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密度梯度离心法纯化Vero细胞狂犬病疫苗的研究
笔者应用超滤浓缩和密度梯度区带离心技术,对Vero细胞制备的人用狂犬病疫苗进行了以蔗糖为介质的密度梯度区带离心纯化研究.
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应用Vero细胞制备狂犬病疫苗适条件的研究
我国目前用于预防狂犬病的主要是地鼠肾细胞疫苗,其产量和质量尚不能满足防病、灭病的需要.Vero细胞经WHO检定合格并推荐作为生产人用灭活狂犬病疫苗的传代细胞,不仅来源方便,繁殖速度快,维持时间长,容易控制外源因子污染,而且对狂犬病毒敏感,适合大规模生产.为此,我们对狂犬病毒在Vero细胞上传代的适条件进行了研究.
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李少丽副理事长赴天津开展细胞制备实验室标准制定调研
3月13日,协会李少丽副理事长、吴朝晖秘书长、常月芬副秘书长一行赴天津开展细胞制备实验室标准制定调研。
天津市肿瘤医院是协会生物诊疗临床研究基地和医药生物技术临床应用专业委员会主任委员单位,此次协会领导就制定标准与郝希山院士、郝继辉副院长、任秀宝教授、李慧教授等专家进行了深入探讨,听取了意见。 -
免疫细胞制剂制备质量管理自律规范
近年来,随着我国细胞免疫治疗的发展,业内要求规范细胞免疫治疗的呼声日渐增多。细胞免疫治疗是否安全、有效,一方面取决于细胞本身,这需要科学家对不同细胞进行深入细致的研究来确定;另一方面还取决于细胞制备环节,是否能保证制备出符合质量标准、未受污染的细胞制剂。因此加强免疫细胞制剂质量管理,对细胞免疫治疗的临床研究和应用尤其重要。由于免疫细胞制剂基本上都是小批量,绝大多数情况下都是个体制剂,制备机构也多为中小型单位,如何将 GMP 的基本原则与免疫细胞制剂制备有机结合是当前的重要课题。2015年4月,中国医药生物技术协会启动了《免疫细胞制剂制备质量管理自律规范》的起草工作,期间几易其稿,组织大小研讨会十余次,经反复修改后形成了终的规范文本。规范的颁布,旨在对业内开展免疫细胞制剂制备给予指导,并为对机构开展免疫细胞制剂制备的能力进行评价提供依据。该规范提出了免疫细胞制剂制备应该遵守的基本原则,由于各个机构采用的工艺和制备细胞不同,机构应该采取相应的措施达到规范的要求并对机构所制备的制剂负全部责任;机构符合和达到该规范的要求,并不表示机构所制备的免疫细胞制剂就可以自行开展临床研究或应用,机构应自觉遵守国家的有关法律法规。该规范在起草过程中,中国医药生物技术协会医药生物技术临床应用专业委员会、英普乐孚生物技术(上海)有限公司、南京得康生物科技有限公司、北京希波医学生物技术有限责任公司、上海市《临床细胞治疗技术平台研究与应用示范》课题组等单位提供了大力支持,并得到了中国食品药品检定研究院孟淑芳研究员、中国医学科学院肿瘤医院张叔人研究员的悉心指导,在此一并致谢。
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脐血CIK、PHA-CD3AK、CD3AK细胞的研究
过继免疫疗法在恶性肿瘤的治疗中取得了一定效果,寻求新型免疫效应细胞是当前热点之一.采用脐带血单个核细胞制备CD3AK、PHA-CD3AK、CIK 3种细胞,用MTT法测三者对K562和HL-60肿瘤细胞株的杀伤活性,免疫表型检测采用单克隆抗体APAAP法,采用t检验进统计学分析.
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X射线灭活小鼠胚胎成纤维细胞制备MEF的方法研究
目的:目前小鼠胚胎成纤维细胞制备MEF的常用方法是丝裂霉素C法和γ射线辐射法。丝裂霉素C使用方便,制作成本较低,因此被广泛采用,但若MEF中若存在少量丝裂霉素C,势必影响干细胞的生长。而γ射线辐射法操作简单,且不存在上述弊端,但仪器昂贵。本研究采用X射线辐射制备MEF,探究一种相对便宜且简单的方法有助于实验的顺利进行。
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基因修饰的永生化成纤维细胞移植治疗帕金森病研究
在体外实验的基础上,探索酪氨酸羟化酶(TH)和GTP环水解酶-1(GCH)修饰的永生化成纤维细胞混合移植对帕金森病(PD)的治疗作用.一、材料与方法1.永生化成纤维细胞制备及成纤维细胞TH基因和GCH基因修饰[1].2.大鼠偏侧PD模型制备及细胞移植:雄性SD大鼠50只,6-羟基多巴胺注射至右侧内侧前脑束制备偏侧大鼠PD模型.25只成功模型随机分为两组,治疗组14只,对照组11只.TH基因及绿色荧光蛋白(EGFP)基因修饰的成纤维细胞悬液按4∶1(v/v)的比例分别与GCH基因修饰的成纤维细胞悬液混合,分别用于治疗组和对照组.移植细胞分4点通过立体定向注射至右侧纹状体.每只大鼠移植细胞总数为2×105(体积10 μl),每点移植细胞数为4×104(体积2.5 μl).
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加强疫苗生产用Vero细胞控制的思考
1 背景日本千叶大学的Y.Yasumura 和Y.Kawakita 两位学者于1963年研制出Vero细胞系, 来源于非洲绿猴肾(Cercopithecus aethiops)上皮细胞.1964年,Simizu博士将第93代的Vero细胞提供给英国的Tropical病毒实验室(NIAID, NIH).1979年,第113代Vero细胞提供给美国标准菌种保藏中心(America Type Culture Collection, ATCC),传代至第121代建立细胞库.Vero细胞为连续细胞系, 可在体外连续传代,并对多种病毒敏感,包括SV-40, SV-5,麻疹病毒、虫媒病毒、逆转录病毒、风疹病毒、猴病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、牛痘病毒等多种病毒.因此,Vero细胞制备后被广泛用于实验室相关生物学检测,如病毒扩增和空斑检测等.
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谷氨酸对海马神经元钙信号的影响
细胞内游离钙作为一种重要的第二信使,与细胞功能、细胞代谢和信号转导密切相关, 细胞内钙信号的失调会引起细胞功能异常。这也是某些神经系统疾病的重要环节,如癫痫、 Alzheimer病、脑水肿、细胞凋亡等。谷氨酸的毒性作用诱发的Ca2+跨膜内流和细胞 内游离钙平衡的失调可能参与癫痫的病理过程。本实验应用单细胞Ca2+显微荧光测量 技术,对其进行了初步研究。1 材料和方法 (1)试剂 胎牛血清、HEPES、EGTA、Fura-2/AM、胰蛋白酶、MK-801(Sigma产品),1 640培养基(Gibco产品),其它的试剂为国产分析纯。 (2)细胞制备 从新生1~3 d的Wistar大鼠无菌取出海马,在Hanks液内剪碎、吹打,在 37℃下0.1%胰酶-EDTA消化 10 min,离心、洗涤3次,接种于培养板中涂过0.01%poly -lysine的盖玻片上,贴壁后加入1 ml 1640培养液,置CO2培养箱,每隔3 d换培养液一 次。 (3)单个细胞[Ca2+]i的显微荧光测量 用 Hanks液冲洗细胞两次,加入荧光 染料Pura-2/AM(终浓度1.6 μmol/L)孵育15~30 min(37℃)。细胞外液为Hanks液,无 钙细胞外液则将Hanks的CaCl2以MgCl2代替。 实验用的显微荧光测量系统包括:倒置显微镜(Zeiss Axiovert100)、单色光系统(TILL 公司)、计算机(Macintosh Quadra 650)、X-CHART软件(HEKA公司)。用计算机控制氙光源 以提供340 nm和380 nm波长的激发光。荧光信号由光电倍增管转化为电信号送入计算机进 行处理。钙浓度由以下公式计算:[Ca2+]i=Keff*(R-Rmin)/(Rmax- R),R=F1/F2。 其中Keff为有效结合常数,F1、F2分别为340 nm和380 nm波长单色光激发的荧光 强度。Rmin、Rmax分别是在零钙浓度和高钙浓度(10 mmol/L)时的荧光比值。
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胚胎干细胞来源的树突细胞制备骨髓瘤疫苗的研究
树突细胞(DC)是体内功能强大的专职抗原呈递细胞,由于其具有激活初始T淋巴细胞的能力,因而被认为是机体免疫的始动者,在抗肿瘤免疫方面发挥着重要作用.DC的免疫治疗亦被认为是具前景的抗肿瘤治疗方法之一.我们利用胚胎干细胞(ESC)的全能性在体外诱导出具有正常表型及功能的DC用以制备骨髓瘤疫苗,并检测其抗肿瘤活性.
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悬浮红细胞质量控制研究进展
随着临床对成分血尤其是对悬浮红细胞需求的增加,血站不断提高制备悬浮红细胞的分离率,以保证及时供应.但由于目前国内尚无规范的悬浮红细胞加工标准,各地制备悬浮红细胞的方法也不同,大多数血站、血液中心仍采用传统的速度、时间、温度的离心方式,按照佳离心条件对血液进行离心制备.为保证血液质量,国内外学者就悬浮红细胞制备质量控制进行了探索研究,现将研究进展综述如下.
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磁场对荷瘤小鼠免疫功能的影响
我们用SP2/0骨髓瘤细胞致瘤的小鼠作为实验模型,研究了磁场对荷瘤小鼠NK细胞及巨噬细胞表达IL-1的影响。材料和方法 取BALB/C小鼠24只,体重18~22 g,雌雄各半,随机分成3组,每组8只。背部脱毛,取SP2/0细胞3×106个接种于背部皮下(脾区),接种24 h后分组处理。对照组不进行磁疗;旋磁组采用RMT3磁疗机,磁头磁片4片,直径为1.3 cm的永久磁铁,异名极排列,磁头紧贴小鼠脾区(距鼠颈1.5 cm,脊椎左侧0.1 cm),磁感强度在转速2 000 r/min为0.2 T,每天1次,20 min,连续10次;静磁组的磁感强度为0.09 T,磁作用部位、时间及次数同旋磁组。 细胞活性检测:分别取靶细胞(浓度为1×105个/ml K562细胞)及效应细胞(浓度为1×106个/ml 脾细胞)各100 μl 加入96孔板,加MTT 10 μl(5 mg/ml)后置37℃ 5% CO2培养箱4 h,离心,弃上清,各孔加入二甲基亚砜150 μl,震荡10 min,测570 nm A值。 小鼠腹腔巨噬细胞制备:将小鼠处死,无菌操作取腹腔液,离心弃上清,制成细胞悬液浓度为2×106个/ml,加LPS至浓度为10 mg/ml,取1 ml加于96孔板,诱导36 h(置于5% CO2培养箱),上清含IL-1。
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间充质干细胞制备类人工真皮修复全层皮肤缺损的实验研究
工程组织构建的关键因素:细胞、支架、生长因子.其中鉴定和分离既能在临床上存活又能适用于组织工程的细胞是目前组织工程面临的问题之一[1].研究表明间充质干细胞(MSCs)来源于中胚层,广泛存在全身各种组织中,经诱导后具有多向分化和相互转化的潜能[2,3],本实验拟以M SCs为种子细胞经体外培养、扩增、诱导后种植于壳多糖基质网架上,用此构建人工类真皮修复皮肤损伤,为用生物学方法治疗皮肤损伤寻找一种新途径.
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传代细胞制备抗原底物测定抗核抗体方法及其影响因素的探讨
抗核抗体(ANA)测定作为临床诊断系统性红斑狼疮及其他自身免疫的手段之一,具有十分重要的临床意义.测定ANA的方法有许多种,国内多采用间接荧光抗体实验法(HF)进行测定,底物一般要大鼠、小鼠的肝、肾组织冷冻切片;肝、肾组织印片、组织匀浆涂片以及人白细胞涂片.
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肝细胞制备和培养技术
目前肝细胞的研究主要集中在肝细胞生理、病理生理研究,生物人工肝及肝细胞移植研究等方面.
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猴空泡病毒(SV40)PCR检测方法的建立与初步应用
在应用猴肾细胞制备的脊髓灰质炎减毒活疫苗中有SV40污染的可能.根据T-ag,t-ag和VP1三段基因,设计3对引物LT2:上游2 805~2 822 bp,下游3 946~3 964 bp;ST:上游4 638~4 663 bp,下游5 113~5 137bp;VP1b:上游2 022~2 042 bp,下游2496~2 517bp.通过PCR方法对猴肾脏、肺脏、脾脏及脊髓灰质炎减毒活疫苗进行检测,确定是否存在SV40感染或污染.
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应用Vero细胞生产乙型脑炎减毒活疫苗
乙脑减毒活疫苗副反应小,注射针次少,但乙脑减毒活疫苗在生产过程中由于使用地鼠肾细胞,存在动物源性的各种污染和变化因素不易控制.所以我们尝试使用传代细胞制备乙脑活疫苗.方法是将乙脑SA14-14-2毒株接种于长成致密单层的Vero细胞瓶中,加入无血清维持液,35℃培养,于3、5、7和9d各收取病毒液,离心弃沉淀,上清以0.22μm滤器过滤.
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父亲t(12:18)与儿子的18q21→qter的部分三体
1 病例介绍先证者,男12岁,因发育迟缓,智力低下就诊.第一胎,足月顺产,母乳喂养.查体:发育落后,智力障碍,身高12cm,体重25kg,头围51cm,招风耳,耳位低,鼻头宽,小颌,牙齿发育不良,排列不整,流口水,语言障碍,只能发"阿"音,近1a出现癫痫,发作时间长能持续20min左右.四肢肌张力亢进,摇椅形足底,走路不稳.细胞遗传学检查:外周血淋巴细胞制备染色体,常规G显带,镜下分析30个中期分期分裂相,核型均为46,XY,-12+der(12),t(12;18)(12p24.33;18q21),见图1.
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066 用稳定转化细胞制备的重组JEV颗粒抗原是有效的非感染性抗原和亚单位免疫原
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100 Vero细胞制备的流感疫苗诱导的体液与细胞免疫