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原代培养人肝细胞的简易高效法
二步胶原酶灌注术分离大鼠肝细胞已比较成熟,但是用大鼠肝细胞所得的实验结果还需外推于人,而人的整肝或肝叶的获取来源极其有限,不宜在一般实验室推广[1].人肝癌细胞、传代肝细胞株等体外虽然容易增殖,但其生物学特性已发生显著变化,因此,原代人肝细胞是公认用来研究药物代谢、酶诱导、移植术、病毒性肝炎和肝细胞再生的体外细胞体系[2].从小量正常肝组织(1~2 g)分离的肝细胞在临床来源广泛,能在体外增殖并存活大约15 d,具有分化功能,可基本满足实验需求.我们建立了操作简便、成本低廉和不需复杂设备的方法,易于在国内推广.
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用人和大鼠肝组织分离肝细胞的方法研究
1976年Seglen[1]建立了"二步灌流法"分离大鼠肝细胞,大大地提高了肝细胞的产量和存活率,从而可以更好地利用原代培养的大鼠肝细胞作为体外模型探讨肝毒性作用及其机制.
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提取溶剂对何首乌肝细胞毒性的影响
目的:比较不同溶剂提取何首乌对肝细胞毒性的差异,探讨提取方式对何首乌安全性的影响.方法:制备不同提取方式的何首乌样品,均按生药量的5 g·L-1给药,以CCK-8法检测人肝细胞(L02细胞)抑制率为评价指标,考察提取溶剂,溶剂量和提取时间3个因素对何首乌肝细胞毒性的影响.同时建立何首乌的UPLC指纹图谱,采用偏小二乘法(PLS)回归分析肝细胞毒性与化学成分之间的关系.结果:建立了基于CCK-8比色的何首乌对人正常肝细胞毒性的检测方法.何首乌75%乙醇提取物的肝细胞毒性显著>水提取(P<0.01).进一步正交试验显示,乙醇浓度对何首乌肝细胞毒性具有显著性影响(P<0.01),提取物肝细胞毒性顺序:50%乙醇提取物>75%乙醇提取物>95%乙醇提取物.通过偏小二乘法回归分析,发现了2个与毒性密切相关的色谱峰.结论:不同提取溶剂对何首乌肝细胞毒性有较大影响,50%乙醇提取物毒性强,而何首乌泡酒主要采用50度左右的白酒,提示何首乌泡酒服用的方式可能有较大肝损害风险,应予以高度重视.
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中药诱导肿瘤细胞自噬研究
自噬(autophagy)又称为Ⅱ型程序性细胞死亡(type Ⅱ programed cell death),是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程,是一种在正常细胞和病态细胞中普遍存在的真核细胞特有的生命现象,在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用.早在1962年,Ashford和Porten用电子显微镜观察人肝细胞时发现了自噬现象,但直到近10年,随着酵母模型的建立和基因技术的发展,人们对自噬分子机制和形态特点等研究的深入,才认识到自噬与人类的多种疾病(特别是恶性肿瘤)密切相关.通过对自噬作用的研究,可进一步揭示肿瘤发生、发展的潜在机制,为肿瘤的预防和治疗提供新的思路.
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17β-雌二醇增加人肝细胞C-反应蛋白表达
C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)主要由肝脏合成,离体与在体实验均证实,IL-6是CRP基因表达的主要诱导者.传统观点认为,CRP是天然免疫系统的重要组分和炎症标志物.越来越多的医学基础与临床研究显示,CRP可以直接诱导炎症,是心血管疾病为有力的预示因子与重要的危险因子,可以直接参与动脉粥样硬化病理发生的各个重要阶段,促进疾病的发生、发展.
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两种体外人肝细胞的不同培养方式的比较研究
探讨一种能简单获取高活性肝细胞的培养方法,以期为生物人工肝提供有应用价值的生物材料.在限制贴壁的条件下,以cytodex-3为材料进行L-02人肝细胞的微载体培养,检测肝细胞白蛋白分泌功能以及尿素、葡萄糖等合成功能,并在光镜下观察生长情况,同时与平面贴壁培养的肝细胞进行比较.结果表明,培养至第6d时,所有的微载体均包满细胞,并形成微载体诱导的肝细胞聚集体,微载体培养的肝细胞白蛋白分泌功能为(40.97±3.28) g/L,葡萄糖合成功能为(11.19±0.27) μmol/mL以及尿素消耗为(5.08±0.13) mmol/L,均保持较高水平;而平面贴壁培养的肝细胞白蛋白分泌功能为(35.69±1.21)g/L,葡萄糖合成功能为(8.17 ±0.21) μmol/mL以及尿素消耗为(3.94 ±0.10) mmol/L.微载体组培养的细胞存活时间为14 d,平面贴壁组培养的细胞存活时间为10d,前者明显优于后者;微载体培养能提供长时间保持高活性和高密度生长的肝细胞,为肝细胞移植、生物人工肝领域的研究和应用提供了基础.
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人肝细胞离线混合生物人工肝治疗慢加急性肝衰竭一例
应用转染人肝再生增强因子(hALR)基因的Hep G2细胞筛选出一株肝细胞作为生物材料,并建立生物人工肝支持系统,经检测具有良好生物合成及转化功能.我们采用离线混合生物人工肝治疗慢加急性肝衰竭1例,报道如下.
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噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因
目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白.方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析.结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆,包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因.结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.
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鼠特异性Fas抗体对人鼠嵌合肝中人肝细胞增殖的促进作用
目的: 探讨人胎肝细胞移植联合使用Jo2抗体的策略,促进人胎肝细胞在小鼠肝内存活和增殖.方法:裸鼠经脾移植1×106人胎肝细胞,移植后第1天ip JO2抗体,剂量为0.2mg/kg,1次/wk,持续12 wk为实验组,裸鼠经人胎肝细胞移植后未给予JO2抗体为对照组,建立人鼠嵌合肝动物模型.采用HE染色、原位末端标记方法(TUNEL染色)观察未经人胎肝细胞移植而给予JO2抗体24 h后处死的裸鼠肝脏组织.免疫组化、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时相点实验组和对照组嵌合肝中肝组织人白蛋白、特异人增殖细胞核抗原(PCNA)和人白蛋白mRNA表达.结果:未经人胎肝细胞移植而给予JO2抗体的裸鼠病理组织切片发现肝组织出血、坏死和细胞凋亡.实验组和对照组裸鼠均能存活至24 wk.移植后嵌合鼠肝组织表达人白蛋白和人PCNA阳性细胞的时间:实验组2-20 wk,对照组2-12 wk; 白蛋白mRNA表达:实验组4-16wk, 对照组4-8 wk:实验组与对照组移植后8、12 wk PCNA表达差异有显著性(25.7%±8.5% vs 13.4%±7.8%, 29.4%±5.0% vs 8.5%±2.3%,均P<0.05).结论:人肝细胞异种移植于裸鼠体内能够存活,经小剂量JO2抗体ip裸鼠,使人鼠嵌合肝中人肝细胞得以增殖,存活时间延长.
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异种肝细胞移植研究现状
uPA/RAG-2小鼠的发现为异种肝细胞移植研究提供了一个有效的动物模型.在uPA/RAG-2转基因小鼠脾内注入大鼠、土拨鼠、人肝细胞后,均能部分或完全取代小鼠肝细胞.文章主要介绍了大鼠、土拨鼠、人肝细胞在uPA/RAG-2转基因小鼠内的增生、对肝功能影响等情况,同时探讨了该模型体系存在问题及应用前景.
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培养猪肝细胞型生物人工肝的研究进展
生物人工肝研究的主要细胞材料是人肝细胞、肝肿瘤细胞株和猪肝细胞,但由于人肝细胞来源匮乏以及肿瘤细胞株潜在的不安全性,培养猪肝细胞型生物人工肝已经逐步成为人工肝研究和临床应用的主要对象.文章主要介绍了培养猪肝细胞型生物人工肝的动物实验、临床应用以及其生物安全性,同时探讨了该型生物人工肝存在的问题和应用前景.
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应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白
目的:通过筛选HBsAg基因启动子I(SPI,surface promoter I)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径.方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子I的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的14个克隆中得到8个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV表面抗原基因启动子I特异结合的肝细胞蛋白,共编码7种蛋白.其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子I的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因.
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乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化
目的:研究乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化.方法:构建前-前-S的酵母细胞表达载体,采用酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.发现其中有1个未知功能的新基因.根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为PPSBP9并在GenBank中注册,注册号为AY553877.结果:PPSBP9基因的编码序列全长为840个核苷酸(nt),编码产物由279个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性.结论筛选并成功的克隆了乙型肝炎病毒前-前-S蛋白与肝细胞cDNA文库中结合蛋白新基因PPSBP9,为进一步研究HBV前-前-S及其肝细胞结合蛋白新基因在HBV致病中的作用奠定了基础.
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肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白基因筛选
目的:筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S蛋白相互作用蛋白的基因,探讨前-前-S在HBV致病中的作用.方法:构建前-前-S的酵母细胞表达载体,采用酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.结果:获得了54个与前-前-S蛋白特异性结合的阳性克隆,其中包括30种已知蛋白基因和8个未知功能基因.结论:克隆出与乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合的肝细胞蛋白基因,为进一步研究前-前-S在HBV致病中的作用奠定了基础.
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酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因
目的:Hcbp6是与核心蛋白相结合的未知功能蛋白基因,为了初步提示他的生物学功能和在细胞中的存在形式,采用酵母双杂交体系寻找与他相互作用的肝细胞蛋白,探讨Hcbp6的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建Hcbp6诱饵质粒并转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,在涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出4种与Hcbp6特异性相互作用的蛋白,包括Paralemmin(PALM)、Ran结合蛋白2(Ranbp2)、跨膜运输蛋白21(Tmp21)和血清白蛋白.结论:推测该蛋白可能为一分泌性蛋白,或与分泌蛋白的形成有关,进一步的生物学功能的研究需要更多的实验加以探讨.
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乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1的基因克隆化研究
目的:发现了与乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ(HBVSP Ⅰ)结合的未知功能蛋白,并克隆了他的全长基因.方法:以SP Ⅰ核心序列为"诱饵",应用酵母单杂交技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,得到了一个未知基因,命名为乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1(SBP1).结合生物信息学技术,应用分子生物学技术,克隆了SBP 1的基因编码序列.结果:经酶切和测序鉴定,结果正确,成功克隆了SBP 1的基因编码序列.结论:SBP 1具有完整的开放读码框,可能通过与SP Ⅰ的结合发挥生物学作用.
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乙型肝炎病毒前-S2蛋白结合蛋白基因S2-29的克隆化研究
目的:筛选人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白(Pre-S2)相互作用的蛋白,探寻HBV致病机制.方法:用多聚酶链反应(PCR)技术扩增HBV前-S2基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,用营养缺陷型培养基及蓝白斑双重筛选阳性菌落,提取酵母质粒转化大肠杆菌并测序,进行生物信息学分析.逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法从HepG2细胞的mRNA中扩增出完整的新基因S2-29,连入另一酵母表达载体pGADT7,并用免疫共沉淀方法再次证实二者间的相互作用.结果:成功克隆出HBV前-S2基因并在酵母细胞中表达,配合后筛选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落26个,其中有1个未知基因S2-29,该基因能在HepG2细胞中表达,免疫共沉淀方法证实二者在体外也有结合作用.结论:成功克隆出与乙型肝炎病毒前-S2蛋白相结合的新基因,为进一步研究HBV前-S2的作用提供了新线索.
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甲胎蛋白阳性人肝细胞的定量形态学图像分析
目的:为阐明肝细胞性肝癌癌变前期AFP阳性表达肝细胞的形态特征,以进一步探讨肝癌癌变规律并以此寻求能够早期诊断肝癌的方法.方法:SP法对正常肝组织,慢性肝炎肝硬化,癌周肝硬化和肝细胞癌共114例进行甲胎蛋白(AFP)的检测,并对AFP阳性肝细胞及AFP阴性肝细胞进行了核面积、核平均体积、核等效直径、核长轴/短轴比、核形状因子、核异型指数、细胞面积、细胞等效直径、细胞平均体积、细胞长轴/短轴比、核质比等11项参数的形态定量测定和对比分析.结果:正常肝组织和慢性肝炎肝硬化AFP不表达;癌周肝硬化AFP阳性率为37%(10/27);肝细胞癌AFP阳性率为45%(17/38).对癌周肝硬化AFP阳性和阴性肝细胞形态定量分析,10例AFP阳性组的阳性表达肝细胞与其余17例阴性组的肝细胞在细胞长轴/短轴比、核形状因子和核异型指数3项参数间有显著差异(P<0.05);进一步对AFP阳性组同片阳性肝细胞和阴性肝细胞比较分析,有4例在11项形态参数中存在不同程度的差别,其中可见AFP阳性肝细胞较AFP阴性细胞小,核不同程度增大,核质比例增大,以及在反映核不规则程度的核长轴/短轴比、核形状因子和核异型指数等参数上有明显变化.结论:癌周肝硬化不同于不伴肝癌的肝硬化而更具癌前病变性质;在与肝癌发生相关的病变中,AFP的表达早于细胞形态学的改变;随着AFP的表达,部分AFP阳性肝细胞发生的形态学改变已具备癌前病变的性质,其可能是肝细胞癌变的基础.
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MicroRNA-126对人肝细胞糖代谢的影响
目的 探讨MicroRNA-126对人肝细胞糖代谢功能影响的机制.方法 以来源于人肝脏的永生非肿瘤细胞系——张氏肝细胞为研究对象,分为6组,分别转染MicroRNA-126类似物与MicroRNA-126抑制物及其相应的阴性对照序列,并设正常对照组和脂质体Lipofectamine 2000组.采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后各组细胞中MicroRNA-126的相对表达量,用Western blotting法检测各组细胞中胰岛素受体底物1(IRS-1)、磷脂酰肌醇激酶p85β(PIK3R2)、蛋白激酶B2 (Akt-2)、磷酸化Akt-2(P-Akt-2)的蛋白表达水平.采用单因素方差分析及t检验进行数据分析.结果 RT-PCR检测结果显示:MicroRNA-126类似物转染组中MicroRNA-126的相对表达量明显高于正常对照组(799.70±66.46比1.00±0.00,t=20.82,P<0.05).MicroRNA-126类似物转染组细胞中IRS-1、PIK3R2的蛋白表达水平较正常对照组明显降低(分别为0.41±0.04比1.09±0.02、0.41±0.03比0.89± 0.01,t=-25.53、-26.63,均P<0.05).各组间Akt-2的相对表达量差异无统计学意义(F=0.35,P>0.05).MicroRNA-126类似物转染组Akt-2的磷酸化水平(P-Akt-2/Akt-2)较正常对照组明显降低(0.53±0.07比0.88±0.09,t=-5.298,P<0.05).结论 MicroRNA-126通过抑制IRS-1/PIK3R2/Akt-2胰岛素信号传导通路影响人肝细胞的糖代谢.
关键词: MicroRNA-126 人肝细胞 糖代谢 -
人肝细胞的分离、培养和冻存
人肝细胞是生物人工肝的理想细胞来源,决定其治疗效果.本文就人肝细胞分离、培养及冻存进行综述.