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单纯疱疹病毒Ⅰ型感染KB细胞分析
目的 探究KB细胞被单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus,-1,HSV-1)体外感染的途径及方式.方法 取患者的疱疹液、唾液、咽喉漱洗液等标本,采用乳鼠脑内接种的方法培养分离HSV,从而获取研究所需的HSV-1,将获取的该病毒进行KB细胞感染,采用倒置显微镜鉴定病毒感染的细胞形态学改变,同时采用聚合酶链式反应技术(PCR)检测感染细胞中的HSV-1病毒的核酸,并将感染后的上清液收集起来进行乳鼠脑细胞接种,采用倒置显微镜鉴定病毒感染的细胞形态学改变.结果 在倒置显微镜下进行观察,并未发现典型细胞病变,而上清液感染后的乳鼠脑细胞则发现了典型的细胞病变,采用PCR法检测HSV-1感染KB细胞提取的DNA,可见HSV-1病毒核酸.结论 单纯疱疹病毒Ⅰ型能对KB细胞进行直接感染.
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共同感染对白色念珠菌感染状态的影响研究
目的研究致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染对白色念珠菌侵袭力和破坏性的影响。方法通过构建白色念珠菌和致病大肠杆菌共同感染离体肠上皮细胞（ Caco-2）的模型来研究共同感染对白色念珠菌感染状态的影响。通过倒置显微镜观察感染早期发生侵袭的白色念珠菌特征；通过测定乳酸脱氢酶（ LDH）活性评估上皮细胞被破坏程度；通过实时荧光定量PCR （ qRT-PCR）检测感染相关基因（ ALS3、 PLB1和SAP4）表达调控情况。采用SAS软件包进行数据统计分析。采用方差分析比较进行多组之间的比较，对于组间有差异的数据进一步采用Bonferroni法进行两两比较。以P＜0.05为差异具有统计学意义。结果显微镜观察发现共同感染组比单纯白色念珠菌感染组在感染早期更容易发生上皮细胞侵袭，侵袭的白色念珠菌呈簇状分布； LDH活性检测显示同时共同感染组（组3）高（与组1、组2、组4、组5比较 F 值分别为14.48、5.48、11.74、3.45， P＜0.05），致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组（组5）和单纯致病大肠杆菌感染组（组2）之间差异无统计学意义（F＝2.03， P＝0.54），白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组（组4）和单纯白色念珠菌感染组（组1）之间差异无统计学意义（F＝2.74， P＝0.11），组5、组2LDH活性值大于组1、组4（P＜0.05）；同时伴随白色念珠菌致病相关基因（PLB1和SAP4）上调， PLB1基因表达组3高于组1（ P ＝0.0143）， SAP4表达组3、组5高于组1（ P 值分别为0.0272、0.0018）。结论致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染增强了白色念珠菌的侵袭力和破坏性，并且增强的程度与两种菌的发病顺序和共存时间长短有关。
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小柴胡汤及药群配方含药血清对CCl4损伤肝细胞凋亡的影响
目的:探察小柴胡汤含药血清对体外CCl4诱导的肝细胞损伤模型的保护作用.方法:制备小柴胡汤及药群配方的大鼠含药血清,体外10 mmoL/L CCl4诱导肝细胞损伤模型,观察10%药物血清对损伤肝细胞增生率、ALT、细胞形态学以及凋亡率的影响.结果:与正常组比较,模型组肝细胞增生率显著降低(1.22±1.00,1.11±0.09,1.12±0.18,1.10±0.08,vs0.78±0.07,P＜0.01),细胞培养上清液中ALT含量显著升高(948±162,748±278,1 081±226,1 148±163,vs 2110±377,P＜0.01);与模型组比较,小柴胡汤及其药群配方组的肝细胞增生率显著增高(P＜0.01),细胞培养上清液中ALT含量显著降低(P＜0.01).倒置显微镜、Giemsa及TUNEL染色观察到,模型组肝细胞存在着明显的坏死和凋亡,小柴胡汤及药群配方的凋亡细胞明显减少.与正常组比较,CCl4模型组细胞凋亡显著增高(2.9 467±1.0 007 vs16.3 175±4.5 358,P＜0.01);与模型组比较,小柴胡汤及药群配方组的细胞凋亡率显著降低(4.2 117±2.3 733,6.4800±2.4052,5.6 200±2.0 573,4.6440±0.8825,vs 16.3 175±4.5 358,P＜0.01).结论:CCl4引起的肝损伤同时存在着明显的凋亡和坏死,小柴胡汤及药群配方含药血清对体外CCl4诱导的肝细胞损伤有保护作用.
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二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞生长的影响
目的:研究二烯丙基二硫(DADS)对人胃癌MGC803细胞生长的抑制作用.方法:采用MTT法、生长曲线分析、细胞活力检测、双层软琼脂集落形成率、及倒置显微镜等方法,观察DADS对体外培养的人胃癌MGC803细胞的影响.结果:DADS对MGC803细胞具有明显的生长抑制效应,且呈剂量-效应依赖关系(P＜0.05).培养96 h,35 mg/LDADS的抑制作用呈时间-效应依赖关系(P＜0.05).细胞群体倍增时间由33.8 h延长至DADS处理后的84.0 h(P<0.05);细胞存活率分别为阴性对照组97.4%和DADS处理组80.4%(P>0.05);软琼脂集落形成率由1.23%下降到0.33%(P<0.05).阴性对照组细胞多角形、圆形,体积大,多形性明显,核大小不一,见双核及核仁,细胞生长紧密呈堆叠生长.DADS处理后细胞异型性降低,为形态一致的梭形,体积小,境界清楚而分散,胞质丰富,核明显变小.结论:DADS对体外培养的MGC803细胞具有明显的增生抑制作用,且呈现剂量-效应依赖关系.
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六种真菌毒素对培养软骨细胞的作用
1.目的方法真菌及其毒素中毒是大骨节病(KBD)重要病因学说之一,由于检出的优势真菌和毒素在各病区的结果不一致.我们用脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、互隔交链孢霉单甲醚(AME)、丁烯酸内酯(BUT)和串珠镰刀菌素(MON)等毒素对体外单层培养的幼兔关节软骨细胞进行损伤实验,测定软骨细胞DNA、基质葡萄糖醛酸量作为生长代谢的指标,并于倒置显微镜和透射电镜下观察细胞结构情况,了解这些毒素对KBD靶细胞-软骨细胞生长代谢和超微结构的作用,为KBD的病因研究积累基础实验资料.
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采用视频系统的细胞原位计数法
在体外细胞培养过程中,细胞生长曲线是反映细胞生物学特性十分重要的指标.传统细胞生长曲线的绘制方法,是通过胰酶消化后制成细胞悬液,显微镜下计数,然后计算出细胞总数[1].这种方法不能在不同时相或用药前后进行自身对照观察,因此我们在实验中采用定位微量细胞培养技术及细胞原位计数法[2],并将视频系统引入该方法中,现简介如下.1 仪器及设备选用菲利浦VR-HD 1000录像机、松下TC-2140监视器、奥林巴斯IX 70倒置显微镜、细胞培养容器(丹麦NUNC 6孔板、12孔板或培养皿)、小玻璃管(外径为6 mm,长为3.5 cm,一端为盲端)、血盖片或普通盖片、投影胶片(非复印型)等.
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谷氨酸对海马神经元钙信号的影响
细胞内游离钙作为一种重要的第二信使，与细胞功能、细胞代谢和信号转导密切相关， 细胞内钙信号的失调会引起细胞功能异常。这也是某些神经系统疾病的重要环节，如癫痫、 Alzheimer病、脑水肿、细胞凋亡等。谷氨酸的毒性作用诱发的Ca2+跨膜内流和细胞 内游离钙平衡的失调可能参与癫痫的病理过程。本实验应用单细胞Ca2+显微荧光测量 技术，对其进行了初步研究。1 材料和方法 (1)试剂 胎牛血清、HEPES、EGTA、Fura-2／AM、胰蛋白酶、MK-801(Sigma产品)，1 640培养基(Gibco产品)，其它的试剂为国产分析纯。 (2)细胞制备 从新生1～3 d的Wistar大鼠无菌取出海马，在Hanks液内剪碎、吹打，在 37℃下0．1％胰酶-EDTA消化 10 min，离心、洗涤3次，接种于培养板中涂过0．01％poly -lysine的盖玻片上，贴壁后加入1 ml 1640培养液，置CO2培养箱，每隔3 d换培养液一 次。 (3)单个细胞［Ca2+］i的显微荧光测量 用 Hanks液冲洗细胞两次，加入荧光 染料Pura-2／AM(终浓度1．6 μmol/L)孵育15～30 min(37℃)。细胞外液为Hanks液，无 钙细胞外液则将Hanks的CaCl2以MgCl2代替。 实验用的显微荧光测量系统包括：倒置显微镜(Zeiss Axiovert100)、单色光系统(TILL 公司)、计算机(Macintosh Quadra 650)、X-CHART软件(HEKA公司)。用计算机控制氙光源 以提供340 nm和380 nm波长的激发光。荧光信号由光电倍增管转化为电信号送入计算机进 行处理。钙浓度由以下公式计算：［Ca2+］i＝Keff*(R-Rmin)／(Rmax- R)，R=F1/F2。 其中Keff为有效结合常数，F1、F2分别为340 nm和380 nm波长单色光激发的荧光 强度。Rmin、Rmax分别是在零钙浓度和高钙浓度(10 mmol/L)时的荧光比值。
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脑络欣通和左归丸药物血清体外培养神经干细胞的增殖与分化
背景：神经干细胞种子来源数量相对有限，增殖分化量相对较少，如何采取有效的措施促进神经干细胞增殖、分化成为研究的焦点。
目的：比较脑络欣通和左归丸药物血清对体外培养的大鼠神经干细胞增殖分化的作用。
方法：体外分离培养SD大鼠胚胎神经干细胞，加入含10%的脑络欣通以及10%的左归丸药物血清培养基中共同培养。采用倒置显微镜及免疫荧光染色观察脑络欣通和左归丸药物血清对体外培养的大鼠神经干细胞增殖分化的作用，采用倒置显微镜、免疫荧光染色方法进行观察比较。
结果与结论：①细胞培养24 h后倒置显微镜下观察细胞开始团生长，并聚集成球，但是细胞直径相对较小，48 h后神经球进一步增大，形态相对规则，但是未见神经球分化；②左归丸组细胞培养5 d后细胞球突起平均长度，显著大于脑络欣通组(P <0.05)；③左归丸药物血清培养下大鼠神经干细胞分化为MAP-2阳性细胞率显著低于脑络欣通组(P <0.05)，分化为胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率显著高于脑络欣通组(P <0.05)；④将培养48 h的神经球分别放2种入药物血清中培养，12 h后发现神经球贴壁生长，少量细胞迁移。随着时间的延长，迁移的细胞数量开始增多；⑤免疫细胞荧光染色下显示2种药物血清培养下神经元突出均相对较多，且突起的长度较长，神经干细胞神经元以及星形胶质细胞比例差异不显著(P >0.05)。⑥结果提示脑络欣通和左归丸药物血清对体外培养的大鼠神经干细胞增殖分化均具备明显的促进作用，均能营造更加适宜神经细胞增殖等微环境，但是2种药物存在明显的差异，通过脑络欣通和左归丸药物诱导神经细胞增殖分化是可行的。 -
强脊Ⅰ号改善小鼠耳微循环的实验研究
1材料动物:昆明小鼠,雌雄各半,体重在18～22g.购自军事医学科学院实验动物中心,品级KM、2级.器材:倒置显微镜,天平,1ml注射器,眼科镊子,直径6cm平皿,医用橡皮膏.药品与试剂:强脊1号合剂(浓度1.17g/ml),液体石腊油,戊巴比妥钠粉.
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中药复方对大鼠肾小球系膜细胞增殖影响的实验研究
1实验材料中药材:中药人参(Radix Ginseng)、黄芪(Radix Astragali)、大黄(Radix et Rhizoma Rhei)、水蛭(Hirudo)均购自大连市医药采购供应站,由辽宁省药品检验所鉴定.细胞:大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供.试剂:MEM细胞干粉培养基Gibco;新生牛血清(FCS),鼎国生物;胰蛋白酶(1:250);乙二胺四乙酸二钠(EDTA);二甲基亚砜(DMSO);L-谷氨酰胺西宝生物;噻唑蓝(MTT)Amresco;其余试剂均为分析纯或生化纯试剂.主要仪器:HEAL FORCE HF-1200超净工作台,上海力申科学仪器有限公司;CK30-12PHP倒置显微镜,OLYMPUS;MDFU4086S-86382L超低温冰箱,日本三洋;HERAEUS BB16 CO2培养箱HERAEUS;TECAN GENIOS酶标仪,奥地利;FACSCalibur流式细胞仪,美国BD公司;96孔培养板;可调式移液器Eppendorf.
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尿沉渣倒置显微镜分析系统的实验观察
目的探讨适于推广的标准、规范的尿沉渣检查方法.方法将自己研制的尿沉渣倒置显微镜分析系统与FAST-READR 102尿沉渣定量计数板法对比观察尿液标本中的细胞及管型.结果两种方法计数结果无显著性差异(P＞0.05),均具有良好的重复性.结论计数板法操作要求严格,程序较为繁琐,目前普及尚有困难;尿沉渣倒置显微镜分析系统操作简单、准确,适于临床基层推广.
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单纯疱疹病毒Ⅰ型体外感染人口腔上皮细胞的实验研究
目的 研究单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)体外感染人口腔上皮细胞的途径和方式.方法 在体外利用非洲绿猴肾细胞大量扩增获得HSV-1,将此病毒体外感染人口腔上皮细胞,建立HSV-1体外感染人口腔上皮细胞模型,并收集HSV-1感染人口腔上皮细胞后的上清液转移感染Vero细胞.利用倒置显微镜对病毒感染进行形态学鉴定.应用聚合酶链式反应技术(PCR)对病毒核酸进行检测.结果 倒置显微镜下人口腔上皮细胞未观察到典型的细胞病变,上清液转移感染后的Vero细胞发生典型细胞病变.利用PCR法可在单纯疱疹病毒Ⅰ型感染后的人口腔上皮细胞内检测到病毒核酸.结论 HSV-1可直接感染人口腔上皮细胞.
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羟基喜树碱对兔晶体上皮细胞的抑制作用
目的:为研究羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine,HCPT)对体外培养的兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长的影响,探索预防后发性白内障的药物.方法:2～3月龄健康家兔20只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;96孔酶标板;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2～3代的对数生长期RLECs于96孔板中,置入CO2孵箱中培养24 h后,将不同浓度的HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的抑制作用;(2)将传代的RLECs接种于96孔板中,立即加入HCPT(浓度为小于半效抑制量的1/10,因该浓度对细胞无杀伤作用)24 h后取出,加入MTT在酶标仪上比色;(3)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的HCPT,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(4)将浓度为1.34 μg/mL的HCPT作用于2～3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,离心弃上清液,戊二醛固定,电镜观察超微结构的变化(另设未加药组为对照).结果:HCPT能有效抑制体外培养的RLECs的增殖.24 h的半效抑制量(ID50)为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.340 μg/mL;且HCPT对RLECs贴壁有影响,使部分RLECs不能贴壁.光镜下可见HCPT主要引起细胞核固缩、碎裂等病理变化,其胞浆的改变表现为空泡及深染的粗颗粒.电镜下见经HCPT处理的RLECs线粒体肿胀,可见典型的凋亡细胞及凋落小体的形成.结论:HCPT是一种新型的抗癌药,其作用靶是拓朴异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ).其低剂量、长时间作用于RLECs,抑制效果明显,该药不仅抑制细胞增殖,还影响细胞贴壁.因此是一种有潜力的预防后发性白内障的侯选药物.
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紫杉醇、羟基喜树碱对晶体上皮细胞生长周期的影响
目的:研究紫杉醇(Taxol)和羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine, HCTP)对兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长周期的影响.观察Taxol和HCPT对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2～3月龄家兔30只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;离心机;流式细胞仪.(1)取2～3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放入CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol和HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将消化的第2代RLECs计数成一定浓度的细胞悬液加入3组培养瓶中,一组为不加药的正常对照组,其余两组为分别加入一定浓度的Taxol和HCPT的实验组,作用48 h,用0.25%胰蛋白酶消化、PBS洗涤、立即进行流式细胞仪分析.结果:本研究发现Taxol和HCPT对体外培养的兔晶体上皮细胞均有抑制作用,Taxol 24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.HCPT 24 h的ID50为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.34 μg/mL.流式细胞仪分析表明Taxol将RLECs的细胞周期阻断于G2/M期,并在G2/M期阻断前还有短时的G0/G1期阻断.HCPT将细胞周期阻断于S期.结论:Taxol和HCPT增多属细胞周期特性药.Taxol为新型抗微管药物,其作用目标为细胞骨架的微管系统,抑制微管解聚.本实验证实Taxol使RLECs周期阻断于G2/M期,至于在G2M期阻断前还有短时的G0/G1期阻断,其机制值得进一步研究.羟基喜树碱靶向高度选择性抑制拓扑异构酶(Topo Ⅰ),主要作用于RLECs的S期.
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紫杉醇诱导兔晶体上皮细胞凋亡的实验研究
目的:从诱导兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)凋亡的角度观察紫杉醇(Taxol)对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2～3月龄家兔40只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;TUNEL试剂;24孔酶标板;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2～3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放进CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将传代RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(3)将一定浓度的Taxol作用于2～3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,戊二醛固定,行超微结构观察(同时设未加药标本为正常对照).(4)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h,固定后行TUNEL染色并在光镜下观察(另将未加药标本为阴性对照.).结果:本研究发现Taxol对体外培养的RLECs有抑制作用,其24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.光镜下,正常对照的RLECs呈多边形上皮样,胞浆丰富、粉红色、胞核呈紫蓝色.部分用药组细胞体积缩小、呈圆形、包浆浓染,可见染色质边集、胞核固缩、碎裂等多种形态改变.电镜下观察用药组细胞见典型的凋亡细胞及凋亡小体的形成.TUNEL染色见部分用药组细胞胞核呈深棕黄色,提示细胞凋亡.结论:本研究通过光镜、电镜以及免疫组化等多方面的证实:Taxol主要是通过诱发细胞凋亡的机制而抑制RLECs生长的.
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PKC抑制剂对人胃肠道间质瘤GIST细胞凋亡机制的研究
目的：研究蛋白激酶C（ PKC）抑制剂对人胃肠道间质瘤GIST细胞株生长抑制与诱导凋亡作用，并对其细胞凋亡机制进行研究。方法：体外培养人胃肠道间质瘤GIST细胞。采用MTT法测定了不同浓度PKC抑制剂在不同时间下对GIST细胞生长的抑制率。流式细胞术检测细胞凋亡率，分析细胞周期分布。采用倒置显微镜及荧光染色法下观察不同浓度药物作用下GIST细胞形态学变化。 Western blot法检测内质网应激相关蛋白GRP78与GADD153的表达。结果： PKC抑制剂对GIST细胞有明显的抑制增殖及促进凋亡的作用，并与时间和剂量呈正相关。倒置显微镜及荧光显微镜下可见胞浆内出现空泡，细胞核固缩等现象。经PKC抑制剂作用后，GIST细胞的GRP78与GADD153蛋白表达上调。结论： PKC抑制剂能显著抑制人胃肠道间质瘤GIST细胞的增殖，并在内质网应激参与下促进其细胞的凋亡。
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TCR Vβ15基因转染外周血单个核细胞体外抗肝癌作用的研究
目的探讨肝癌特异性识别基因TCR Vβ15表达重组体转染外周血单个核细胞后的体外抑瘤作用.方法 TCR Vβ15基因表达重组体转染外周血单个核细胞(PBMC),激光共聚焦显微镜观察TCR Vβ15表达情况.淋巴细胞和肿瘤细胞共培养后倒置显微镜观察淋巴细胞诱导肿瘤细胞死亡的情况,MTT法观察淋巴细胞的杀伤活性.结果 TCR Vβ15基因转染后的淋巴细胞与未经处理的淋巴细胞相比跨膜蛋白表达增加.倒置显微镜下可见基因转染组肿瘤细胞皱缩,细胞间隙增加.淋巴细胞杀伤活性明显增高,实验组与对照组相比有显著性差异.结论 TCR Vβ15基因转染PBMC细胞后可有效表达并明显杀伤肿瘤细胞,导致肿瘤细胞死亡,为该研究方法临床应用提供了实验依据.
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尿沉渣倒置显微镜分析系统
目的研究尿沉渣倒置显微镜分析系统,探讨适合推广的规范化和标准化的尿沉渣镜检方法.方法采用改进的倒置显微镜法进行尿沉渣镜检,并与尿沉渣定量计数板法比较.结果该分析系统具有良好的重复性和准确性,计数结果与尿沉渣定量计数板法比较在统计学上无显著性差异(P＞0.05).结论用尿沉渣倒置显微镜分析系统进行尿沉渣检查,操作简便、规范,结果可靠,是目前值得推广的一种尿沉渣镜检方法.
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尿沉渣倒置显微镜分析系统专用尿沉淀板的选择
目的对倒置显微镜法检查尿沉渣使用的细胞培养板和酶标板进行比较,以寻找适合作为专用尿沉淀板的容器.方法采用倒置显微镜法对美国生产的细胞培养板和厦门生产的酶标板进行尿液细胞计数的对比观察.结果二者在尿沉渣计数结果上无显著性差异(P＞0.05).结论孔底直径一致、底面平整且透光性好的细胞培养板和酶标板都可以作为尿沉渣倒置显微镜分析系统的专用尿沉淀板.
