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肝纤宁颗粒对肝纤维化模型大鼠肝细胞的影响
目的:观察肝纤宁对肝细胞生存的影响.方法:用CCl4肝纤维化模型大鼠肝细胞,观察肝纤宁培养对其生长的作用.结果:肝纤宁能提高肝细胞存活率,降低肝细胞培养上清液转氨酶(ALT),升高糖原(PAS)及酸性磷酸酶(ACP)含量,电镜观察肝纤宁组线粒体肿胀少而轻,滑面内质网增生,扩张不明显,损伤性细胞结构少.结论:肝纤宁能提高肝细胞存活率,促使肝细胞修复再生,从而发挥抗肝纤维化作用.
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生物人工肝肝细胞培养研究进展
近年来,体外人工肝支持系统得到了极大的发展,先后出现了多种模式,Uchino 等[1]将人工肝分为生物型、非生物型、中间型及杂合生物型等四种类型.目前公认以杂合性生物人工肝效果好,是人工肝支持系统(BALSS)的主流模式.杂合性生物人工肝一般由三部分组成:①生物成份;②生物反应器;③血液灌流系统.在这三部分中,生物成份是BALSS的核心,主要为动物或人的肝细胞培养物,发挥肝细胞的合成、代谢、解毒、排泄以及免疫等功能.可以说,获得大量具有良好肝特异功能的细胞是关键,BALSS的效果主要取决于所用肝细胞的功能.本文对近来用于生物人工肝的肝细胞培养的进展作一综述.
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肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养时的肝细胞功能
目的:利用原代培养的大鼠肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,研究骨髓间质干细胞对肝细胞功能的影响,以便更好用于肝细胞移植及生物人工肝.方法:采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离大鼠旰细胞,获得有活性生的肝细胞进行原代培养.台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活性;光镜下动态观察细胞形态学改变,并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能.比较肝细胞单纯培养及其与骨髓间质干细胞共同培养时细胞的功能.结果:培养7 d时两组均仍然维持白蛋白分泌及尿素合成功能;共同培养组与单纯肝细胞培养组在白蛋白分泌(13.75＞2.179,P＜0.05)及尿素合成功能(7.27＞2.179,P＜0.05)存在显著性差异,共同培养组明显高于单纯培养组.结论:肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,可以使肝细胞维持特异性功能,提高肝细胞活性.
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生物人工肝研究的若干新进展
生物人工肝的研究在近年取得了较大进展.聚氨酯泡沫(PUF)等新型材料用于肝细胞培养、肝细胞与骨髓细胞共同培养以及肝细胞生长因子的应用对肝细胞的生长与代谢是有益的;培养液中添加激素与氨基酸有助于恢复受血浆损伤肝细胞的功能;甘氨酸及ZVAD-fmk等细胞保护剂有益于维持生物人工肝的代谢功能;甲磺酸萘莫司他(NM)可预防FHF血浆对肝细胞的损伤作用,保持猪肝细胞在FHF患者血浆中的活性,使猪肝细胞生物人工肝性能进一步增强;纤维膜孔隙、膜组成成分及暴露时间是影响猪内生逆转录病毒(PERV)跨膜传播的主要因素;生物人工肝的疗效得到进一步验证;一些学者对物理型人工肝或/和中间型人工肝与生物人工肝组成的混合型生物人工肝进行了新的尝试.
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肝细胞、胰岛细胞与储脂细胞共培养对肝细胞功能的影响
目的:探讨肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养对肝细胞功能的影响.方法:采用改良胶原酶消化法分离获得大鼠肝细胞和储脂细胞,同时利用梯度离心分离胰岛细胞.分两组实验,肝细胞培养组(对照组),肝细胞用RPMI1640、胰岛素10-7mol/L、100 mL/L FBS及地塞米松10-8 mol/L配成细胞悬液,2 mL放入9 cm2培养瓶中连续培养15 d(37℃50mL/LCO2).肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养组(实验组):将1×107/L的储脂细胞2 mL先加入培养瓶中,培养条件及培养液同肝细胞培养组,培养48 h后弃上清后将肝细胞2×108/L 2 mL和胰岛细胞(100个)分别加入并观察肝细胞存活情况;全自动生化分析仪测定培养上清液中总蛋白及尿素氮的含量;两组细胞均在培养10 d行细胞组织学及组织化学检测,包括肝细胞HE染色、肝细胞内糖原PAS染色及葡萄糖-6-磷酸酶染色检测.结果:培养第7 d对照组部分肝细胞脱落,核固缩,胞质破碎分解.而实验组肝细胞粘壁生长好,肝细胞、储脂细胞和胰岛细胞相间形成团状和索形.培养10 d对照组肝细胞核完全固缩,胞质破碎分解,糖原、葡萄糖-6-磷酸酶的表达消失;实验组肝细胞呈片状,胞质饱满,糖原、葡萄糖-6磷酸酶的表达良好.培养5 d后实验组白蛋白及尿素氮的合成明显高于对照组(P＜0.05).结论:肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养明显延长肝细胞存活期.
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生物人工肝的细胞培养及反应器进展
生物人工肝支持系统(BALSS)由肝细胞、专用反应器和体外循环系统三大要素共同构建.其中生物活性部分的体外培养技术与反应器设计的优劣是影响BALSS性能的重要因素.为使培养肝细胞的数量、活性和功能更理想,近年各种培养技术及其相应反应器均从各个方面改进以期实现"拟肝化培养".现就目前常用于BAL的肝细胞培养方法及其相应反应器的现状及进展进行综述.
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生物人工肝支持系统生物反应器的建立及体外转流试验
目的探讨由微载体培养的L-02人肝细胞和中空纤维舱构成的生物反应器的生物效能.方法采用微载体培养高浓度L-02人肝细胞,同时使用中空纤维型生物反应器和血泵等共同构成生物人工肝系统.在体外转流试验中观察循环液中游离胆红素、葡萄糖、白蛋白、谷草转氨酶浓度的变化以及实验对肝细胞的影响等.结果 L-02肝细胞能很好地粘附于cytodex 3微载体上形成微载体诱导的肝细胞聚集体;移入生物反应器内进行体外循环,4 h后可见循环液中游离胆红素和葡萄糖浓度显著降低,分别为27.1μmol/L和1.75 ninol/L;白蛋白含量明显增加,为15.21 mg/L;肝细胞仍有较高活力达75%.结论本实验所建立的生物反应器作为生物人工肝系统的核心组件具备一定的生物合成和解毒代谢功能,为进一步建立混合型生物人工肝支持系统奠定了基础.
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肝组织工程研究中生物反应器的研究进展
文章就生物反应器的特点、生物反应器在肝组织工程中的应用(肝组织重建、生物人工肝脏、药物筛选、生物反应器在肝组织工程其他相关方面的应用)进行综述,论述目前生物反应器亟待解决的问题是供氧问题、细胞密度和分布及微型化,指出生物反应器作为一个重要的媒介促进肝组织工程及生物人工肝的研究发展;同时肝细胞反应器可有效提高培养肝细胞的生物功能,其也将为肝再生医学的理论研究、肝脏的药物代谢及功能评价等提供有效的技术手段,肝细胞生物反应器的研发具有重要的理论意义和巨大的经济价值.
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肝细胞培养过程中酸碱度和溶解氧的关联控制
目的在生物型人工肝支持系统(BAL)中,设计一种能够精确控制溶解氧(D0)与酸碱度(pH)的控制方案.方法根据肝细胞培养过程中所需要的物料衡算,采用比例积分(PI)算法结合开关量控制、预测控制等方案,通过工控机构建关联控制系统,使得D0与pH的值相互关联.结果DO控制范围0%～200%,精度达到±5%;pH控制范围6～8,精度达到±0.05.结论经实验证实,本控制方案工作稳定,无静态误差,解决了培养过程中DO与pH相互影响的问题,可用于BAL中对肝细胞培养环境的控制.
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生物人工肝及人工肝支持系统
生物型人工肝是与正常肝脏为接近的人工肝支持系统.生物反应器和肝细胞培养是生物人工肝的核心部分,其性能直接关系到人工肝支持的效率和效果.而人工肝的治疗不能脱离开人工肝支持设备进行.本文从生物反应器、肝细胞培养、人工肝支持设备原理、硬件以及应用进行综述.
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一种新型生物人工肝支持系统
目的 构建一套拥有独立知识产权的新型生物人工肝支持系统,用以满足生物型人工肝临床治疗的需要.方法 针对肝细胞生长过程中的各种特殊环境要求,设计了以关联控制为核心的控制算法,结合PID技术、预测控制等方法,实现了对各种指标的稳定控制.实验中使用HepG2连续培养60 h,用以验证生物反应器的实际效果.结果 温度控制在37℃±0.2℃,溶解氧含量控制在95%±10%,酸碱度控制在(7.3±0.2)pH.细胞连续培养60 h,经镜检,其效果优于对照组.结论 细胞生长过程上的各项主要指标控制稳定,细胞在本系统中生长状态良好,为下一步的实验奠定了坚实的基础.
关键词： 生物型人工肝支持系统 构建 生物反应器 肝细胞培养 控制系统 -
生物人工肝的研究进展
近年来杂化型生物人工肝在治疗急性肝功能衰竭中发挥了很大的治疗作用,是研究多、有希望的人工肝.随着细胞培养技术和细胞工程技术的发展,肝细胞培养系统配合生物反应器提供肝功能的研究取得了重大进展.本文就人工肝的发展历程,特别是杂化型生物人工肝研究中的核心问题肝细胞来源、培养方法及生物反应器的发展做了详尽的综述.
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成年大鼠体外培养肝细胞方法的研究
肝细胞培养作为观察药物是否对肝有损害作用的体外实验工具，多年来一直被广泛采用，它比整体运动用药量少，易排除体内多种因素的影响。原代培养大鼠肝细胞是一种较好的体外研究方法，以它完整的实验体系而便于作专项机理研究。我们通过多次实验探索，现察比较后选择佳方法来获得高活率、高产率及良好生长代谢活力的肝细胞。1 材料与方法1.1 动物：wistar大鼠，雄性，体重100～150 g，饥饿24 h。1.2 试剂1.2.1 肝灌注用药 D-Hanks溶液。 胶原酶溶液：10 mg IV型胶原酶(sigma分装)溶333 mL含10%胎牛血清(EBS)的DMEM-F12培养液中，4℃冰箱保存，次日滤菌，新鲜使用。1.2.2 培养用药 DMEM-F12培养液(购自Gibco公司)：用100 mL3蒸水溶解滤菌使用。 胎牛血清：购自天津市血液研究所。
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三维多孔微载体支持下人肝细胞L-02的培养
目的:对壳聚糖三维多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的形态学观察、细胞功能和代谢活性检测.方法:本研究以自制的壳聚糖三维多孔微载体样本为支架来培养人肝细胞L-02,用细胞计数、倒置相差生物显微镜和扫描电子显微镜对其进行定时的形态学观察,并进行定时的细胞功能检测(包括测定谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶水平)和代谢活性检测(包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量).结果:两组培养的细胞数量均呈现前3d增长,在第3d细胞数量达到高值;而且实验组3个样本培养的细胞数与对照组无微载体培养的细胞数量相比,均始终明显高于后者,两者差异具有统计学意义(P ＜0.05),而实验组各样本培养的细胞之间无明显差异(P＞0.05);在倒置相差生物显微镜下进行动态观察,可看到前3d微载体表面黏附生长的肝细胞则逐渐增多,在第3d时可见大部分微载体表面有许多肝细胞黏附成团,总的存活率均在90%以上,且肝细胞保持着良好的形态学结构;扫描电子显微镜下,在微载体表面、切面和内部均可看到有许多球状肝细胞紧密黏附.实验组和对照组测定的AST、ALT和LDH含量在前3d持续下降,第3d降到低,而从第4d AST、ALT、LDH含量开始重新反弹上升,但ALB、UREA和GLUCOSE含量在前3d持续上升,第3d升到高值,而从第4d ALB、UREA和GLUCOSE含量开始逐渐下降,实验组每天测定上述各项含量始终明显高于对照组,表明两组各项含量的差异具有统计学意义(P＜0.05),提示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强;而实验组中微载体样本1、2、3之间测定的各项含量无明显差异,表明实验组3个样本间各项含量的差异无统计学意义(P ＜0.05).结论:本研究以自制的壳聚糖三维多孔微载体作为一种支架,在体外三维环境下可以进行高密度细胞培养,为肝细胞移植、生物人工肝研究中进一步以微载体黏附培养足够数量、功能良好的肝细胞提供了一定的理论和实验依据.
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壳聚糖球形多孔微载体支持下培养的肝细胞功能及其代谢活性检测
背景:在肝细胞移植及生物型人工肝研究中,细胞培养仍然是其关键,何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题.微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术,年来已在肝细胞的体外培养中得到应用.目的:对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能和代谢活性检测.方法:对以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能检测(包括测定谷草转氨酶,丙转氨酶和乳酸脱氢酶质量浓度)和代谢活性检测(包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量),中实验组为壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,照组为无壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,测时间点为人肝细胞L-02培养的第1,,3,,5天.结果与结论:实验组和对照组测定的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性在前3 d持续下降,3天降到低,从第4天开始重新反弹上升;但白蛋白、尿素和葡萄糖水平在前3 d持续上升,3天升到高值,从第4天开始逐渐下降,验组每天测定上述各项水平始终明显高于对照组(P < 0.05),示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强.
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壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞L-02的高浓度细胞培养
背景:微载体培养技术作为一项体外高浓度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用.目的:对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的形态学观察.方法:以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架来培养人肝细胞L-02设为实验组;无壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞的培养设为对照组.对两组细胞进行定时的细胞计数,并对实验组进行形态学观察,包括倒置相差生物显微镜观察和扫描电子显微镜观察.结果:两组培养的细胞数量均呈现前3 d增长,在第3天细胞数量达到高值;而且实验组3个样本培养的细胞数明显高于对照组无微载体培养的细胞数量(P < 0.05),实验组各样本之间差异无显著性意义(P > 0.05);倒置相差生物显微镜下动态观察,可见前3 d微载体表面黏附生长的肝细胞则逐渐增多,第3天可见大部分微载体表面有许多肝细胞黏附成团,总的存活率均在90%以上,且肝细胞保持着良好的形态学结构;扫描电子显微镜观察,微载体表面、切面和内部均可看到有许多球状肝细胞紧密黏附.提示,以自制的壳聚糖球形多孔微载体作为一种支架,在体外三维环境下可以进行高浓度细胞培养.
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球形多孔微载体支持下高密度培养人肝细胞L-02的定时形态变化
背景：微载体培养技术作为一项体外高浓度细胞培养技术，近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的：对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的形态学观察。方法：以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架来培养人肝细胞 L-02设为实验组；无壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞的培养设为对照组。对两组细胞进行定时的细胞计数，对实验组进行形态学观察，包括倒置相差生物显微镜观察和扫描电子显微镜观察。结果与结论：两组培养的细胞数量均呈现前3 d增长，在培养第3天细胞数量达到高值；实验组3个样本培养的细胞数明显高于对照组无微载体培养的细胞数量(P<0.05)，实验组各样本之间细胞数差异无显著性意义(P>0.05)。倒置相差生物显微镜下动态观察，可见前3 d微载体表面黏附生长的肝细胞则逐渐增多，培养第3天可见大部分微载体表面有许多肝细胞黏附成团，总的存活率均在90%以上，且肝细胞保持着良好的形态学结构；扫描电子显微镜观察，微载体表面、切面和内部均可看到有许多球状肝细胞紧密黏附。结果说明，以自制的壳聚糖球形多孔微载体作为一种支架，在体外三维环境下可以进行高浓度细胞培养。
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超速玻璃化法冻存小鼠肝细胞球形聚集体的初步研究
现有的肝细胞冻存法是将分散的肝细胞用于冻存.从肝组织消化分离的肝细胞,其细胞完整性和功能都会受影响.有报道用肝细胞球形聚集体培养,效果优于用分散肝细胞培养[1].玻璃化法冻存细胞组织,由于不形成冰晶,对细胞损伤较小,已成功用于冻存胚胎、卵巢、胎肝组织和脑细胞[2-5].本研究将小鼠肝细胞预培养成球形聚集肝细胞,用改进的超速玻璃化法冻存,解冻后与含胶原培养液混合、培养,通过检测培养上清液中ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH)浓度判断肝细胞受损漏出情况,检测白蛋白( Alb)浓度判断肝细胞合成功能.对照组用单层贴壁培养分散肝细胞做同样冻存和检测.
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不同方法分离大鼠肝细胞的比较研究
如何获得足够数量的肝细胞并保持良好的活性和功能是目前研究肝细胞移植及生物型人工肝支持系统的难题.由于分离、培养技术的差异很大,实验结果难以稳定.为此,我们比较了几种分离大鼠肝细胞的方法,探索一种可靠的方法以促进肝细胞培养在肝病研究领域的开展与应用.
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复合胶原纳米粒子在猪肝细胞培养中的应用
目的:制备聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米材料和I型胶原复合物进行猪肝细胞的体外培养.方法:用超声乳化法制备PLA-O-CMC纳米粒子,扫描电镜对其进行表征.采用Ⅳ型胶原酶原位循环灌流法分离猪肝细胞.将肝细胞分为:Ⅰ组(裸细胞培养组)、Ⅱ组(复合胶原纳米粒子细胞混合培养组)进行培养,观察肝细胞形态结构及功能变化.结果:PLA-O-CMC纳米粒子及Ⅰ型胶原为肝细胞的生长提供了良好的支架和外环境.体外肝细胞的生长也从平面型向三维型迈出了较大的一步.培养猪肝细胞能保持良好的活性和白蛋白分泌功能.结论:PLA-O-CMC纳米粒子及Ⅰ型胶原体为肝细胞生长的良好载体.
关键词： 聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖 Ⅱ型胶原 纳米材料 肝细胞培养 肝细胞移植
