首页 > 文献资料
-
卵母细胞和卵巢组织的冷冻
精子冻存已取得了一定的成功,但是冻存的卵母细胞体外发育的成功率很低,因为卵母细胞冻存与许多因素有关,成熟的卵母细胞对冻存非常敏感,很容易出现非整倍体现象.为了提高卵母细胞的受精率,人们已着手研究不成熟卵母细胞及卵巢的冻存.要建立一个方法,使生长完全的生殖泡(germinal vesicle,GV)和MII卵母细胞暴露于与冻存有关的物理和化学逆境后,仍然具有很高的存活率、受精率和发育率.目前还没有一个简单可行的冻存方法,而且主要困难在于如何使原始卵泡中的未成熟卵母细胞发育为成熟的卵母细胞.
-
简便高效的原代HUVECs培养
目的 建立简便高效的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外分离、培养、冻存方法 ,以获得大量HUVECs为相关医学基础研究及组织工程学提供良好细胞来源.方法 新鲜脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶消化,获得HUVECs,内皮细胞培养基(ECM)进行培养.倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学、RT-PCR检测VWF、CD144的表达.HUVECs加入10%甘油的冻存液,置于液氮保存4周,冻存复苏后Western blot检测VWF、CD144蛋白水平的表达.结果 HUVECs体外生长2～3 d可铺满单层,细胞呈梭形,漩涡状排列牛长,传代后可见管腔样结构;高表达VWF和CD144;冻存后复苏的细胞分裂增殖旺盛,蛋白水平高表达VWF、CD144.结论 脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可获取大量高纯度的内皮细胞,可作为相关研究良好的细胞来源.
-
山东赛乐中德生物科技有限公司招标公告
1.招标人:山东赛乐中德生物科技有限公司 2.招标工程名称:山东赛乐中德生物科技有限公司 3.工程建设地点:山东省青岛市经济技术开发区中德生态园区 4.供应商须知:我公司从事免疫细胞冻存和细胞免疫治疗业务,土建工程目前已完成,现进入GMP实验室、细胞冻存库装修及设备采购阶段,欢迎各供应商参与工厂建设.
-
改良外周血造血干细胞冷冻保存剂的临床应用
自体外周血造血干细胞移植近年来在国内外得到广泛应用，已成为治疗恶性血液病和多种实体瘤的有效方法。造血干细胞冻存技术的应用，使患者有充裕的时间选择佳预处理方案进行造血干细胞移植，体外保存过程中有效地保证造血干细胞的活力是移植成功的关键，冻存干细胞的效率高低直接影响移植成功率。经典外周血造血干细胞深低温冷冻保护剂多使用10%二甲基亚砜和人血白蛋白，但存在一定风险[1]，我们改良了细胞冻存保护剂对13例患者进行32次自体外周血造血干细胞采集后冷冻保存，取得较好的临床效果，现总结如下。
-
丹参对大鼠胰岛获取和冻存及体外培养影响的实验研究
胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病较理想方法,移植成功的关键是胰岛足够数量和良好功能.细胞冻存是收集足够胰岛、建立胰岛库的可行手段[1～3].但冻存复苏过程可引起细胞的破坏和死亡,使细胞数量减少、活性及功能降低[4].本实验探讨丹参[5]能否有益于胰岛获取及冻存前后的存活和功能,及其作用的可能机制.
-
卵丘细胞对成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存及临床妊娠结局的影响
随着体外受精-胚胎移植等辅助生殖技术的发展,低温保存技术的作用越来越重要.由于卵母细胞本身所特有的一些生物学特性,使其冷冻效果尚不能像胚胎冷冻一样大规模地用于临床.影响卵母细胞冻存的因素很多,卵丘细胞的存在能否有效改善卵母细胞冷冻保存效果,各研究结果存在较大差异[1-3].本研究回顾性分析保留卵丘细胞对成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存、胚胎发育及临床妊娠结局的影响,现将结果报道如下.
-
低温冷冻对角膜缘干细胞生物学特性的影响
目的 评价低温冷冻保存对体外培养兔角膜缘干细胞生物学特性的影响.设计实验研究.研究对象新西兰白兔.方法 新西兰白兔20只(40眼),制备2 mm周边角膜和2 mm球结膜的环形浅层角膜缘植片,待形成细胞单层后,将培养的细胞低温冻存1个月,然后复苏培养.将未冻存的细胞和冻存复苏后的细胞采用免疫细胞荧光染色、流式细胞仪检测,鉴定培养细胞的生物学特性,通过倒置显微镜、MTT比色法比较传代培养的角膜缘干细胞低温保存前后的形态结构和特性.主要指标角膜缘干细胞活性及生物学特性.结果 显微镜下观察冻存复苏后的细胞,与未冻存细胞相比,细胞状态差,贴壁时间晚,核浆比变小,形态不规则;免疫荧光细胞染色检测ABCG2单克隆抗体阳性率未冻存细胞为81.7%,低温冻存细胞降至46.9%,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测低温冻存细胞与未冻存细胞角膜缘干细胞占总细胞的比例分别为0.90%和2.43%,差异有统计学意义(P<0.05);MTT法检测低温冻存的细胞比未冻存细胞增殖活性降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 低温冻存后角膜缘干细胞的活性和生物学特性均受到严重影响,其冻存方法和复苏技术有待进一步改进.
-
促性腺激素释放激素类似物对卵巢肿瘤化疗患者卵巢功能的保护作用
卵巢肿瘤已成为严重威胁妇女生命和健康的主要疾病，虽然化疗药物的应用使得各种肿瘤治愈率得到提高，但其所带来的并发症也令众多临床医师不可小觑。其中，以卵巢生殖细胞肿瘤尤甚，青春期前患者可占60％~90％。然而，在女性生殖系统中，卵巢对化疗药物敏感，长期大剂量的化疗会破坏卵巢组织，引起卵巢功能障碍，使得女性患者出现卵巢早衰（premature overy failure，POF），育龄妇女丧失生育功能。因此，采用药物化疗需考虑保护患者的卵巢功能。目前常用的方法有卵母细胞的冷冻保存、胚胎的冷冻保存、卵巢组织的冷冻保存及移植、口服避孕药以及促性腺激素释放激素类似物等。其中，卵母细胞冻存存在以下缺点：成熟卵母细胞冻存过程中极易受损，存活率低；未成熟的卵母细胞冻存后需要体外培养至成熟，成熟率低，且需要冻存前促排卵，高雌激素水平可能刺激恶性肿瘤的生长及促排卵的过程有可能延误治疗时机，同时也不适用于青春期前患者；胚胎的冻存亦需要冻前超促排卵，且不适用于儿童及无配偶又不接受精子库供精的患者；卵巢组织的冻存则有携带原发肿瘤细胞的危险及化疗后何时移回体内、移植部位等有待进一步研究；口服避孕药存在卵巢保护疗效不确切等缺点。在众多的卵巢保护策略中，促性腺激素释放激素类似物（gonadotropinre-leasing hormone analogues，GnRH-a）因其经济、安全、有效、操作简单等优点迅速成为卵巢保护研究者的研究热点。本文就GnRH-a的作用机制、特点及其在卵巢癌治疗研究中的应用作一综述。
-
果糖和二硫苏糖醇对骨髓间充质干细胞冻存后活性及多能性的影响
背景：冻存是保证干细胞临床应用的关键步骤之一，但现有冻存技术常导致细胞活性降低、多能性丧失及分化能力下降。
目的：探究果糖及二硫苏糖醇是否有助于维持冻存后骨髓间充质干细胞多能性及成骨分化潜能。
方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，在细胞冻存前分别用果糖(200μmol/L)，二硫苏糖醇(500μmol/L)及果糖(200μmol/L)+二硫苏糖醇(500μmol/L)预处理1 h。冻存6个月后，复苏细胞并用倒置显微镜观察细胞形态，MTT实验检测细胞活性，定量PCR检测相关干性基因(Nanog，Oct4及Sox2)的表达，碱性磷酸酶活性测试及茜素红染色检测复苏骨髓间充质干细胞成骨分化能力。
结果与结论：①复苏后各组细胞在形态上无明显差别；②果糖预处理及联合预处理有助于骨髓间充质干细胞活性维持；③二硫苏糖醇预处理可显著促进骨髓间充质干细胞多能性相关基因Nanog及Sox2的表达；④果糖、二硫苏糖醇及联合预处理皆有助于维持骨髓间充质干细胞成骨分化潜能，但以二硫苏糖醇及联合预处理组效果佳；⑤结果表明，果糖预处理有助于维持冻存骨髓间充质干细胞活性，二硫苏糖醇有助于维持冻存骨髓间充质干细胞多能性及成骨分化能力。 -
骨骺软骨细胞的培养和保存方法
目的建立大量生产骨骺软骨细胞的培养方法和保存方法,为组织工程骺软骨的培养提供种子细胞.方法2周龄兔胫骨上端骨骺软骨经机械剪切和化学消化后,接种、培养及液氮冻存.通过显微镜观察其生物学表现,并通过蕃红花"O"染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色对其生物学特征进行鉴定.结果在体外观察到了骨骺软骨细胞从静止、增殖到肥大这个近似体内的生长过程,经多次传代后增殖能力降低,经过冻存的细胞生物学特征不变.蕃红花"O"和Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.结论我们成功地建立了骨骺软骨细胞的培养和冻存方法,并证明培养出的细胞是骨骺软骨细胞.
-
人类卵母细胞冻存的临床应用
人类成熟卵母细胞是体内大的细胞,直径约120μm左右.与精子和植入前4～8细胞阶段胚胎相比,冻融过程对卵母细胞更容易造成损伤.自1948年利用甘油作冷冻保护剂冻存牛精子获得成功后,直至1972年冻融小鼠胚胎才获子代出生.1983年,人类第一例冻融胚胎"试管婴儿"诞生.迄今在辅助生殖技术中冻存人类精子及植入前胚胎已广为应用,而冻存人类卵母细胞的研究及临床应用则缓慢得多.虽然,1986年Chen[1]首先采用与冻融人类胚胎基本相同的慢冻方法获得世界首例由冻卵而出生的婴儿,但由于冻融卵母细胞受精率低下,直至1995年卵母细胞胞浆内单精子注射技术(ICSI)应用于冻融后卵母细胞,随后才陆续有较多经冻卵出生婴儿的报道.但经慢冻快融卵母细胞出生婴儿迄今也不足100例.1999年,澳大利亚学者Kuleshova等[2]首先报道应用乙二醇作细胞内冷冻保护剂,开放麦管作支架快速冻融人卵母细胞获得1例赠卵"试管婴儿"活婴分娩,提示了玻璃化快速冷冻技术在冻存人卵母细胞可能的应用前景及其优越性,至今,相关全世界报道已有近20例左右.祖国大陆于去年开始有经玻璃化方法冻卵后出生婴儿的报道.本文将就卵母细胞冻融的损伤及应用前景作一简要回顾.
-
超速玻璃化法冻存小鼠肝细胞球形聚集体的初步研究
现有的肝细胞冻存法是将分散的肝细胞用于冻存.从肝组织消化分离的肝细胞,其细胞完整性和功能都会受影响.有报道用肝细胞球形聚集体培养,效果优于用分散肝细胞培养[1].玻璃化法冻存细胞组织,由于不形成冰晶,对细胞损伤较小,已成功用于冻存胚胎、卵巢、胎肝组织和脑细胞[2-5].本研究将小鼠肝细胞预培养成球形聚集肝细胞,用改进的超速玻璃化法冻存,解冻后与含胶原培养液混合、培养,通过检测培养上清液中ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH)浓度判断肝细胞受损漏出情况,检测白蛋白( Alb)浓度判断肝细胞合成功能.对照组用单层贴壁培养分散肝细胞做同样冻存和检测.
-
人结合上皮细胞体外培养与冻存方法的改良
目的:改良人结合上皮(junctional epithelium,JE)细胞的分离培养及冻存方法.方法:取正畸拔除的牙周组织健康的前磨牙,沿龈缘剪去冠方1mm左右的沟内上皮,用无菌11号刀片紧贴牙面刮下、剪碎JE组织,简化培养操作步骤.取第2代JE细胞,加入冻存液,按设定的降温程序(从0℃开始,以每分钟下降1.5℃速度下降至-18℃,保持5min;再以每分钟下降20℃的速度降至-80℃,然后投入-196℃液氮罐)冻存细胞,40℃水浴复苏,进一步研究JE细胞的形态、增殖、鉴定及复苏后存活率等生物学活性.结果:不用Dispase冷消化,采用0.1%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化,同样可成功地培养人JE细胞;JE细胞复苏后的存活率为(93.87+3.11)%,生长状况良好,与第2代细胞相似;免疫细胞化学染色显示,培养的JE细胞角蛋白-19(cytokeratin-19.CK19)表达强阳性,而波形丝蛋白(vimentin)表达也为阳性.结论:改良的JE分离培养与冻存方法可行,JE表型在体内和体外并非完全一致,可能与细胞生长的底物有关.
-
人真皮淋巴管内皮细胞的分离及冷冻保存
目的 建立分离培养人真皮淋巴管内皮细胞(LECs)及其冷冻保存技术.方法 采用中性蛋白酶及胶原酶消化结合免疫磁珠方法,分选CD34-/CD31+细胞.所获内皮细胞进行体外培养,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定证实为LECs.采用梯度降温法冻存内皮细胞,经复苏后进行形态学观察, 以台酚蓝试验、MTT试验、流式细胞术细胞检测等方法鉴定细胞生物学特性.结果 中性蛋白酶及胶原酶消化方法结合免疫磁珠分选,可从真皮组织获取高纯度的LECs.与新鲜细胞相比,复苏的内皮细胞活力保持在92%以上.复苏后的内皮细胞形态学、生物学特性及生长曲线与新鲜细胞差异无统计学意义.冻存内皮细胞的凋亡率较新鲜内皮细胞高,为(9.15±0.34)% vs(5.31±0.23)%,但无统计学差异(P＞0.05).结论 中性蛋白酶及胶原酶消化结合免疫磁珠分选,可获取足够数量及纯度的LECs;冻存的内皮细胞复苏后无明显形态学改变,并保持较高的活力及体外增殖能力;可作为种子细胞来源,为淋巴管系统发育和新生研究提供方便.
-
人脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存的技术
目的研究分离、培养、扩增人脐静脉内皮细胞及进行冷冻保存技术,探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性.方法新鲜脐带42条,脐静脉内灌注消化酶消化,获得内皮细胞;以含20%的胎牛血清M199液进行培养.采用Ⅷ因子免疫荧光染色及扫描电镜检查,鉴定所获内皮细胞及其纯度;内皮细胞加入含10%DMSO冷冻保存液,置于液氮进行保存,复苏后进行锥虫蓝试验,四氮唑盐(MTT)试验以及细胞凋亡的流式细胞仪检测.结果血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞,与未冻存细胞相比,复苏的细胞活力保持在95%以上.复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异.冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高,但无统计学意义.结论脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞.冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力,可作为制备组织工程学血管的种子细胞来源.
-
肿瘤细胞原代培养与保存
肿瘤细胞原代培养技术可为日益深入的肿瘤研究及治疗提供充足有效的细胞来源,是癌症在体外研究的重要手段,与体内研究相辅相成.但目前肿瘤细胞原代培养成功率不高,许多问题还需继续探讨与研究.全文综述目前国内外肿瘤原代培养方法、条件及冻存注意事项,包括:肿瘤组织类型与处理、细胞培养及纯化方法、原代肿瘤细胞生物特性检测、肿瘤细胞冻存条件等,综合探讨各方法的优缺点.比较获得更有效的肿瘤细胞原代培养方法,将其运用于探索肿瘤发生机制、肿瘤细胞治疗及药敏试验,推进肿瘤治疗的进程.
-
-70℃超低温冻存细胞的实验研究
[目的]探索-70℃超低温条件冻存细胞的可行方法.[方法]用-70℃超低温冰箱冻存对数生长期的C6/36、BHK-21、Vero和MDCK细胞,冻存30、60和90 d后,37℃水浴复苏,用MTT法测定细胞活性,计算冷冻存活率;同时观察复苏细胞形态,并与液氪冻存方法同步比较.[结果]-70℃冻存后复苏细胞均可获得90%以上的存活率,与液氪冻存细胞的复苏效果类似.光镜下显示,冻存细胞均可在拟定的冻存期内成功复苏.复苏即时镜下90%以上的细胞呈现良好的活细胞形态悬浮在培养基中.[结论]-70℃超低温冰箱冻存细胞的方法可行,尤其适用于基层或液氮来源困难地区开展细胞培养研究.
-
大体系冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响
目的 探讨大体系(50 mL)冻存对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响.方法 采集6例健康志愿者的外周血,采用Ficoll法分离得到单个核细胞,用细胞因子诱导培养CIK细胞.收集冻存1个月后复苏的CIK细胞,采用流式细胞术检测其冻存前后的细胞活率和免疫表型;通过与乳腺癌细胞共培养(效靶比10∶1和40∶1)的方法测定其杀伤活性,与新鲜未冻存的细胞杀伤活性进行比较,同时并对不同效靶比冻存前后的细胞杀伤活性进行比较.结果 CIK细胞大体系冻存前平均细胞活率(97.79 ± 1.92)％,显著高于复苏后的(83.61±3.42)％(P＜0.05).复苏后CIK细胞中CD3+、CD3+ CD4+、CD3+ CD8+、CD3+ CD56+表型CIK细胞所占比例虽较冻存前稍有降低,但差异均无统计学意义(P＞0.05).效靶比10∶1、40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率比较差异均无统计学意义(P＞0.05);效靶比40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率均显著高于效靶比10∶1时(P＜0.05).结论 大体系(50 mL)冻存对于CIK细胞活率虽有影响,但对免疫表型和细胞活性均未影响.
关键词： 细胞因子诱导的杀伤细胞 细胞冻存 杀伤活性 细胞活率 肿瘤生物治疗 -
原代大鼠肝细胞冻存条件探索
目前,哺乳动物原代肝细胞的分离培养技术已被广泛应用于生物医学领域,为降低分离获取肝细胞的成本,提高获得肝细胞的利用率以及保证实验中肝细胞供体的一致性等,建立一种优化的冻存条件被认为是解决上述问题的有效方法.因此,我们以原代大鼠肝细胞为模型,探索简捷、实用的冻存条件,为原代肝细胞,尤其是原代入肝细胞的经济、高效利用奠定基础.
-
冻存对大量分离的人肝细胞色素氧化酶P4503A4活性的影响
成功的冻存使人肝细胞有可能用于暂时替代肝脏治疗急性肝衰竭和多次、反复治疗肝代谢性疾病.P4503A4是肝细胞色素P450氧化酶系中重要成分,在内外源化合物的代谢中起重要作用,包括环孢霉素、FK506[1].所以,该酶可衡量肝细胞冻存后功能保存,对肝移植后肝功能检测有重要意义.我们用高效液相色谱法(HPLC)测定P450A4酶活性,观察冻存对大量分离的人肝细胞P4503A4酶活性的影响.
