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纳米二氧化硅对16HBE细胞存活率及SOD1表达的影响
目的 探讨纳米二氧化硅(nano-SiO2)对人支气管上皮细胞(16HBE细胞)存活率和超氧化物歧化酶1(Superoxide Dismutase 1,SOD1)表达的影响.方法 以质量浓度为0～100 mg/L nano-SiO2处理16HBE细胞24 h,以CCK-8法检测细胞存活率,筛选合适的后续实验处理剂量.将16HBE细胞分为6组:溶剂对照组(予等体积溶剂处理)、微米SiO2对照组(予质量浓度为20 mg/L微米SiO2处理),5、10和20 mg/L nano-SiO2组(予相应终质量浓度的nano-SiO2处理),姜黄素组(先予终浓度为10 μmol/L的姜黄素处理2h,再予终质量浓度为20 mg/L的nano-SiO2处理).各组细胞经处理后,分别于培养4、12和24 h时间点收获细胞.采用荧光实时定量聚合酶链式反应检测细胞中SOD1 mRNA的相对表达水平,以蛋白免疫印迹法检测SOD1蛋白的相对表达水平.结果 随着nano-SiO2处理剂量的增加,细胞存活率下降,呈剂量-效应关系,有统计学意义(P＜0.01).在12和24 h时间点,nano-SiO2刺激后,16HBE细胞的SOD1的mRNA和蛋白相对表达水平均出现剂量依赖性下降(P＜0.01);与同时间点溶剂对照组比较,10和20 mg/L nano-SiO2组16HBE细胞的在上述2个时间点的SOD1 mRNA和蛋白相对表达水平均下降,差异有统计学意义(P＜0.05).在4、12和24 h时间点,20 mg/L nano-SiO2组16HBE细胞的SOD1 mRNA和蛋白相对表达水平均低于同时间点的微米SiO2对照组(P＜0.05),姜黄素组16HBE细胞的上述2个指标均高于20 mg/L nano-SiO2组(P＜0.05).结论 nano-SiO2刺激可导致16HBE细胞存活率下降并呈剂量依赖性;SOD1表达的下调可能是nano-SiO2致16HBE增殖抑制的机制之一.姜黄素对nano-SiO2诱导16HBE细胞损伤具有一定的保护作用.
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N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍对人支气管上皮16HBE细胞周期进程的影响
目的 探讨N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)对人支气管上皮16HBE细胞周期进程的影响及相关分子机制。方法 16HBE细胞经MNNG处理后，噻唑蓝(MTT)法检测MNNG对16HBE细胞增殖的影响，PI染色检测细胞凋亡，Hoechst 33342和PI双染检测细胞坏死，流式细胞术检测细胞周期分布，在周期变化明显的时点应用蛋白免疫印记检测周期相关蛋白含量变化。结果 MNNG能够剂量依赖性的抑制细胞增殖和诱导凋亡，亚致死剂量的MNNG使细胞引起明显的S期和G2/M期阻滞，同时细胞周期相关蛋白p-Cdk2(Thr160)和Cdc25A含量下降明显。结论 MNNG通过降低细胞p-Cdk2(Thr160)和Cdc25A的含量诱导16HBE细胞发生S期和G2/M期阻滞。
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PARG基因沉默在六价铬诱导细胞周期改变中的作用
目的 深入了解PARG的功能及探讨PARG基因沉默在调节六价铬诱导细胞周期改变的作用.方法 使用前期构建的PARG基因缺陷细胞(shPARG细胞)和正常16HBE细胞作为研究对象,进行0、0.3、0.6、1.2、2.5和5.0 μmol/L的六价铬[Cr(Ⅵ)]溶液染毒处理24 h,利用免疫荧光法检测PAR的表达、流式细胞仪观察细胞周期、RT-PCR分析ATM和P53基因mRNA水平的表达.结果 Cr(Ⅵ)染毒处理后,正常16HBE细胞的S期明显延长,0、0.3、0.6、1.2、2.5和5.0μmol/L剂量组S期细胞比例分别为18.3％、21.6％、26.0％、30.9％、38.8％和43.2％,G2期明显缩短;shPARG细胞的S期延长,但比例增幅远小于正常16HBE细胞,0、0.3、0.6、1.2、2.5和5.0 μmol/L剂量组S期细胞比例分别为17.0％、19.0％、20.1％、21.2％、24.5％和31.3％.正常16HBE细胞内P53基因表达随Cr(Ⅵ)作用剂量的增加而逐渐升高,PARG缺陷细胞内P53基因表达改变不明显(与对照组相比,P＞0.05);Cr(Ⅵ)染毒处理后,两种细胞内ATM基因的表达均增加,但正常16HBE细胞内增加更明显,如:5.0 μmol/L的Cr(Ⅵ)作用时,正常16HBE细胞内ATM基因的表达升高可达6.67倍(与对照组相比,P＜0.01),而shPARG细胞内ATM基因表达仅升高2.27倍(与对照组相比,P＜0.01).结论 PARG基因沉默可对抗Cr(Ⅵ)诱导的细胞周期时相改变.
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表皮生长因子受体在苯并(a)芘致肺肿瘤中的表达变化
目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)在苯并(a)芘(BaP)致肺肿瘤中的表达变化.方法 利用课题组前期构建的BaP诱导的人支气管上皮细胞恶性转化模型(BTC)作为研究对象,采用细胞免疫荧光和Western blot法分析比较恶性转化细胞(BTC细胞)和同期未转化对照组细胞(16HBE细胞)中的EGFR蛋白表达变化.将健康雌性SPF级SD大鼠36只,将其以单纯随机法分为2组,每组18只.染毒组以肺穿刺法注射10 mg/ml玉米油-BaP,每只浓度0.2 ml,构建SD雌性大鼠肺肿瘤模型,收集肺脏组织,利用组织免疫荧光和Western blot法分析肺脏组织中EGFR蛋白的表达变化.采用t检验对EGFR蛋白相对灰度值进行分析.结果 细胞免疫荧光结果显示,与正常16HBE细胞比较,BTC细胞中EGFR蛋白的荧光强度较高;进一步利用Western blot检测EGFR的蛋白表达发现,对照组相对灰度值为1.04±0.13,BTC细胞的相对灰度值为2.32±0.12,BTC细胞的EGFR蛋白的表达水平较高,差异有统计学意义(t=12.39,P<0.001).SD大鼠肺肿瘤模型检测发现,染毒组大鼠肺组织存在弥漫性的肺泡间隔增厚、肺泡壁破坏以及肺泡融合等,肺组织内可见较大肿块,病理学分析为未分化细胞癌,提示肺肿瘤模型建立成功.免疫荧光结果显示,与对照组相比,BaP诱导的动物肺癌模型的肺组织中EGFR的荧光强度明显增强;Western blot分析结果证实,对照组和染毒组EGFR蛋白的相对灰度值分别为0.21±0.03、1.30±0.07,染毒组动物肺肿瘤组织中EGFR蛋白的表达水平高于对照组,差异有统计学意义(t=12.84,P<0.001).结论 在BaP致癌模型中,EGFR蛋白表达上调,EGFR在BaP致癌中可能发挥重要作用.
关键词： 苯并芘 肺肿瘤 表皮生长因子受体蛋白 16HBE细胞 -
hTIM-3对经屋尘螨或/和地塞米松处理16HBE细胞株炎症相关因子表达的影响
目的 研究T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白3(简称TIM-3)对人气道上皮细胞株16HBE经屋尘螨或/和地塞米松处理后炎症相关因子表达的调控. 方法 实验分两组,分别为转染pEGFP-C2和pEGFP-C2-hTIM-3的16HBE细胞株.两组细胞株分别用一定浓度的屋尘螨或/和地塞米松处理.提取细胞mRNA并逆转录为cDNA采用实时荧光定量PCR检测转染细胞hTIM-3、IFN-γ、TNF-α和GATA-3 mRNA表达水平;分析hTIM-3对经屋尘螨或/和地塞米松处理的16HBE细胞株炎症相关细胞因子表达的调控及其机制. 结果 实时荧光定量PCR显示,屋尘螨或/和地塞米松处理,转染pEGFP-C2-hTIM3质粒的16HBE细胞株TIM-3、IFN-γ、TNFα mRNA的表达与相应处理的转染pEGFP-C2质粒16HBE细胞比较差异均有统计学意义(P＜0.01),但GATA-3 mRNA表达无明显变化(P＞0.05).在转染pEGFP-C2-hTIM3质粒的16HBE细胞株,TIM-3 mRNA的表达与IFN-γ mRNA的表达呈正相关,与TNF-αmRNA的表达呈负相关,而在转染pEGFP-C2质粒的16HBE细胞未存在相关性. 结论 在16HBE细胞中,TIM-3的上调可能上调IFN-γ的表达,下调TNF-α的表达.
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扶正解毒含药血清对硫酸镍诱导人支气管上皮细胞转化的抑制作用
目的 观察中药复方扶正解毒含药血清(FJD)对硫酸镍(NiSO4)诱导培养人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化的抑制作用.方法 NiSO4多次处理16HBE细胞,利用刀豆凝集素A(ConA)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性鉴定;同时添加不同剂量的FJD,观察其抗转化效应.结果 NiSO4(400 μmol/L)染毒8次(20代)时,细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,出现复层生长,可被ConA凝集,并可在软琼脂上生长.3种剂量FJD与NiSO4共处理组细胞转化率分别为0.82%、0.47%和0.19%,明显低于单用NiSO4组(4.13%),且呈剂量-效应关系(r=-0.884,P<0.01),细胞ConA凝集反应阴性,不能在软琼脂上生长.结论 体外实验显示,FJD具有抑制NiSO4诱导16HBE细胞恶性转化的作用.
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马尾松针提取物对镉毒16HBE细胞保护作用
目的 研究马尾松松针提取液对氯化镉(CdCl2)致16HBE细胞毒性的保护作用.方法 用萃取法提取马尾松松针乙醇提取物(PMNE),分别用1、100和500 μg/mL的PMNE(低、中、高浓度组)预处理16HBE细胞6h,随后用25 μmol/L CdCl2毒染至48 h,同时设阴性对照组(正常培养16HBE细胞)及空白对照组(无细胞组),用CCK8法检测细胞相对生存率,硫代巴比妥酸(TBA)法检测各组细胞内丙二醛(MDA)含量,qPCR法检测各组细胞凋亡相关基因Bcl-2及Bax相对表达量.结果 与阴性对照组相比,CdC12单独作用组细胞相对生存率下降(P＜0.05),细胞内MDA表达量升高(P＜0.05);低、中、高浓度PMNE预处理组细胞与CdCl2单独处理组相比,细胞相对生存率均升高(P＜0.05),MDA含量均降低(P＜0.05),且浓度越高细胞相对生存率越高(P＜0.05),MDA含量越低(P＜0.05).与CdCl2单独作用组相比,低、中、高浓度PMNE预处理组抑凋亡基因Bcl-2相对表达量均上调(P＜0.05),促凋亡基因Bax相对表达量均下调(P＜0.05),且浓度越高Bcl-2相对表达量越高(P＜0.05).结论 PMNE对CdCl2所致的细胞毒性有一定程度的保护作用.
关键词： 马尾松 松针提取液 16HBE细胞 氯化镉(CdCl2) -
中药添加剂降低烟气悬凝物诱导16HBE细胞TNF-α、IL-8及气道黏液蛋白基因mRNA高表达的实验研究
目的:研究中药添加剂降低烟气悬凝物诱导16HBE细胞TNF-α、IL-8及MUC5AC mRNA高表达的作用.方法:CCK-8法检测细胞活力,RT-PCR法检测TNF-α、IL-8及MUC5AC mRNA表达水平.结果:CSC染毒后细胞活力下降,TNF-α、IL-8及MUC5AC mRNA表达水平升高.中药添加剂组细胞活力高于普通烟组,mRNA表达水平有所下降.结论:中药添加剂具有抑制CSC诱导16HBE细胞活力下降及TNF-α、IL-8及MUC5AC mRNA高表达的作用.
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中药添加剂降低烟气悬凝物诱导16HBE细胞损伤的实验研究
目的:观察中药添加剂降低烟气悬凝物诱导16HBE细胞损伤的作用.方法:使用人类支气管上皮细胞系16HBE细胞,建立细胞烟气悬凝物染毒模型,检测染毒后细胞活力,氧化应激水平,TNF-α、IL-8分泌情况.结果:烟气悬凝物染毒后,细胞活力下降,氧化应激水平升高,TNF-α、IL-8分泌增加.含中药添加剂组烟气悬凝物染毒后细胞活力高于普通烟组,LDH释放及氧化应激水平降低,TNF-α、IL-8分泌减少.结论:烟气悬凝物染毒16HBE细胞可致细胞活力下降及氧化应激水平升高,细胞因子分泌增加,中药添加剂可缓解以上情况.
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纳米二氧化硅对16 HBE细胞存活率及PARP-1表达的影响
目的 探讨纳米二氧化硅(SiO2)对人支气管上皮细胞(16HBE细胞)存活率和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)表达的影响.方法 ①以质量浓度为0～100 mg/L纳米SiO2处理16HBE细胞24.0 h,以CCK-8法检测细胞存活率.②将16HBE细胞分为6组:溶剂对照组(予等体积溶剂处理)、微米SiO2对照组(予终质量浓度为20 mg/L微米SiO2处理),5、10、20 mg/L纳米SiO2组(予相应终质量浓度的纳米SiO2处理),姜黄素组(先予终浓度为10μmol/L的姜黄素处理2.0 h,再予终质量浓度为20 mg/L的纳米SiO2处理).各组细胞经处理后,分别于培养4.0、12.0和24.0 h时间点收获细胞.采用荧光实时定量聚合酶链式反应检测细胞中PARP-1 mRNA的相对表达水平,以免疫印迹法检测PARP-1蛋白的相对表达水平.结果 ①随着纳米SiO2处理剂量的增加,细胞存活率下降,呈剂量-效应关系(P<0.01).②在12.0和24.0 h时间点,纳米SiO2刺激后,16HBE细胞的PARP-1 mRNA和蛋白相对表达水平均出现剂量依赖性下降(P<0.01);与同时间点溶剂对照组比较,5、10、20 mg/L纳米SiO2组16HBE细胞在该2个时间点的PARP-1 mRNA和蛋白相对表达水平均下降(P<0.05).在12.0和24.0 h时间点,20 mg/L纳米SiO2组16HBE细胞的PARP-1 mRNA和蛋白相对表达水平均低于同时间点的微米SiO2对照组(P<0.05);姜黄素组16HBE细胞的12.0 h时间点上述2个指标均高于20 mg/L纳米SiO2组(P<0.05).结论 纳米SiO2刺激可导致16HBE细胞存活率下降并呈剂量依赖性;PARP-1表达的下调可能是纳米SiO2致16HBE增殖抑制的机制之一.姜黄素对纳米SiO2诱导的16HBE的细胞损伤具有一定的保护作用.
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人γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因E-box元件功能初步分析
目的:探讨人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列E-box元件的功能.方法:利用PCR法克隆人GCLC基因上游调控序列,PCR重叠延伸法对2个E-box元件分别和同时进行定点突变.扩增获得的突变体片段克隆入PMD18-T载体,DNA测序鉴定后,亚克隆入野生型GCLC*Luc荧光素酶报道载体.将3个突变体质粒和野生型质粒转染人肺泡上皮细胞A 549和人支气管上皮细胞16HBE,检测转染后细胞荧光素酶活性值.结果:测序结果证实,成功将E-box1 CACGC,G突变为AGCGGG;E-box2 CACGTG突变为CACG93A.GCLC-Luc、GCLC-mEbox1-Luc(突变E-box1)、GCLC-mEbox2-Luc(突变E-box2)、GCLC-mEbox12-Luc(突变E-box1和E-box2)转染A549细胞后荧光素酶活性值分别为(5 197 852±132 206)U、(5 455 692±127 431)U、(5 315 722±244 197)U、(5 174 303±183 179)U,转染16HBE细胞后荧光素酶活性值分别为(141 157±18 907)U、(126 454±23 724)U、(137 315±22 179)U、(132 441±28 970)u.经过统计学分析,各组荧光酶活性没有显著差别,均P>0.05.结论:E-box元件不参与基础状态下A549细胞和16HBE细胞GCLC基因转录调控.
关键词： 16HBE细胞 A549细胞 基因 GCLC γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 -
姜黄素通过调控PPARγ/NF-κB信号通路减轻CSE诱导的人气道上皮细胞氧化应激反应
目的 探讨姜黄素对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人气道上皮16HBE细胞氧化应激和炎症反应的抑制作用及相关的分子机制.方法 使用shRNA-PPARγ(shPPARγ)转染人气道上皮16HBE细胞下调PPARγ表达.将16HBE细胞分为5组即对照组、姜黄素组、CSE组、CSE+姜黄素组和CSE+姜黄素+shRNA-PPARγ组.在0 h和24 h时使用MTT法对细胞活性进行检测;干预24 h后使用qPCR对细胞TNF-α、iNOS和PPARγmRNA表达进行检测,采用western blot检测16HBE细胞中iNOS、PPARγ蛋白表达以及NF-κB p65磷酸化水平.结果 16HBE细胞在干预24 h后各组之间细胞活性未有明显统计学差异(P>0.05).与对照组相比较,CSE干预24 h后PPARγ表达水平明显降低,TNF-α、iNOS表达及NF-κB p65磷酸化水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).但CSE组较CSE+姜黄素组和CSE+姜黄素+shPPARγ组PPARγ表达水平下降以及TNF-α、iNOS表达和NF-κB p65磷酸化水平升高更显著,差异均有统计学意义(P<0.05);且CSE+姜黄素+shPPARγ组较CSE+姜黄素组PPARγ表达水平下降以及TNF-α、iNOS表达和NF-κB p65磷酸化水平升高更明显,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 姜黄素可以通过抑制PPARγ/NF-κB信号通路减轻CSE诱导的人气道上皮16HBE细胞的炎症反应及氧化应激.为姜黄素应用于慢性阻塞性肺疾病等疾病的临床治疗奠定了理论基础.
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人支气管上皮hsa-miR-148a-3p低表达细胞株的建立
目的：建立稳定的hsa-miR-148a-3p低表达人支气管上皮细胞株(16HBE)。方法：根据miRBase中提供的序列信息设计hsa-miR-148a-3p tough decoy RNA(TuD RNA)，并将其连接到慢病毒载体pLKO.1-puro上。将重组慢病毒载体转染至293FT细胞并包装为慢病毒后，收集病毒上清，感染正常16HBE细胞。用嘌呤霉素筛选出has-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞株，通过荧光定量PCR对其进行鉴定，然后对筛选出的细胞分别采用荧光定量PCR和Western blot检测DNA甲基转移酶1(DNMT1) mRNA和蛋白的表达水平。结果：测序结果表明含hsa-miR-148a-3p TuD RNA的重组慢病毒载体构建成功；荧光定量PCR检测显示has-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞株has-miR-148a-3p的表达量比正常16HBE细胞低44%(P<0.01)，其作用靶基因DNMT1的mRNA和蛋白表达水平分别为正常细胞的3.4倍和2.0倍(P均<0.01)。结论：成功建立hsa-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞，hsa-miR-148a-3p的低表达能提高DNMT1 mRNA和蛋白的表达水平。
