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玻璃化冻融胚胎保存时间对胚胎复苏结局的影响
目的 探讨辅助生殖技术中影响玻璃化冻融胚胎保存时间对胚胎复苏结局的影响.方法 将复苏后全部卵裂球存活的胚胎定义完全存活胚胎.对367个冻融胚胎移植(FET)周期的相关资料进行回顾性统计学分析,根据冻融胚胎保存时间进行分组,分为<6、≥6～<12及≥12～19个月A、B、C 3组,比较各组的胚胎复苏率、完全存活胚胎率、胚胎种植率和临床妊娠率.结果 三组患者的胚胎复苏率、完全胚胎存活率、胚胎种植率及临床妊娠率,组间比较均无显著性差异(P>0.05).结论 在玻璃化FET周期,胚胎冷冻保存时间对解冻后胚胎质量及FET结局没有影响,因此可以灵活掌握FET时间.
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941例胚胎玻璃化冷冻保存不同时间复苏后临床结局分析
目的 比较辅助生殖技术(ART)中分裂期胚胎(D3)玻璃化冷冻保存不同时间后复苏胚胎的质量与临床结局.方法 根据分裂期胚胎冷冻保存时间不同将941例胚胎冻融周期分为3组:1～＜9个月组(749例)、9～＜16个月组(144例)与≥16个月组(48例).比较3组的胚胎存在率、复苏存活率、完整胚胎存活率、基本完整胚胎率、胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、异位妊娠率. 结果 3组胚胎复苏存活率(分别为98.22％、98.06％和96.33％)、完整胚胎存活率(分别为86.95％、82.58％和88.07％)、基本完整胚胎率(分别为10.78％、14.19％和7.33％)、生化妊娠率(分别为62.22％、54.17％和54.17％)、临床妊娠率(分别为58.74％、49.31％和52.08％)、胚胎种植率(分别为40.53％、33.22％和37.23％)相比较,差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 在所研究的胚胎冷冻期限内,胚胎玻璃化冷冻保存时间不影响解冻后胚胎质量与妊娠结局.
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玻璃化技术冷冻人类囊胚和单胚胎移植
玻璃化冷冻技术简化了胚胎冷冻程序,提高了各个阶段胚胎的冷冻保存效果,尤其是对程序化冷冻效果差的囊胚的冷冻保存,是具有前景的胚胎冷冻方法.囊胚移植和单胚胎移植被认为是提高种植率、降低多胎妊娠率的有效方法.本文就玻璃化冷冻的影响因素和囊胚玻璃化冷冻进展综述如下.
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应用冷冻环玻璃化冷冻小鼠囊胚的效果观察
目的 比较冷冻环玻璃化冷冻小鼠各阶段囊胚的存活率及继续发育能力. 方法 应用冷冻环以15%二甲基亚砜(DMSO)+15%乙二醇(EG)为主要组成的玻璃化冷冻液,冷冻小鼠早期囊胚112个、囊胚120个、扩张囊胚105个,以同期未冷冻囊胚(100个)作对照;并于冷冻前人工皱缩小鼠囊胚30个,以同期未皱缩的囊胚(50个)为对照.比较冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力. 结果 小鼠早期囊胚、囊胚、扩张囊胚各组的存活率分别为88.4%、69.2%和55.2%,囊胚孵出率分别为82.8%、65.1%和60.3%.早期囊胚组复苏后的存活率和囊胚孵出率均显著高于囊胚组和扩张囊胚组(P＜0.05).冷冻前人工皱缩扩张期囊胚,冷冻复苏后存活率达93.8%,孵出率78.1%,与未皱缩组比较差异有显著性(P＜0.05). 结论 玻璃化冷冻囊胚的效果与囊胚的发育阶段有关;冷冻前人工皱缩囊腔体积能明显提高扩张囊胚玻璃化冷冻的效率.
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冻融成人卵巢组织异种移植后形态和功能的研究
目的 探讨经玻璃化法冷冻保存的成人卵巢组织异种皮下移植后卵泡生长发育和雌激素分泌情况. 方法 将30只SCID小鼠随机分为2组:去势对照组和移植组.两组小鼠均于术后7d开始隔日给予重组卵泡刺激素(rFSH)及重组黄体生成素(rLH)各5U.移植术20周后将获取的移植物进行光学显微镜观察,并测定两组小鼠血清雌二醇(E2)浓度及子宫相对重量. 结果 卵巢皮质移植物内可以观察到各级卵泡发育,移植组小鼠血清E2水平及子宫相对重量高于去势对照组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 经玻璃化冷冻保存并异种皮下移植的人类卵巢组织可以存活,具有雌激素分泌功能,并作用于靶器官.
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玻璃化冻融小鼠囊胚的超微结构观察
目的 观察冻融小鼠囊胚的超微结构改变情况,研究冷冻对囊胚的冷冻损伤.方法 采用6组玻璃化溶液对小鼠囊胚进行冷冻保存,复苏后通过透射电镜观察超微结构改变情况.结果 各组小鼠囊胚均表现相似的超微结构损伤:线粒体肿胀、粗面内质网脱颗粒、高尔基复合体扩张、含有絮状物或膜性结构的小泡增多、微丝结晶的出现、细胞间紧密连接和桥粒减少.结论 冷冻对于小鼠囊胚的冷冻损伤主要是细胞膜性结构和细胞骨架系统的损伤.
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冷冻环玻璃化法冷冻小鼠卵母细胞的效果评价
目的 评价ED15(15%ethylene glycol,EG+15% dimethylsulphoxide, DMSO)冷冻环玻璃化法冻存小鼠成熟卵母细胞的效果,以及对其纺锤体形态、染色体分布和发育潜能的影响.方法 分别以小鼠新鲜成熟卵母细胞为对照组,玻璃化冷冻复苏卵母细胞为冷冻组.玻璃化冷冻以冷冻环为载体,以乙二醇(EG)及二甲亚砜(DMSO)联合作冷冻保护剂.解冻后观察细胞存活情况并对解冻后培养0、1、2 h的卵母细胞行纺锤体及染色体免疫荧光染色,激光共聚焦扫描显微镜观察;其余卵母细胞行体外受精培养,计算受精率、囊胚形成率.结果 冷冻组成熟卵母细胞存活率为98.2%,复苏后卵母细胞培养0、1、2 h的纺锤体形态正常率及染色体分布正常率与对照组比较无显著性差异(分别为87.0%、90.9%、90.3% vs 95%,P＞0.05;91.3%、95.4%、93.5% vs 90%,P＞0.05);冷冻组受精率及囊胚形成率与对照组比较均无显著性差异(81.3% vs 85.2%,P＞0.05;76.1% vs 75.4%,P＞0.05).结论 ED15冷冻环玻璃化法冻存小鼠成熟卵母细胞复苏存活率高,对其纺锤体形态、染色体分布及发育潜能无明显影响.
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海藻糖用于小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究
目的 探讨海藻糖对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响. 方法 采用12只小鼠控制性超排卵获得的360枚成熟的卵母细胞,分别放入含1.0、0.5、0.3及0 mol/L的海藻糖中孵育3h.部分卵母细胞进行碘化丙啶(PI)染色；320枚卵母细胞进行玻璃化冷冻和复苏,并进行体外受精,观察卵母细胞成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率. 结果 0.3 mol/L海藻糖组复苏率、受精率与对照组无显著差异(92.59％ vs.90.90％,70.67％ vs.61.43％),但是卵裂率、囊胚形成率均高于对照组(83.02％ vs.44.19％,72.72％ vs.47.37％)(P＜0.001)；0.5 mol/L海藻糖组复苏率、受精率、囊胚形成率与对照组无显著差异,但是卵裂率高于对照组(65.22％ vs.44.19％)(P＜0.05)；0.3 mol/L海藻糖组囊胚形成率高于0.5 mol/L海藻糖组(72.72％ vs.50.00％)(P＜0.001);1.0 mol/L海藻糖组卵母细胞复苏率、受精率、卵裂率、囊胚形成率均低于对照组低(P＜0.001). 结论 一定浓度范围的海藻糖对小鼠卵母细胞的玻璃化冷冻有保护作用,0.3 mol/L海藻糖浓度比较适合小鼠卵母细胞玻璃化冷冻.
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家兔卵巢组织玻璃化冷冻保存的实验研究
目的 采用直接覆盖玻璃化冷冻(DCV法)和半麦管法玻璃化冷冻(HS法)处理家兔卵巢组织,探讨两种冷冻方法对卵泡组织形态学及超微结构的影响.方法 将10只健康雌性新西兰家兔的卵巢组织块随机分配组成新鲜对照组、DCV法和HS法玻璃化冷冻组3个实验组,观察和比较各组间卵巢内卵泡的组织形态学和超微结构变化.结果 (1)与对照组卵巢组织中的原始卵泡及初级卵泡的形态正常率(分别为88.11％和72.86％)相比,冷冻复苏后的原始卵泡及初级卵泡形态正常率在DCV法(分别为72.66％和55.08％)和HS法(分别为71.73％和56.18％)均显著降低(P＜0.05),且初级卵泡的形态正常率均显著低于原始卵泡(P＜0.05),但两个冷冻组间无显著差异(P＞0.05);(2)观察卵泡超微结构的改变:两种玻璃化冷冻法主要损伤的是细胞浆中的线粒体,细胞核也会出现核固缩现象.结论 DCV法和HS法玻璃化冷冻均能保存家兔卵巢组织内的卵泡,但冷冻所导致的原始卵泡和初级卵泡损伤仍不可避免,其中初级卵泡损伤更明显.这两种冷冻法处理后的卵泡组织形态学无显著性变化,但在一定程度上会损伤卵泡中各组成部分的细胞超微结构.
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不同阶段小鼠囊胚玻璃化冷冻保存效果观察
目的 探讨合适玻璃化冷冻保存的小鼠囊胚发育阶段.方法 对575枚小鼠初级囊胚和577枚扩张囊胚分别采用六组玻璃化溶液进行玻璃化冷冻,比较不同阶段囊胚的冷冻保存效果.结果 各组初级囊胚存活率和孵出率均高于扩张囊胚.除ES35组外,各组初级囊胚存活率均显著高于扩张囊胚(P<0.05);EDS35、ESF20和EDSF20组的初级囊胚的孵出率均显著高于扩张囊胚(P<0.05).结论 初级囊胚较扩张囊胚更适合玻璃化冷冻保存.
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玻璃化冷冻人卵母细胞的临床应用:附一例成功分娩
人卵母细胞冷冻保存是女性生育力直接保存的一种方法.但由于卵母细胞自身生物学特性的影响,卵母细胞冷冻的妊娠率始终不高.本院采用玻璃化技术冷冻人卵母细胞2例,1例获得临床妊娠,目前已分娩.
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降香黄檀种子和离体胚超低温保存研究
以降香黄檀的成熟种子和离体胚为材料,探讨了含水量对其存活的影响,以及快速冷冻法和玻璃化冷冻法对种子和离体胚超低温保存的影响.结果发现,种子含水量由15.04％降至8.14％时,其发芽率和生活力分别由82.67％,85％降至18.35％,25％;种子含水量由15.04％降至9.37％时,经玻璃化冷冻和快速冷冻后其发芽率由82.67％分别降至37.50％,25.37％,其中含水量12.35％的种子发芽率为63.58％,50.45％,较其他含水量的高;含水量为26.32％的种胚,经玻璃化冷冻和快速冷冻后,其发芽率由95.67％分别降至58.31％,33.82％,含水量在14.17％ ～ 21.34％时,其发芽率有所下降,但下降幅度不大.实验结果表明,种子超低温保存佳条件为含水量12.35％,玻璃化冷冻;离体胚超低温保存佳条件为含水量15.04％,玻璃化冷冻.结论是含水量对超低温保存后降香种子和种胚的发芽率影响显著;玻璃化冷冻法显著优于快速冷冻法.
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微波在生物材料超低温保存中的作用
超低温保存生物材料的降温和复温过程中,冰晶的形成将损伤细胞,影响冻存效果.相对于常规冷冻方法,应用微波技术更能抑制冰晶生长,提高冻存质量.微波具有良好的穿透性,可使冷冻材料较为均匀地受热.在生物材料降温时,微波场产生扭矩影响水分子集束的结构,使其不利于冰晶的增长,从而阻断了冰晶的形成,增强生物材料的玻璃化能力.在复温过程中,极性分子(如水)吸收微波能量转化为热量,产生较高的复温速率,能阻止重结晶的发生,获得较好的复温效果.
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低温下生物组织的介电常数与电导率研究
本研究应用波导传输发射法测量生物组织在-25℃～30℃时的介电常数与电导率.首先通过测量有机材料对测量系统进行验证,证明所提出的系统具有较好的测量精度与可重复性,然后测量了在生物组织中分布很广的脂肪的介电常数与电导率,给出了一个测量值分布范围,并讨论了单个样品的介电常数与电导率随温度变化的规律.工作目的是为研究微波降温和微波复温的非热效应提供物性参数,对其机理进行探索性工作.
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保护液的玻璃化状态对红细胞冷冻干燥保存后回收率的影响
为了研究保护液的玻璃化状态对红细胞冷冻干燥(简称冻干)保存后回收率的影响,采用含有7%二甲亚砜(v/v)和20%、30%、40%或50%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(w/v)的缓冲液作为保护液进行保护液的玻璃化测试和红细胞的冻干保存实验.首先检测溶液的玻璃化状态,如果冷冻和解冻过程中任一过程出现白色冰晶即为非玻璃化溶液;再将浓集红细胞和不同的保护液按比例混匀,预冻后移入冻干机内进行冻干处理;冻干完毕后,快速水化样品,测定红细胞回收率、血红蛋白回收率和上清游离血红蛋白浓度,然后对冻干后红细胞形态进行电镜观察.结果表明:20%PVP+7%DMSO和30%PVP+7% DMSO在冷冻和解冻过程中都出现白色冰晶;40%PVP+7%DMSO在冷冻过程中无冰晶出现,但在解冻过程中出现冰晶;而50%PVP+7%DMSO在冷冻和解冻过程中均无冰晶出现.冻干红细胞再水化后,40%PVP+7%DMSO的细胞回收率和血红蛋白回收率分别为(81.36±14.94)%和(77.54±12.86)%,显著高于其它3组(P＜0.01);另外40%PVP+7%DMSO的上清游离血红蛋白浓度也显著低于其它3组(P＜0.01).研究表明:随着溶液中PVP浓度的升高,溶液的玻璃化程度也随之增加,同时冻干-再水化后红细胞的各项指标也随之改善,当溶液中PVP浓度为40%时,达佳效果;但当进一步提高PVP浓度至50%时,溶液为玻璃化溶液,但结果反而不佳.结论:保护液的玻璃化程度对红细胞冻干保存的影响是双向的,玻璃化程度的过度加深反而不利于红细胞的冻干保存.
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猪卵母细胞 OPS玻璃化冷冻保存的研究
猪卵母细胞由于脂肪含量高，对低温敏感，相较其他动物卵母细胞的冷冻保存更加困难，因此在种质的保护保存、胚胎工程研究产生极大的阻碍。本试验研究了猪卵母细胞的OPS玻璃化冷冻保存方法，研究乙二醇、甘油和聚乙烯吡咯烷酮( PVP)作为冷冻保护剂，对比不同的浓度梯度和两种冷冻保护剂联合使用对冷冻效果的影响。研究未经体外成熟培养和不同时间体外成熟培养的猪卵母细胞的冷冻保存效果。对比改良优化的OPS玻璃化冷冻方法和传统的程序化冷冻方法的保存效果。实验表明，体外成熟12 h ( GV期)的猪卵母细胞用乙二醇添加聚乙烯吡咯烷酮( PVP)进行玻璃化冷冻，解冻后体外成熟率、细胞的形态正常率与未经体外成熟的的卵母细胞相比差异显著，与成熟48 h ( MII期)卵母细胞相比差异不显著。但卵裂率和桑椹胚囊胚率体外成熟12h(GV期)的猪卵母细胞用乙二醇添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为冷的保护剂组要好于其他组。
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玻璃化法冷冻保存对人胚胰岛的影响
目的:观察玻璃化法对人胚胰岛冻存复苏后形态功能的影响.方法:取胎龄18-28 wk中期水囊引产死胎,用胶原酶分离胰岛后,分别采用传统微机程控缓慢降温和玻璃化超快速降温方法冷冻保存胰岛,复苏后,从胰岛形态、超微结构、胰岛素分泌功能方面比较两种冻存方法的效果.结果:两种方法冷冻保存的胰岛,复苏后形态保持完整,电镜下胰岛B细胞分泌颗粒和线粒体丰富,线粒体嵴规整,胰岛素释放试验中,二者的胰岛素水平与冻存前无明显差异(P＞0.05),胰岛素基因表达水平与冻存前相似.结论:玻璃化法冷冻保存胰岛能够维持细胞的正常结构和功能,其冷冻效果与微机程控缓慢降温相比无明显差别.
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速冻玻璃化储存异体皮的临床应用
目的:分析和总结1987年以来速冻玻璃化储存皮临床应用情况.方法:收集我科1987年至1999年使用速冻玻璃化储存的异体皮救治烧伤病人和我科皮库储存异体皮国内使用情况的相关资料,并进行总结和分析.结果:使用速冻玻璃化异体皮的烧伤病人平均烧伤面积为55.4%,其中平均Ⅲ°面积为30.9%,应用异体皮面积为3466～10208 cm2.采用速冻玻璃化保存的皮肤复温后其活力可达到新鲜皮肤的70%左右,该法保存的皮肤质地柔软、转红快、成活率高、存活期长,长可在病人创面上成活2个月左右.术后异体皮成活率为95%.从1987年至1999年底我科皮库供全国各地18个省和3个自治区的48个市,8个县的108家各级医院冷冻异体皮使用,包括我科使用皮肤面积共达3,604,260 cm2.结论:采用速冻玻璃化储存的异体皮覆盖创面,仍是目前有效、方便、经济实惠的方法,使用异体皮进行烧伤的救治已经成为国内大多数医院普遍使用的一项救治措施.
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玻璃化冻存对兔关节软骨细胞存活率及代谢活性的影响
目的 探索理想的关节软骨细胞低温保存方法.方法 分别采用玻璃化冻存法、程序性降温法及梯度降温法对兔关节软骨细胞进行低温保存,通过流式细胞仪计数及阿尔新蓝染色等方法了解复苏后软骨细胞的存活率、凋亡率及生物活性.结果 采用玻璃化冻存法保存的软骨细胞存活率为(86.57±1.67)％,明显高于传统的程序性降温法及梯度降温法;玻璃化冻存对软骨细胞合成糖胺多糖的能力有一定影响,但与新鲜未冷冻组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 玻璃化冻存法较传统的保存方法能显著提高冷冻保存后兔关节软骨细胞的存活率,并能维持细胞的生物活性,是一种理想的软骨细胞低温保存方法.
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不同冷冻法对小鼠未成熟与成熟卵母细胞的成熟及胚胎发育的影响
本研究观察应用慢速冷冻-快速复温(常规冷冻法)与玻璃化冷冻法,对小鼠生殖泡期未成熟及第二次减数分裂中期(metaphage Ⅱ,MⅡ)成熟卵母细胞冷冻后的解冻、体外成熟、受精及早期胚胎发育的影响.
