各给药组的A549细胞活力在12,24,48 h均明显降低(P＜0.01),不同浓度的OFLA含药血清均对A549细胞的活力有不同程度的抑制作用,呈现剂量依赖性,并且与作用时间呈正相关趋势.作用24 h后,OFLA各给药组均出现不同程度的细胞凋亡,低、中、高剂量组的细胞凋亡率分别为41.1％、57.6％、60.9％,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01,P＜0.001) 与空白对照组比较,OFLA含药血清中、高剂量组的G0/G1期细胞比例显著提高(P＜ 0.05,P＜0.01),S期细胞比例显著降低(P＜0.05).结论 OFLA可以抑制人肺癌A549细胞的活力,诱导细胞凋亡以及延缓细胞周期进程,将细胞生长周期阻滞在G0/G1期.
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白英总碱通过VEGF相关信号通路调控A549细胞的凋亡与周期
目的：基于血管内皮生长因子（VEGF）相关信号通路探讨白英总碱对A549细胞的凋亡与周期的影响。方法设立对照组和白英总碱低、中、高剂量组（50，100，200 mg·L-1），通过流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布情况， Western blot法检测PI3K、 Akt、 Ras、 MAP2、 VEGF蛋白的表达。结果流式细胞术检测白英总碱将该细胞周期阻滞于G2期，呈现剂量依赖性的诱导A549细胞的凋亡，尤其是早期凋亡细胞。 Western blot结果显示，白英总碱均可下调PI3K、 Akt、 Ras、 MAP2、 VEGF蛋白的表达，中、高剂量组各蛋白的相对表达量与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论白英总碱可通过调控VEGF相关信号通路诱导A549细胞的凋亡，阻滞细胞周期于G2期。
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益气除痰方对BALB/c-nu裸小鼠A549肺癌转移的抑制作用及其机制探索
目的研究益气除痰方对BALB/c-nu裸小鼠A549肺癌肿瘤生长及转移的抑制作用并初步探讨其作用机制。方法构建裸鼠A549肺癌移植瘤模型，随机分为空白对照组和益气除痰方组（15.5 g·kg-1·d-1），连续灌胃给药21 d，期间每3天测体质量和瘤体体积；21 d后脱颈处死小鼠，剥取瘤体测瘤质量，计算抑瘤率；摘取肺组织，固定后观察肺表面转移灶个数，计算肺转移抑制率；采用免疫组化法检测瘤体组织上皮间质转化（EMT）标志物及相关信号蛋白表达。结果与空白对照组比较，益气除痰方组小鼠的瘤体体积和瘤质量明显下降（P＜0.05），抑瘤率为27.6%，提示益气除痰方对肿瘤的生长具有一定的抑制作用；益气除痰方组小鼠肺转移结节明显少于对照组（P＜0.05），其转移抑制率为39.6%，提示益气除痰方在体内可抑制肺癌的转移；益气除痰方组瘤体组织的上皮标志蛋白E-cadherin较对照组升高（P＜0.05），而EMT关键标志蛋白vimentin和fibronectin明显下降（P＜0.05），提示益气除痰方可抑制EMT的发生，从而降低肿瘤细胞的侵袭转移能力；益气除痰方组的GRP78、 smad2/3、 SRC、 P38、 ERK、 JNK的表达及其磷酸化激活程度均较对照组下降（P＜0.05），提示益气除痰方抑制肿瘤生长及其抑制EMT的作用可能与其多靶点抑制 GRP78、 smad2/3、 SRC、P38、 ERK、 JNK等信号蛋白有关。结论益气除痰方可抑制肺癌肿瘤细胞的生长并抑制肺癌的转移，其抑制肿瘤转移的机制与其抑制细胞EMT的发生有关。益气除痰方可能通过多靶点的抑制GRP78、 smad2/3、SRC、 MAPK（JNK、 P38、 ERK）等信号通路来实现对EMT的逆转作用。
