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屏风固金颗粒免疫调节作用的血清药理学研究
屏风固金颗粒由黄芪、白术、防风、太子参、金银花、连翘、藿香、防风、甘草等组成.本实验采用血清药理学方法,通过测定屏风固金颗粒含药血清对自然杀伤细胞(NK细胞)杀伤活性、脾脏T淋巴细胞增殖活性及分泌白细胞介素-2(IL-2)的活性等指标,探讨该药的免疫药理活性及其作用机制.
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制备人工抗原提呈细胞促进NK细胞增殖和抗肿瘤效应的研究
目的 制备双表达CD86和4-1BBL的人工抗原提呈细胞,建立在体外大量的扩增具有较高杀伤活性的人NK细胞的有效方法.方法 将表达CD86和4-1BBL的慢病毒感染K562细胞,制备成人工抗原提呈细胞(aAPC),与人外周血单个核细胞(PBMC)共培养,使NK细胞在体外大量扩增.结果 在培养d15天时,细胞数量达到2.7×1010个,CD3 CD56+细胞纯度达到99.4%,细胞体外杀伤活性为96.27±1.27%;在小鼠肺癌模型中,治疗组比对照组肿瘤体积明显减小.结论 成功制备了有效扩增NK细胞的人工抗原提呈细胞(aAPC),建立了在体外高效扩增具有较高杀伤活性的NK细胞的有效方法,为肿瘤和慢性感染性疾病的过继细胞免疫治疗奠定了基础.
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CFSE/PI双标法检测CIK细胞对顺铂预处理肿瘤细胞的杀伤活性
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞,具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点.如何对CIK细胞的效应功能进行客观准确的评价,如何使CIK和化疗有机地结合在一起,对CIK的临床应用具有重要的意义.
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PHA诱导的CIK细胞的生物学特性及其对K562细胞杀伤活性影响的研究
本研究探讨植物血凝素(PHA)诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与传统方法制备的CIK细胞的体外增殖能力、效应细胞含量和对K562细胞杀伤活性影响并分析其差异.分离健康人外周血单个核细胞(PBMNC),分甲、乙两组,其中甲组用传统培养方法从PBMNC制备的传统CIK细胞,乙组采用PHA诱导单个核细胞制备获得的新型CIK细胞.在培养过程中,每3d统计各组细胞培养体系中细胞活率和细胞绝对值,并在培养至第15天时,用流式细胞仪分别检测两组细胞免疫表型,统计CD3+ CD56+、CD3+ CD8+和CD3+ CD4+细胞占各培养体系总细胞数的比例;同时用CCK-8试剂盒分别检测两组细胞在不同效靶比时对K562细胞的杀伤活性.结果表明:采用PHA诱导制备新型CIK细胞的方法比传统方法更能促进细胞增殖(P<0.05),且细胞活率都保持在90%以上.两组CD3+ CD8+、CD3+ CD56+细胞比例都显著升高.与传统方法比,新方法的CD3+ CD8+细胞升高比例存在显著差异(P<0.05),CD3+ CD56+细胞提升比例不存在差异,同时CD3+ CD4+下降的比例也不存在差异.效靶比为5:1、10:1、20:1、40:1时,PHA诱导制备的新型CIK细胞比传统方法制备的CIK细胞对K562细胞的杀伤活性更强(P<0.05),且随着效靶比的升高两种效应细胞对K562细胞的杀伤活力的差异明显性也增加.结论:与传统方法相比,PHA可明显提高CIK细胞的增殖能力,调高CD3+ CD8+细胞的比例,增强CIK细胞对K562细胞的杀伤活性,这为白血病及其他肿瘤的细胞免疫治疗提供一种新来源的CIK细胞和可靠依据.
关键词: 植物血凝素 细胞因子诱导的杀伤细胞 K562细胞 杀伤活性 -
不同刺激因子对人CIK细胞功能影响
本研究观察不同的细胞刺激因子共刺激对人CIK细胞增殖和功能的影响.用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞(PBMNC),按常规方法从PBMNC培养细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞),然后根据加入CD28 mAb、IL-15和IL-21将实验分为5组:对照组(CIK),CB28+ IL-15+ IL-21组,IL-15+ IL-21组,CD28+ IL-15组和CD28+ IL-21组.用全自动五分类血液分析仪计数CIK细胞的增殖能力;用流式细胞术测定细胞刺激因子诱导的CIK细胞的粒酶B(granzyme B),穿孔蛋白(pefforin)和CD107α 等分子的变化;用ELISA法检测细胞因子IL-10、IL-12、INF-γ和TNF-α的含量;乳酸脱氢酶释放法测定细胞刺激因子共刺激的细胞对人肺癌细胞株A549(A549)、乳腺癌细胞株MFC-7(MFC-7)和人黑素瘤细胞株HME1(HME1)的杀伤活性.结果表明,在CIK细胞培养体系中加入不同的刺激因子,细胞增殖能力有明显的差异,以含CD28、IL-15和IL-21组细胞增殖倍数高,在培养第10日时该组的增殖倍数为255.3±6.3,明显高于对照组,IL-21+ IL-15组和CD28+ IL-21组细胞增殖倍数分别为166.6±13.5、199.4±15.0和228.8±16.6(P<0.05),添加CD28和IL-15组则穿孔蛋白含量明显高于其他组.所有共刺激组的穿孔蛋白、粒酶B和CD107a表达百分率均明显高于对照组(P<0.05).对A549、MFC-7和HME1细胞杀伤活性以含CD28+ IL-15组高(82.2%、59.3%和70.6%),明显高于对照组(60.9%、49.6%和48.4%)(P<0.05).在CIK细胞培养体系中增加CD28+ IL-15+ IL-21组中细胞分泌IFN-γ量显著高于其他各组(P<0.05).结论:不同刺激因子活化的CIK细胞的增殖能力、分泌细胞因子和杀伤活性有明显差异,在培养体系中增加相应的细胞刺激因子对细胞功能定向培养有一定意义.
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脐血CIK、PHA-CD3AK、CD3AK细胞的研究
过继免疫疗法在恶性肿瘤的治疗中取得了一定效果,寻求新型免疫效应细胞是当前热点之一.采用脐带血单个核细胞制备CD3AK、PHA-CD3AK、CIK 3种细胞,用MTT法测三者对K562和HL-60肿瘤细胞株的杀伤活性,免疫表型检测采用单克隆抗体APAAP法,采用t检验进统计学分析.
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巨噬细胞活化综合征患儿自然杀伤细胞功能分析
目的 研究巨噬细胞活化综合征(MAS)患儿自然杀伤(NK)细胞功能变化.方法 采用流式细胞术检测12例健康对照、12例幼年特发性关节炎全身型(SoJIA)和12例MAS患儿急性期和治疗后5d和3个月外周血中NK细胞数及其杀伤活性、穿孔素、颗粒酶B、γ干扰素(IFN-y)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达.结果 与健康对照和SoJIA对照比较,MAS治疗前和治疗后5dNK细胞计数、杀伤活性、穿孔素和颗粒酶B降低(P<0.05),治疗前分泌IFN-γ、TNF-α增加(P<0.05).治疗后3个月NK细胞计数和分泌IFN-y、TNF-α与健康对照无统计学差异(P>0.05),但NK细胞杀伤活性、穿孔素和颗粒酶B表达仍低于健康对照和SoJIA对照(P<0.05).结论 NK细胞杀伤活性低下和分泌IFN-γ、TNF-α增加参与MAS发生.免疫治疗逐渐恢复NK细胞数目,减少IFN-γ和TNF-α分泌,但杀伤活性和穿孔素、颗粒酶B表达降低是MAS患儿持续存在的NK细胞功能特点.
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用无血清培养基体外扩增CIK细胞的研究
CIK(cytokine-induced killer)细胞是一类细胞因子诱导的杀伤细胞.CIK细胞能大量扩增,而且具有比LAK细胞更强的肿瘤杀伤活性.为了获得临床应用的CIK细胞,必须用自身血浆或无血清培养取代传统的牛血清培养方式,以减少病人意外感染的机会.本实验对有血清和无血清培养条件下CIK细胞的生物活性进行了研究.
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抗人卵巢癌×抗人CD3双特异单链抗体介导的效应细胞在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用
目的研究双特异单链抗体(scBsAb)介导的Jurkat细胞(CD3+)及人外周血单个核细胞(PBMC)在体外对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的杀伤活性,从而探讨其用于卵巢癌治疗的可能性. 方法以抗人卵巢癌×抗人CD3 scBsAb激活效应细胞,以SKOV3为靶细胞,用MTT法测定不同实验条件下的杀伤活性. 结果 (1) 以重组白细胞介素2(rIL-2)、抗CD3单克隆抗体、抗CD28重链单域抗体(VH)预刺激Jurkat及PBMC细胞比单纯用scBsAb激活效应细胞杀伤活性高;(2) 以Jurkat细胞或PBMC细胞作为杀伤细胞可得到相似的杀伤活性,高杀伤率均在75%左右;(3) 杀伤活性与scBsAb的浓度、作用时间及效靶比有关.对于Jurkat细胞,在抗体终浓度为21μg/ml,反应时间为48h,效靶比为10∶1时达到大杀伤率74.8%;对于PBMC细胞,在抗体浓度为20μg/ml,反应时间为72h,效靶比为1∶1时达到大杀伤率73.1%.(4) 多因子联合应用能有效提高杀伤活性. 结论 scBsAb在体外能够有效介导效应细胞杀伤肿瘤细胞,有明显的抗癌作用,具有潜在的应用前景.
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IFN-γ激活的脐血树突状细胞对肿瘤细胞的杀伤作用及其机制研究
树突状细胞(dendritic cell, DC)不仅具有抗原提呈功能,本身也具有一定程度的肿瘤杀伤活性.目前,有关DC直接抗肿瘤活性的研究主要集中于外周血及骨髓来源的DC,而脐带血DC尚未见相关报道.因此,本文以脐血单核细胞诱导的DC为研究对象,检测其在成熟刺激因子γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)激活后对恶性血液病细胞株的杀伤活性,并通过细胞膜及细胞内TNF家族配体的改变初步探讨其杀伤机制.
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CD3AK、LAK对KB、KBv200细胞株耐药逆转前后的杀伤作用
目的探讨免疫活性细胞对肿瘤细胞的杀伤活性与mdr1的关系。方法利用特异性切割mdr1的ribozyme为工具,以表达mdr1的耐药细胞株KBv200为靶细胞,采用脂质体转染技术,将含ribozyme的质粒pHβApr-1neo/5mR3及空载体pHβApr-1 neo导入KBv200及其亲本KB细胞内,运用Northern blotting、免疫组化方法观察ribozyme对mdr1 mRNA及P-170的影响,采用MTT法检测了CD3AK、LAK对KB、KBv200细胞株耐药逆转前后杀伤活性的变化。结果含ribozyme的质粒pHβApr-1 neo/5mR3及空载体pHβApr-1 neo可以在KB、KBv200细胞中稳定表达,ribozyme可以特异性地切割mdr1,导致KBv200/5mR3的mdr1 mRNA含量下降,P-170表达减低,LAK和CD3AK对KBv200的杀伤活性较对KB的强,MDR逆转后杀伤活性降至敏感株水平,LAK和CD3AK对KB/5mR3、KB/vec、KBv200/vec的杀伤活性也较KB及KBv200/5mR3强。结论 mdr1-ribozyme在细胞内具有一定的逆转肿瘤多药抗性的生物学效应,LAK和CD3AK对MDR肿瘤细胞的杀伤活性与P糖蛋白表达相关。
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巨噬细胞对乳腺癌细胞 MCF-7体外杀伤作用的研究
目的::观察巨噬细胞体外扩增特性及其对乳腺癌细胞MCF-7的抗肿瘤作用。方法:将巨噬细胞与乳腺癌细胞MCF-7共培养,获取初期细胞,光镜观察。以MTT法检测巨噬细胞对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率。结果:共培养初期细胞膜完整、细胞折光性强;37℃、5%CO2、不换液、不传代培养后,细胞内颗粒增多、折光性变弱,同时死亡、破碎细胞数量增加;继续培养,细胞几乎全部死亡、破碎,培养至18天左右,体积变大、折光性变强等具有活化特征的细胞出现;采用适当方式换液后,这些折光性较强的细胞的体积迅速增大,进入分裂增殖状态;培养50天左右,细胞的分裂、增殖减缓,细胞吞噬加强,巨大细胞的数量逐渐增多。以MTT法检测巨噬细胞对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率,在效靶比为5:1、10:1、20:1、40:1时,抑制率随着效靶比的增加而增加,成正相关。而当效靶比为100:1时,反而促进肿瘤细胞的增殖。结论:采用死亡肿瘤细胞悬液可诱导PBMC获得巨噬细胞,巨噬细胞在一定浓度的范围内可抑制肿瘤细胞的生长,而当浓度过高时反而促进肿瘤细胞的生长。
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自然杀伤T细胞抗肿瘤免疫的研究进展
自然杀伤T(natural killer T cells, NKT)细胞是一种具有特定标志的T细胞亚群,既表达T细胞表面标志,如CD3、TCRa?(人类表达Va24 V?11,小鼠表达Va14 Ja18),又表达NK细胞的表面标志。NKT细胞只能识别由CD1d分子递呈的特异性糖脂类分子,而不是由主要组织相容性复合物( major histocompatibility complex,MHC)递呈的多肽。NKT细胞活化后可迅速分泌一系列的细胞坏死相关因子,如穿孔素和TNF-α,增强其杀伤肿瘤细胞的作用;还可通过激活其他具有杀伤活性的效应细胞,如NK细胞和CD8+细胞,发挥抗肿瘤作用[1]。目前NKT细胞的抗肿瘤治疗已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段,部分肿瘤患者通过Vα24+NKT细胞体外活化后回输治疗后获得缓解, NKT细胞也成为极具应用前景的抗肿瘤免疫细胞。然而,NKT细胞在抗肿瘤免疫中存在两面性,在发挥抗肿瘤作用的同时,亦可抑制抗肿瘤免疫,这也成为目前国内外研究的热点。本文就NKT细胞的特点、抗肿瘤免疫机制及临床应用予以综述。
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肿瘤浸润淋巴细胞过继免疫治疗黑色素瘤进展
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)是存在肿瘤周围的一群异质性细胞,包括 CD4+T 细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞等,以 CD3+T 细胞为主。TIL 在肿瘤周围浸润的程度及 CD8+T细胞所占的比例与肿瘤患者的预后呈明显正相关[1]。但部分TIL在肿瘤抑制性微环境中呈免疫耐受状态。基于TIL的过继性细胞治疗(adoptive cell transfer,ACT)是将浸润在肿瘤周围的淋巴细胞分离,经体外培养,活化和扩增后回输到患者体内,从而发挥杀伤肿瘤的作用。离体培养的TIL可以脱离肿瘤抑制性微环境的作用,再次活化。因TIL的ACT具有肿瘤特异性好、抗瘤谱广、杀伤活性强以及可在体外大量扩增的优点,在肿瘤过继免疫治疗的研究中受到较多关注。本文将重点探讨TIL的临床应用研究的现状,存在的问题及可能的解决途径。
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血清浓度和培养基对人γδT细胞增殖、表型和杀伤活性的影响
目的 研究血清浓度和培养基对人γδT细胞增殖、表型和杀伤活性的影响.方法 采用AIMV培养基,添加不同浓度胎牛血清对γδT细胞进行培养,比较细胞增殖、表型和杀伤活性.在此基础上,采用不同培养基(AIMV、OpTmizer)对γδT细胞进行培养,比较细胞增殖、表型和杀伤活性.自动细胞计数仪检测γδT细胞数;流式细胞术(FCM)检测γδT细胞表型;CCK-8试剂盒检测γδT细胞对胃癌SGC-7901的杀伤效应.结果 采用AIMV培养基,无血清条件下细胞无法生长,添加5%或10%胎牛血清(FBS)培养,细胞增殖优于添加1% FBS (P=o.024和P=0.006)或10% NBS (P=0.043和P=0.006),具有统计学意义,杀伤活性不具有统计学差异;采用OpTmizer培养基,无血清及添加1% FBS培养均优于添加5% FBS的AIMV培养基,其中,1% FBS与AIMV5% FBS组相比具有显著性差异(P=0.030).结论 OpTmizer培养基比AIMV培养基更适用于临床过继免疫治疗用γδT细胞的无血清培养.
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肝癌细胞抗原致敏树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞
目的:探讨原发性肝癌患者外周血树突状细胞(DC)体外经自体肝癌细胞抗原致敏后,对特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的诱导作用.方法:肝癌患者外周血经梯度密度离心法分离,获得DC前体细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白介素-4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增DC.制备自体肝癌细胞抗原,体外脉冲DC,检测DC诱导自体T细胞增生能力及特异性CTL在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性.结果:经自体肝癌细胞抗原致敏的DC能诱导较强的自体T细胞增生,且能诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC、未经肝癌细胞抗原致敏的DC激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对CT26细胞、BEL-7402细胞无明显的杀伤作用.结论:肝癌患者外周血DC体外能诱导高效而特异的抗肝癌免疫,提示DC可能在肿瘤治疗及预防其复发与转移中发挥重要作用.
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DC负载凋亡肝癌细胞后的免疫应答
目的:评价树突状细胞负载凋亡肝癌细胞后的免疫应答.方法:用放线菌素-D诱导肝癌细胞调亡,在体外用负载凋亡肝癌细胞的DC诱导自身淋巴细胞,使其活化为肝癌特异性T细胞,并用其进行杀伤实验.结果:DC负载凋亡肝癌细胞后活化的CTL细胞分泌较高水平Th1型细胞因子IL-12和TNF,并表现出较高的杀伤活性,对NK细胞敏感的靶细胞慢性髓原性白血病细胞K562也有较强的杀伤作用,提示此CTL同时具备NK特征.结论:负载凋亡肝癌细胞的DC对原发性肝癌的研究和治疗具有潜在应用价值.
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转导单链免疫毒素基因的PBMCs对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤活性
目的:用携带分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因(sFv-TNF-α)的重组逆转录病毒感染人外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMCs),使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白,观察转导的PBMCs对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用.方法:用感染生重组病毒产生细胞C22(PA317/PST)产生的病毒上清转导人PBMCs,采用PCR和RT-PCR方法对转导的PBMCs(PBMCs/PST)进行DNA和mRNA水平的分析.PBMCs/PST与SMMC-7721共培养,MTT法检测PBMCs/PST表达产物对肝癌细胞的体外杀伤活性.结果:PCR及RT-PCR结果显示PBMCs/PST中扩增出外源目的基因对应的电泳条带.MTT法检测结果,分泌型抗肝癌单链免疫毒素对体外培养肝癌细胞SMMC-7721的杀伤率为(38.2±6.7)%.结论:分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因可以在PBMCs中整合并稳定表达,其分泌的表达产物对 SMMC-7721具有一定的体外杀伤作用.
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人源化抗肝癌单链抗体融合突变型TNFα的导向作用
目的:用人源化抗人肝癌单链抗体(hscFv25)融合人突变型TNFα构建重组免疫毒素,对荷肝癌(SMMC-7721)裸鼠进行体内杀伤活性实验.方法:用纯化的hscFv2s-mTNFα重组免疫毒素经尾静脉注射治疗荷肝癌裸鼠,2 wk后处死裸鼠,观察肿瘤的体积、质量,并对瘤组织进行TNFα的免疫组化染色.结果:hscFv2.5-mTNFa治疗组对荷肝癌裸鼠的有效率为5/5,其中2/5为完全缓解,3/5为部分缓解,与mTNFa对照组相比,有显著差异(Xh2=6.62,P<0.05),疗效明显高于对照组,治疗组裸鼠的肝、肺等组织中未见转移性病灶,经hscFv25-mTNFα治疗后的瘤组织,TNFα呈弥漫性阳性反应,主要存在于瘤组织的胞质中.结论:hscFv25-mTNFa对荷肝癌裸鼠具有一定的抑瘤作用,为HCC治疗打下基础.
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携带mIL-12基因的增生型腺病毒对小鼠移植胃癌的治疗作用
目的:研究携带mIL-12基因的增生型腺病毒对小鼠移植胃癌的治疗效果及其作用机制,探讨胃癌治疗的新思路及途径.方法:以ElB55KDa缺失的增生型腺病毒ONYX-015、带有小鼠IL-12(mIL-12)基因的增生型腺病毒CNHK200-mIL-12以及非增生型腺病毒Ad-mIL-12治疗SGC-790lBALB/C裸鼠及MFC 615小鼠胃癌移植模型,从肿瘤大小及动物生存期等方面评价治疗效果;并检测各治疗组的CD4+和CD8+淋巴细胞水平及NK和CTL细胞的杀伤活性,探讨其免疫学作用机制.结果:实验证实增生型腺病毒(ONYX-015,CNHK200-mIL-12)可以有效地杀伤裸鼠体内的SGC-790l胃癌细胞,但是不足以使其完全消退,仅起到延缓生长的作用.荷瘤615小鼠在注射Ad-mIL-12后部分(3/10)肿瘤消退,余者(7/10)生长明显减慢,肿瘤无破溃,生存期明显延长;CNHK200-mIL-12治疗组部分肿瘤(4/10)停止生长,1wk后开始缩小,10-14 d完全消退,其余小鼠肿瘤(6/10)生长明显减慢,肿瘤无破溃,生存期明显延长.免疫学检测发现各腺病毒治疗组的CD4+和CD8+细胞水平以及NK、CTL细胞的杀伤活性均高于对照组,尤以携带IL-12基因者明显(P<0.001).结论:以增生型腺病毒为载体携带IL-12基因可大量杀伤肿瘤细胞并与增生型腺病毒协同发挥抗肿瘤活性.