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端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌细胞 A549 端粒的影响
目的 探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译及对端粒缩短和细胞周期的作用.方法 将A549细胞随机分组为空白对照、sTANKS、shTERT、asTANKS、ashTERT 和 asTANKS+ashTERT组,经不同处理,检测 hTERT mRNA、端粒酶及端锚酶活性、端粒平均长度及A549 细胞寿命.结果 ashTERT能抑制hTERT mRNA表达及蛋白质活性;asTANKS不影响hTERT mRNA表达,却能抑制端锚酶活性.asTANKS或ashTERT均可致A549端粒长度缩短,asTANKS+ashTERT则缩短更为明显,其减少A549细胞平均传代数的作用也明显大于asTANKS或ashTERT.结论 asTANKS对A549端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,不仅能通过影响端锚酶活性缩短肿瘤细胞 A549 端粒的平均长度,而且可与端粒酶抑制剂协同作用明显缩短肿瘤细胞的生存周期,这可能成为抗癌作用的新靶点.
关键词： 端粒长度 端锚酶 端粒酶 反义寡核苷酸 人肺腺癌A549细胞 -
端锚酶反义寡核苷酸联合反义端粒酶催化亚单位对人肺腺癌A549细胞端粒动力学的影响
背景与目的:端锚酶是真核生物体内的一种重要的功能蛋白,对调节细胞端粒长度及参与细胞衰老和永生化过程起着重要的作用.本研究探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译的影响,以及对端粒缩短效能和细胞周期的作用.方法:将培养的A549细胞分为空白对照组、端锚酶正义寡核苷酸对照(tankyrase sense oligonucleotide,sTANKS)、端粒酶催化亚单位正义寡核苷酸对照组(human telomerase reverse transcriptase sense oligonucleotide,shTERT)、端锚酶反义寡核苷酸实验组(tankyrase antisense oligonucleotide,asTANKS)、端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸实验组(human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide,ashTERT)、端锚酶及端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸联合实验组(asTANKS+ashTERT).分别与不同的正、反义寡核苷酸作用,采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法观察端粒酶催化亚单位的mRNA表达,ELISAPCR法测定端粒酶活性,Western blot法观察端锚酶活性,Q-FISH法检测各组端粒的平均长度;并通过传代实验观察不同正、反义寡核苷酸对A549细胞传代寿命的影响.结果:ashTERT能明显抑制端粒酶催化亚单位的mRNA表达及蛋白质活性,不影响端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.59±0.07)kb];细胞在经过56.92±0.46个倍增时间(population double,PD)连续培养终止.asTANKS不影响端粒酶催化亚单位mRNA表达及蛋白质活性,却能明显抑制端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.33±0.09)kb];细胞在经过(53.33±0.57)PD连续培养终止.ashTERT+asTANKS联合作用同时抑制端粒酶和端锚酶.其细胞平均端粒长度缩短更为明显[(3.55±0.08)kb],流式直方图上FITC荧光"左偏"更显著,与ashTERT、asTANKS比较差异有显著性(t=37.33、32.50,P＜0.001);ashTERT+asTANKS组细胞在经(24.53±0.40)PD后培养终止,与ashTERT、asTANKS比较差异也有显著性(t=53.38、43.39,P＜0.001).结论:端锚酶反义寡核苷酸对A549细胞端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,它不仅能通过影响端锚酶活性,缩短A549细胞端粒的平均长度,而达到缩短肿瘤细胞生存寿命的目的;而且可与端粒酶抑制剂产生协同作用,明显缩短肿瘤细胞的生存周期,可能成为抗癌作用的新靶点.
