人MII期卵母细胞纺锤体与正常受精卵早期卵裂的关系

目的探讨早期卵裂与胚胎质量及MII期人卵纺锤体的关系. 方法于卵泡浆内单精子注射(ICSI)后25～27 h观察卵裂情况.若此时出现了卵裂就认为该受精卵发生了早期卵裂(EC).比较EC组与无早期卵(NEC)裂组的良好胚胎形成率以及EC与MII期卵母细胞纺锤体的关系. 结果 EC与纺锤体存在与否的rs值为0.422,P=0.000.认为EC与MII期卵母细胞纺锤体存在呈正相关.EC组的良好胚胎形成率(86.4%)高于NEC组(43.8%),差异有显著性(P＝0.001). 结论出现EC的胚胎D3天良好胚胎形成率高.EC与纺锤体存在与否有较为密切的关系.

冻融液的温度对人未成熟卵母细胞玻璃化冻融效果的影响

目的 探讨冻融液的操作温度对未成熟人卵母细胞(GV、MI)玻璃化冻融效果的影响.方法 收集卵胞浆内单精子注射(ICSI)患者的GV、MI卵母细胞,根据冻融液操作温度的不同分为A、B、C组.冻融后存活及未冷冻对照组(D组)卵母细胞体外成熟(IVM)培养,成熟的MII卵母细胞固定后进行免疫荧光染色,然后用Nikon CISI激光扫描共聚焦显微镜观察纺锤体、染色体形态.结果 实验组GA、GB、GC 卵母细胞冻融后的存活率和体外成熟率分别为100%、81.3%、68.8%和33.3%、83.3%、72.7%,仅GC组的存活率与对照比较存在显著性的差异(P<0.05);实验组中只有GB组获得了纺锤体(20%)和染色体(10%)形态正常卵母细胞.实验组MA、MB、MC卵母细胞冻融后的存活率分别为71.4%、100%、83.3%,各实验组与对照组比较无显著性差异(P>0.05);MA组体外成熟率与对照组比较存在极显著性的差异(0%比57.1%,P<0.01),MB、MC与对照组的体外成熟率比较无显著性的差异(66.7%、80%比57.1%,P>0.05);仅MC获得1个正常纺锤体和染色体形态卵子.结论 冻融液的合适操作温度可以提高未成熟卵子的冻融效果.

人未受精MⅡ期卵冻融过程中减数分裂纺锤体及透明带的变化

目的 观察人类MII期卵母细胞冻融过程中纺锤体及透明带的变化. 方法 50例非男性因素的不育妇女,将常规体外受精后未受精的MII期卵母细胞进行慢速冷冻/快速复苏,使用Polscope系统观察冻融过程中纺锤体及透明带的变化;将复苏存活的卵母细胞分别培养1、3、5 h后观察纺锤体的变化. 结果 95枚未受精卵中52枚冷冻前和冷冻过程中均能观察到纺锤体.卵母细胞进入复苏-1液后47.8%可观察到纺锤体,后逐渐消失.46枚复苏存活卵母细胞分三组体外培养,1 h纺锤体检出率为40.8%;3 h为100.0%;5 h为88.1%,差异具统计学意义.另外,冻融前后卵母细胞透明带的双折射性也发生了改变. 结论 卵母细胞的冻融过程会引起纺锤体及透明带的损伤,卵母细胞复苏后纺锤体进行重建.复苏后培养3 h左右纺锤体的重建率高.

纺锤体检测点与胚胎非整倍体的关系

纺锤体检测点对有丝分裂和减数分裂中期与后期转换过程中纺锤体的形成起着非常重要的作用,其组成成分初是在发芽的酵母中通过基因检测证实,此后发展到人,大量细胞中均发现某些检测蛋白.研究表明,纺锤体检测系统参与雌性哺乳动物减数分裂的调控,防止胚胎非整倍体的发生.本文阐述在有丝分裂和减数分裂中关于纺锤体检测点的研究进展,了解检测信号传导通路及其在减数分裂中防止染色体异常的作用,进一步探讨胚胎非整倍体发生的原因.

顺式高尔基体蛋白GM130影响小鼠卵母细胞纺锤体组装

目的 确定顺式高尔基体蛋白GM130对小鼠卵母细胞纺锤体组装的影响. 方法 免疫荧光法检测GM130在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位,并用免疫印迹法半定量检测其表达水乎;接着用微管解聚药物诺考达唑处理小鼠MⅠ卵母细胞,明确GM130与微管动力的关系.免疫印迹检测注射GM130特定的寡聚核苷酸(morpholino,MO)后卵母细胞中GM130的表达水平,免疫荧光法检测纺锤体的形态变化及中心体相关蛋白γ-tubulin和Plk1的定位. 结果 M130在卵母细胞减数分裂成熟的不同阶段有不同的特异性定位,主要集中分布在生发泡周围、纺锤体的两极和中体及分散于胞浆.GM130在MⅠ和MⅡ期与中心体相关蛋白p-MEK1/2共定位并与纺锤体的组装密切相关.免疫印迹试验表明GM130在卵母细胞发育的各个时期均有表达.降调GM130的表达后,纺锤体组装异常比例升高,且大多数为拉长的纺锤体;第一极体排出率下降,在排出的极体中,大极体的比率升高,并影响γ-tubulin和Plk1的正确定位. 结论 GM130可能作为一种微管组织中心相关蛋白调节纺锤体的组装.

顺式高尔基体蛋白GM130影响小鼠卵母细胞减数不对称分裂的研究

目的 确定顺式高尔基体蛋白(GM130)对小鼠卵母细胞纺锤体迁移及减数不对称分裂的影响. 方法 免疫荧光法检测GM130在小鼠卵母细胞的定位,活细胞工作站延时拍摄系统捕捉纺锤体在降调GM130表达后的的动态变化.结果 降调GM130的表达后,第一极体排出率下降,在排出的极体中,大极体的比率升高；但对微丝网络及微丝帽的影响不明显.向卵母细胞内注射β5-tubulin-GFP mRNA和GM130特定的寡聚核苷酸(morpholino,MO)的混合物后,用活细胞工作站延时拍摄系统证实了降调GM130会影响卵母细胞纺锤体的迁移,纺锤体单极拉长,并能与该侧的皮质接触,产生胞质分裂环,导致大极体排出.若拉长的纺锤体尚不能与皮质接触,则细胞阻滞在分裂中期Ⅰ(MI期),没有极体排出.另外,降调GM130的表达也会影响磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(p-MEK1/2)在纺锤体极的定位,用丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)的抑制剂U0126处理MI期的卵母细胞则发现GM130不再在纺锤体两极聚集,而是散在分布于胞浆. 结论 GM130可能参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在小鼠卵母细胞纺锤体迁移及不对称分裂中起重要作用.

冷冻环玻璃化法冷冻小鼠卵母细胞的效果评价

目的 评价ED15(15%ethylene glycol,EG+15% dimethylsulphoxide, DMSO)冷冻环玻璃化法冻存小鼠成熟卵母细胞的效果,以及对其纺锤体形态、染色体分布和发育潜能的影响.方法 分别以小鼠新鲜成熟卵母细胞为对照组,玻璃化冷冻复苏卵母细胞为冷冻组.玻璃化冷冻以冷冻环为载体,以乙二醇(EG)及二甲亚砜(DMSO)联合作冷冻保护剂.解冻后观察细胞存活情况并对解冻后培养0、1、2 h的卵母细胞行纺锤体及染色体免疫荧光染色,激光共聚焦扫描显微镜观察;其余卵母细胞行体外受精培养,计算受精率、囊胚形成率.结果 冷冻组成熟卵母细胞存活率为98.2%,复苏后卵母细胞培养0、1、2 h的纺锤体形态正常率及染色体分布正常率与对照组比较无显著性差异(分别为87.0%、90.9%、90.3% vs 95%,P＞0.05;91.3%、95.4%、93.5% vs 90%,P＞0.05);冷冻组受精率及囊胚形成率与对照组比较均无显著性差异(81.3% vs 85.2%,P＞0.05;76.1% vs 75.4%,P＞0.05).结论 ED15冷冻环玻璃化法冻存小鼠成熟卵母细胞复苏存活率高,对其纺锤体形态、染色体分布及发育潜能无明显影响.

不同纺锤体观察情况的卵母细胞的ICSI结局

目的 通过在纺锤体观察仪下行卵胞浆内单精子注射(ICSI),比较不同纺锤体观察情况的卵母细胞的ICSI结局. 方法 2014年2～5月间,就诊于我中心的反复IVF失败、获卵数较少、高龄妇女、卵母细胞质量较差、胚胎发育差而导致可移植胚胎数少或者无可移植胚胎的患者30例,在纺锤体观察仪下行ICSI操作.观察卵母细胞受精情况和胚胎发育情况,并比较观察到纺锤体组和未观察到纺锤体组胚胎的正常受精率、异常受精率、总受精率、卵裂率、可移植胚胎率和优质胚胎率. 结果 30例行ICSI助孕的患者,共获卵149枚,其中MII卵118枚;72枚MII卵观察到纺锤体,纺锤体观察率为61.01％;观察到纺锤体组和未观察到纺锤体组卵母细胞的总受精率(94.44％ vs.80.43％)、正常受精率(83.33％ vs.54.35％)、异常受精率(11.11％ vs.26.09％)均有统计学差异(P＜0.05);未观察到纺锤体组胚胎的卵裂率、可移植胚率和优质胚胎率低于观察到纺锤体组,但均无统计学差异(P＞0.05). 结论 ICSI授精时观察到纺锤体的卵母细胞受精结果优于未观察到纺锤体的卵母细胞;使用纺锤体观察仪进行ICSI有助于避免纺锤体损伤,进而改善受精结局.

蔗糖预处理去核:一种可靠的无损害小鼠卵母细胞MII期核去除法

小鼠是发育生物学中为有用的实验动物模型,特别是在核移植方面.自从1983年Mc-Grath等[1]报道成功地进行小鼠的核移植以来,已采用小鼠的4-8细胞期的早期胚胎细胞[2]、桑椹胚[3]、内细胞团和滋养层细胞[4]以及体细胞[5]进行了核移植,并获得了后代.作为核移植的受体,可采用去核的合子[1],2-细胞期胚胎[6,7]和去核卵母细胞[8].其中以去核卵母细胞使用为广泛,它可接受各个时期以及不同类型的供体细胞[9].但MII期小鼠卵母细胞的核(纺锤体)不能在相差显微镜下观察到[10].

ICSI操作中增加显微操作皿对妊娠结局的影响

目的 探讨在ICSI过程中增加显微操作对ICSI助孕妊娠结局的影响. 方法 选取2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治疗的获卵数＞6枚的患者,共363个周期.本研究分为实验组(121个周期)和对照组(242个周期).实验组:在ICSI操作中应用两个操作皿,注射5枚卵母细胞更换一次操作皿,替换下来的操作皿置37℃培养箱内复温,两个操作皿交替使用.对照组:在ICSI操作中应用一个操作皿,每次注射5枚卵母细胞,操作皿重复使用.比较两组人群的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、种植率、临床妊娠率等. 结果 实验组囊胚形成率显著高于对照组(27.82％vs.21.36％,P＜0.05);新鲜周期移植,实验组种植率比对照组高,但差异无显著性(40.00％ vs.32.28％,P＞0.05);实验组临床妊娠率显著高于对照组(65.38％ vs.51.52％,P＜0.05). 结论 两个ICSI操作皿的交替平衡使用可以增加囊胚形成率,改善妊娠结局.因此获卵数过多时建议配备两个ICSI皿,以期获得更好的妊娠结局.

纺锤体毒物检测实验/依托尼嗪中毒24例报告/新洁尔灭中毒伴急性肾功能衰竭救治1例/过氧化物酶体研究进展/胞质转硫酶与硫酸化反应及其毒理学意义/烷化剂异环磷酰胺联合T、V、P治疗晚期恶性淋巴瘤22例报告

电针干预对多囊卵巢综合征患者纺锤体及卵子质量的影响

目的 观察超促排卵过程中加电针干预对行体外受精——胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者卵子质量的影响.方法 选择217例行IVF-ET的PCOS患者,按随机数字表分为电针组(119例)和对照组(98例),均给予长方案超促排卵,降调节及促排卵过程中电针组加用电针干预,直至取卵日.观察两组患者纺锤体(纺锤体与极体的位置关系)、获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率、卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)发生率、临床妊娠率、早期自然流产率、促性腺激素(gonadotropins,Gn)用量、时间、绒促性素(human chorionic gonadotropin,HCG)日E2、孕酮(progesterone,P)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平.结果 电针组纺锤体位于极体11点至1点的卵子数占卵子数的比例明显高于对照组(P＜0.05).纺锤体位于极体11点至1点的卵子数与HCG日E2水平及优胚率呈正相关(r =0.19,P＜0.01).与对照组比较,电针组优质胚胎率明显升高(P＜0.05),电针组Gn用量与用药时间减少(P＜0.05),临床妊娠率提高8.36％.结论 纺锤体与卵子质量呈正相关;电针干预可以提高卵子质量,改善PCOS患者临床妊娠率.

TLR4在Hela细胞有丝分裂中的定位特点及其与微管的相互作用研究

目的 Toll样受体4(toll like receptor4,TLR4)是固有免疫的重要成员,主要在吞噬细胞表面发挥免疫应答作用.然而,TLR4在非专职吞噬细胞的细胞表面定位较少,主要定位在细胞内.同时,TLR4在肿瘤组织表达较高,可能参与了细胞增殖的调控,然而其在细胞周期中的分布特征尚不清楚.方法 本研究采用免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察的方法对TLR4在宫颈癌上皮细胞系(Hela)的亚细胞定位进行了探讨;通过免疫荧光共定位实验探讨TLR4与微管蛋白的亚细胞定位的一致性;并应用免疫共沉淀实验研究TLR4与微管蛋白之间可能的相互作用.结果 本研究发现TLR4主要在细胞浆内呈现点状/细颗粒样分布;进一步观察发现TLR4在细胞有丝分裂的过程中显示出纺锤体的形态.随后,通过免疫荧光共定位实验证实TLR4与微管蛋白的亚细胞定位较为一致;同时,免疫共沉淀实验证实TLR4与微管蛋白能够以蛋白复合体存在.结论 本研究结果提示TLR4可能通过对有丝分裂中纺锤体功能的调控参与细胞周期和细胞增殖的过程,为进一步揭示TLR4参与细胞周期和调控细胞增殖的生物学功能拓展了思路.

小鼠卵母细胞减数分裂过程中LIMK1参与调控Aurora-A在纺锤体的定位

目的 研究小鼠卵母细胞减数分裂进程中活化的LIMK1(pLIMK1Thr508)与Aurora-A亚细胞分布的相关性, LIMK1活性变化对Aurora-A和纺锤体组装的影响.方法 收集21日龄CB6F1小鼠卵母细胞,分别体外培养至生发泡期(GV)、生发泡破裂期(GVBD)、第1次减数分裂中期(MI)、第1次减数分裂后期(AI)和末期(Tel I)以及第2次减数分裂中期(MII),固定并利用免疫荧光染色法分析减数分裂进程中pLIMK1Thr508的亚细胞定位模式及其与纺锤体组装调控因子Aurora-A的时空相关性;利用抑制剂BMS-3处理MI期细胞,结合免疫荧光染色分析LIMK1活性缺失对于Aurora-A空间分布和纺锤体形成的影响.结果 在小鼠卵母细胞减数分裂前期(prophase)(即GV期), pLIMK1Thr508信号微弱并主要聚集于生发泡,此时 Aurora-A 在胞内没有特殊聚集;在临近减数分裂重启时, pLIMK1Thr508离开生发泡,Aurora-A 信号出现,两者呈高度致密的点状聚集并紧密重合;在生发泡完全破裂后, pLIMK1Thr508和Aurora-A又呈多个点片状聚集在凝集的染色体周围;在MI期和MII期,pLIMK1Thr508与Aurora-A共同定位于纺锤体两极;在从AI期到Tel I期进程中pLIMK1Thr508离开纺锤体两极,聚集在收缩环部位,Aurora-A在纺锤体两极有微弱聚集.LIMK1抑制剂BMS-3能够破坏 Aurora-A在纺锤体两极的聚集,并影响纺锤体结构.结论 pLIMK1Thr508在卵母细胞减数分裂中是一种微管组织中心(MTOC)相关蛋白,可能通过调控Aurora-A而参与纺锤体结构的形成和维持.

不同温度对小鼠卵母细胞纺锤体的影响

目的检测不同温度对卵母细胞纺锤体的影响.方法昆明系小鼠MII期卵母细胞和Balb/c 系小鼠MI期和MII期卵母细胞分别置于不同温度环境各10 min,利用LC-PolScopeTM纺锤体观测系统,观察卵母细胞纺锤体变化.结果环境温度45 ℃对卵母细胞纺锤体有不可逆影响;经41 ℃再恢复到37 ℃后的Balb/c系小鼠MI期卵母细胞纺锤体Retardance值显著高于其他对应组别(P＜0.05);25 ℃时的卵母细胞纺锤体Retardance值显著低于37 ℃于对照组(P＜0.05).结论小鼠卵母细胞纺锤体对温度变化敏感,体外操作时维持37 ℃环境是保持卵母细胞纺锤体正常生理功能的关键.

Pak1在小鼠卵母细胞纺锤体形成中的相关性

目的 研究自动磷酸化Pak1在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位模式及其在纺锤体形成中的相关性.方法 用Western blot检测Ser144位点自动磷酸化的Pak1(pPak1S144)的蛋白表达量的动态变化;免疫荧光染色追踪pPak1S144的亚细胞定位模式及其与纺锤体和微管组织中心蛋白之间的时空关系.结果 在小鼠卵母细胞内pPak1S144持续稳定地表达于减数分裂各期,pPak1S144与中心粒周围蛋白(pericentrin)和γ微管蛋白(γ-tubulin)在时空上呈现紧密的共定位关系并特异地定位于纺锤体两极.结论 pPak1 S144是小鼠卵母细胞MTOC相关蛋白,提示其与减数分裂纺锤体形成相关.

小鼠卵母细胞减数分裂过程中新型微管蛋白ε-tubulin稳定表达并与纺锤体的组装和维持相关

目的 研究新型微管蛋白ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂进程中的蛋白表达、亚细胞定位及其与纺锤体的相关性.方法 用Western blot法检测ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达;免疫荧光染色分析ε-tubulin在减数分裂进程中的亚细胞定位模式及其与纺锤体的相关性.结果 ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期均有稳定的蛋白表达,在减数分裂前期均匀分布在细胞核中,在生发泡破裂后直到第二次减数分裂中期始终保持与纺锤体微管的共定位特性,并持续存在于染色体上.ε-tubulin对纺锤体毒性药物Taxol和Nocodazole敏感并呈现出与微管一致的反应性.结论 小鼠卵母细胞内新型微管蛋白ε-tubulin稳定表达并与纺锤体的组装和维持相关.

天花粉蛋白对小鼠卵母细胞第1次减数分裂的影响

目的 研究天花粉蛋白(TCS)对小鼠卵母细胞第1次减数分裂的影响. 方法 性成熟昆明雌鼠,注射孕马血清促性腺激素10IU后48h,从卵巢中获取未成熟卵母细胞共480枚,在含不同浓度TCS的培养液中,分组进行体外培养,解剖镜下观察并统计其生发泡破裂(GVBD)率和第一极体(PB1)排出率;免疫荧光染色、激光扫描共焦显微镜分析系统观察各组卵母细胞第1次减数分裂过程中纺锤体形成及染色体排列状况.结果 TCS浓度≤15mg/L时,卵母细胞GVBD率、PB1排出率及到达第1次减数分裂中期(MⅠ)的卵母细胞百分率无明显变化;TCS浓度为30mg/L和60mg/L时,到达MⅠ期的卵母细胞百分率降低(P＜0.05),纺锤体形成和染色体排列出现异常,PB1排出率低于对照组(P＜0.05);TCS浓度达到120mg/L时,MⅠ期卵母细胞的百分率显著下降(P＜0.01),GVBD率下降(P＜0.05),浓度为240mg/L时明显下降(P＜0.01). 结论 TCS干扰第1次减数分裂重启及纺锤体形成和染色体排列,阻滞小鼠卵母细胞第1次减数分裂,且这种阻滞作用呈浓度依赖性.

影响高龄小鼠卵母细胞质量的超微结构因素

目的 探讨高龄小鼠卵母细胞线粒体、皮质颗粒、微丝、纺锤体及染色体形态和排布的变化规律.方法 将雌性昆明小鼠分为年轻组(4～8周)和高龄组(48 ～ 52周).腹腔内注射孕马血清促性腺激素(PMSG) 10IU/只行促排卵,48 h后腹腔内注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 IU/只,14 h后收集输卵管的卵冠丘复合物(OCCC).脱去颗粒细胞,获取成熟卵母细胞(MⅡ期)经2％多聚甲醛固定.抗小鼠α-tubulin单克隆抗体染色卵母细胞纺锤体的微管,罗丹明标记的鬼笔环肽染色微丝,FITC结合的小扁豆凝集素染色皮质颗粒,Mito TrackerGreen FM染色线粒体.激光扫描共焦显微镜下观察.结果 共获取小鼠卵母细胞372枚,其中年轻组179枚,高龄组193枚.高龄组小鼠卵母细胞纺锤体异常率(71.78％±1.27％)、染色体排列异常率(65.16％±1.52％)明显高于年轻组(18.93％±1.27％,32.24％±1.10％)(P＜0.01,P＜0.01);高龄组小鼠卵母细胞线粒体的荧光强度(28.09±6.62)明显低于年轻组(45.07±5.90) (P ＜0.01);高龄组小鼠成熟皮质颗粒(Ⅲ级皮质颗粒)(51.00％±1.00％)明显低于年轻组(94.04％±0.71％)(P＜0.01).结论 高龄小鼠卵母细胞中各主要细胞器、细胞骨架及染色体排列异常率明显增加,可能是导致高龄受孕率低的重要原因.

紫杉醇致过敏性休克不良反应1例

紫杉醇是细胞毒类药物,对多种肿瘤均有明显的疗效,尤其在乳腺癌及卵巢癌的治疗中更为突出,目前已广泛应用于乳腺癌及卵巢癌的治疗.本品在细胞增殖周期抑制细胞有丝分裂,抑制纺锤体和纺锤丝的形成,从而阻碍细胞分裂,阻止肿瘤细胞的增殖[1].本人收集我院2008年1月至8月应用本药治疗卵巢癌、乳腺癌等妇科肿瘤28例,其中1例出现过敏性休克,经积极抢救患者脱离了危险.现报告如下.