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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒N蛋白基因的表达及其初步应用
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的病原是SARS冠状病毒[1],该病毒引起以呼吸道肺上皮细胞损害为主的全身性疾病,引发免疫抑制而造成全身感染.同时,SARS病毒感染导致全身血管病变,是一种传染性很强的新病原.目前,在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法,细胞培养的抗原面临纯化困难和操作的危险性.我们利用基因重组的方法,在大肠杆菌中表达了SARS冠状病毒N蛋白全长基因,为进一步建立特异性诊断方法、基因工程疫苗的研制提供了备选实验材料.
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超广谱β-内酰胺酶TEM和SHV型全长基因PCR直接测序
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)TEM和SHV型是常见的基因型,并且呈全球性分布.TEM和SHV的衍生型不断出现.TEM和SHV型全长基因测序对亚型的区别、新亚型的确认和各衍生型的基因进化树分析以及分子流行病学研究具有重要意义.本文介绍TEM和SHV型全长基因PCR直接测序方法.
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肺炎衣原体Mr 53×103蛋白全基因克隆和表达
肺炎衣原体是1989年确立的衣原体属新种,相对分子质量(Mr)为53×103的蛋白是高度保守的肺炎衣原体主要的种特异性抗原〔1〕,位于病原体表面,其全基因含1*!482个碱基对,推测编码493个氨基酸。Mr 53×103蛋白与肺炎衣原体慢性感染有关,可能用作感染慢性化的标志〔2〕;抗Mr 53×103单抗能中和肺炎衣原体的感染〔3〕,表明Mr 53×103蛋白还是一个理想的预防肺炎衣原体感染的分子疫苗候选者。本实验克隆和表达了肺炎衣原体Mr 53×103蛋白的全长基因,为进一步研究该蛋白是否参与肺炎衣原体毒力因子的构成,以及其在肺炎衣原体感染检测上的意义和能否作为预防肺炎衣原体感染的分子疫苗等打下基础。
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乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1的基因克隆化研究
目的:发现了与乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ(HBVSP Ⅰ)结合的未知功能蛋白,并克隆了他的全长基因.方法:以SP Ⅰ核心序列为"诱饵",应用酵母单杂交技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,得到了一个未知基因,命名为乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1(SBP1).结合生物信息学技术,应用分子生物学技术,克隆了SBP 1的基因编码序列.结果:经酶切和测序鉴定,结果正确,成功克隆了SBP 1的基因编码序列.结论:SBP 1具有完整的开放读码框,可能通过与SP Ⅰ的结合发挥生物学作用.
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胃癌中医证型相关基因的表达谱
目的:寻找不同胃癌证型组织中的相关基因表达谱差异表达,对研究胃癌证型实质进行探讨、胃癌的中医证的基因诊断及指导临床用药有重大的意义.方法:我们运用含有4 096条人类全长基因的cDNA表达芯片技术,对胃癌中医证型邪热内蕴证和气滞血瘀证共4例,胃癌组织及胎胃正常组织基因表达进行了分析.结果:两证型都有免疫相关基因的下降,也有癌基因的上调,但热毒内蕴亚型基因表达提示了正气未虚,尚有防御能力,如nm23基因增高,p18基因表达增高;而气虚夹瘀亚型中则无此改变.结论:胃癌患者的基因表达既有相同表达改变,也有不同中医证型的基因谱表达改变也不相同,基因表达谱可为中医的证型提供科学依据.
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1例HIV全长基因结构和亚型重组分析
云南省艾滋病的流行时间较长,疫情也比较严重,在吸毒人群和男男性行为者(MSM)中先后出现过艾滋病暴发流行[1-2].为了了解云南省MSM的艾滋病分子流行病学特征及制定艾滋病防治策略提供依据,选择了昆明市MSM哨点的一份HIV抗体初筛阳性样本(编号为YN_ZG31)进行了病毒的全长基因分析.
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长模板聚合酶链反应技术在病毒学研究中的应用
长模板聚合酶链反应(PCR)技术是一种可扩增几个kb甚至几十个kb基因片段的PCR新技术,已被用于病毒全长基因,感染性克隆的构建,转录体的制备,病毒基因变异、分型的分析和病毒基因功能组学的研究等方面.
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旋毛虫新生幼虫期特异性基因丝氨酸蛋白酶的结构预测与功能分析
我国旋毛虫病患者数及死亡率居三大食源性人兽共患寄生虫病之首[1].旋毛虫新生幼虫肠型期(NBL)为非细胞内寄生并在血液中移行,对宿主的免疫作用较敏感.利用基因工程技术制备NBL抗原用于旋毛虫病的诊断和预防具有重要意义.本文对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行筛选,获得其特异性全长基因,采用生物信息学原理对其进行分析,结果报告如下.
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淋球菌NspA基因克隆及序列分析
奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria Surface Protein A,NspA)是新近发现的一个具有较强免疫原性和保守性的抗原,是淋球菌疫苗研究的理想侯选者之一[1].现克隆淋球菌NspA全长基因,为进一步的淋球菌基因疫苗研究奠定基础.
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淋球菌孔蛋白基因克隆及其在真核细胞中的表达
在许多发展中国家,淋病仍然是一种常见性病,加强淋球菌疫苗研制等预防措施的研究显得非常迫切[1].由于淋球菌自然感染诱导非保护性免疫,早期全细菌疫苗实验的免疫效果不理想,促使人们用纯化淋球菌抗原作进一步研究.淋球菌孔蛋白(porin)具有较强的免疫原性和相对缓慢的抗原变异性,是目前淋球菌疫苗研究的热点.我们克隆了淋球菌孔蛋白全长基因,并成功构建真核细胞表达载体.
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SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化
克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建原核重组表达质粒PET23a-M,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达、纯化.表达产物用WesternBlot检测其抗原性.RT-PCR扩增M编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.
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弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析
构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET 23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.成功构建了pET 23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.
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HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达
本实验成功构建了HCV全长基因的真核表达载体pCI-HCVFL,转染HepG2细胞后经免疫荧光和免疫组化法分别检测到结构基因区(C)和非结构基因区(NS3)病毒蛋白的表达,该栽体可用于建立HCV转基因细胞模型以及进一步开展有关HCV复制与表达的深入研究.
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hOP-1全长基因克隆及真核表达载体的构建
目的证实人牙乳头细胞中OP-1的表达,获得hOP-1全长基因及其高效真核表达载体.方法提取人牙乳头细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增hOP-1全长基因并克隆入T载体,筛选阳性克隆进行序列测定后.构建高效真核表达载体pCI/OP-1并筛选鉴定.结果 PCR扩增得到一特异性的约1 300 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致.构建的pCI/OP-1质粒,用于基因转染纯度较好.结论人牙乳头细胞中首次克隆到hOP-1全长基因,并构建获得该基因高效真核表达载体.
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汉族人甘露聚糖结合凝集素全长基因的克隆与序列分析
目的 克隆汉族人甘露聚糖结合凝集素(MBL)全长基因.方法 提取汉族人白细胞基因组DNA,高保真PCR扩增MBL基因,应用TA克隆方法将PCR产物与载体pcR(R)-XL-TOPO连接,经DNA测序后利用软件DNAStar进行分析.结果 MBL基因反向插入pCR(R)-XL-TOPO,全长6 321 bp,与GenBank收录的基因序列相比,有17个碱基不同,其中仅1个位于编码区(外显子4),但编码的氨基酸没有改变,且该碱基恰与GenSank收录的人MBL cDNA一致,此序列已被GenBank收录,登录号EU596574.结论成功克隆了汉族人MBL基因全长序列,其结构基因的基因型属于野生型,这为研究MBL基因非编码区对MBL表达的影响奠定了基础.