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Livin在白血病耐药细胞系THP-1R的表达
Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族新成员,在正常组织极少表达,而在多数恶性肿瘤组织细胞中高表达,与肿瘤抗凋亡和耐药性有关[1].为探讨Livin与白血病细胞耐药的相关性,本实验主要从分子水平研究Livin在人急性白血病细胞系THP-1与耐药细胞系THP-1R中的差异表达情况,为Livin在白血病多药耐药( multi-drug resistance,MDR)方面的意义提供实验依据.1材料与方法1.1材料主要试剂:RPMI 1640培养液(Promega公司);兔抗Livin抗体(博奥森生物技术有限公司);引物(上海生工生物工程公司);RT-PCR试剂盒(MBIFermentas公司);双链siRNA和RNAi-Mate转染试剂(上海吉玛生物技术公司).1.2方法1.2.1细胞培养:THP-1细胞为本室冻存,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5% CO2条件下培养,2~3d传代1次.采用逐渐增加药物浓度的方法[2]建立THP-1耐Ara-C的耐药系THP-1R,实验前2周撤去药物,以正常的RPM1640培养液培养,然后取对数生长期细胞用于后继实验.1.2.2 siRNA转染:参考文献[1],针对人Livin基因2个异构体的共同部分合成siRNA序列,正义链5’-GACAGUGCC AAGUGCCUGCdTdT-3’,反义链5'-GCAGGCACUUGGCACUG UCdTdT-3’.按照说明书所述比例配制siRNA/RNA-Mate复合物和完全培养基的混合液,用此混合液稀释细胞至所需浓度,再分配到培养板各孔.非转染对照组用生理盐水代替siRNA.同时转染有荧光标记的阴性对照siRNA,在荧光显微镜下观察和判断转染效果.
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人骨肉瘤细胞系OS-732与血管生成的相关作用
一、材料与方法 1.细胞株和细胞培养:人骨肉瘤细胞株OS-732, 购自北京积水潭医院骨科实验室,常规培养于含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液中。 2.鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)制备及瘤细胞接种:选取孵育至9 d的胚蛋,参考付生法[1]的方法制备CAM,选择近胚头1 cm处的两条前卵黄静脉间的相对无血管区接种对数生长期OS-732细胞,每只5×106/100 μl,共接种10只。另10只设为空白对照组。于接种第2天至接种第9天在解剖显微镜下逐日观察接种区5 mm范围内血管数目及形态学变化。
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胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞分泌胰岛素的研究
目的:研究小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的胰岛素分泌细胞(IPCs)分泌胰岛素的能力及其所分泌的胰岛素的活性.方法:将ES-D3细胞培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM液进行诱导,隔天换液,21 d后,采用DTZ染色、免疫细胞化学染色和ELISA等方法检测胰岛素的生成与分泌情况;用RT-PCR法检测PDX-1、Insulinl、Insulin2和Glut2等胰岛素分泌细胞相关基因mRNA的表达,并通过动物实验研究生成的IPCs所分泌的胰岛素的降糖活性.结果:在诱导21 d,DTZ染色法观察到被DTZ染成洋红色的IPCs;免疫细胞化学染色法显示诱导体系中有胰岛素特异性免疫反应阳性的细胞群;ELISA法测定结果表明IPCs受高糖刺激后分泌胰岛素,动物实验证明所分泌的胰岛素具有降糖活性;RT-PCR法检测到有Insulin2和PDX-1 mRNA的表达,Insulinl呈弱表达,Glut2不表达.结论:小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的IPCs能够合成并分泌胰岛素,而且分泌的胰岛素具有降糖活性.
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miR-146b-5p异常表达对胰腺癌细胞生物学特性的影响
MicroRNAs( miRNAs)是由一类内源性的非编码RNA组成,长度大约20 ~24 nt,来源于长的前体pri-miRNA和pre-miRNA[1-3].在多细胞生物体中,它通过不完全碱基互补配对的方式识别靶位点,转录后调控基因的表达[4-5].尽管过去的几年中通过基因芯片筛查肿瘤特异性miRNA有很大的进展[6],但miRNA影响肿瘤形成和发展的机制仍不清楚.本研究检测6株胰腺癌细胞miR-146b-5p的表达,观察其对胰腺癌细胞生物学特性的影响.一、材料与方法1.细胞培养和转染:人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2、BxPC-3、AsPC-1、PANC1、5W1990、PC-3为同济医院胆胰外科实验室保存,3例正常胰腺组织为胆管肿瘤行胰十二指肠切除术的手术标本.取对数生长期miR-146b-5p表达低的MIAPaCa-2细胞,采用lipofectamineTM 2000将miR-146b-5p mimics和阴性对照miRNA(广州锐博公司)分别转染细胞,按照lipo2000转染试剂盒说明书操作.
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MTT法测定鸦胆子对人瘢痕成纤维细胞生长的影响
采用MTT法测定不同剂量的鸦胆子粗提物对正常皮肤(NF)与增生性瘢痕(KF)成纤维细胞的抑制作用,探讨该药在治疗瘢痕增生的体外效果,为临床应用贴敷制剂提供依据。1 材料与方法1.1 材料:DMEM培养液,MTT(四氮甲基唑蓝),0.1g*ml-1鸦胆子仁乙醇溶液。1.2 细胞培养:取增生期瘢痕和正常皮肤进行培养,以第5代后对数生长期的细胞试验。 1.3 药物敏感试验:以细胞浓度为4×104ml-1接种96孔板,细胞贴壁后分为对照组和实验组,对照组只加细胞不加药物,实验组加入不同浓度的鸦胆子,每浓度4个复孔,C O2孵箱培养,48h后加入MTT,继续培养4h,测定吸光度A值。1.4 数据处理:生长抑制率=(1-用药组A/对照组A)×100%,以SPSS软件统计。
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转化生长因子β对白细胞介素1β诱导髁突软骨细胞凋亡的调控作用
关节软骨进行性破坏是骨关节炎(osteoarthoritis,OA)的主要病理改变之一.近来发现OA关节软骨有异常的软骨细胞凋亡,这可能与OA关节软骨的破坏有关.我们就TGF-β在人重组白细胞介素-1β(rhIL-1β)诱导髁突软骨细胞凋亡中的作用进行了研究.1.材料和方法:(1)rhIL-1β诱导软骨细胞凋亡:将髁突软骨细胞接种于培养瓶中,密度为3×104/ml,培养至对数生长期,实验组分别加入含有rhIL-1β(1、10、20 ng/ml)及二甲基亚砜(DMS0,15μl/ml)的DMEM培养液,处理8、16、24 h后收集细胞.分别用流式细胞仪、透射电镜、DNA电泳检测细胞凋亡.对照组不加rhIL-1β.
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维生素K3和三氧化二砷在诱导白血病细胞凋亡中的协同作用
生素K类药物作为止血药在临床应用已有多年.近年来的研究表明,维生素K类药物尚具有一定的抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用[1].近,我们观察了维生素K3(VK3)对HL-60细胞的凋亡诱导作用及其与三氧化二砷(As2O3)的协同作用,现将结果报道如下.材料和方法1 主要试剂 As2O3购于哈尔滨医科大学附属第一医院,VK3为无锡第七制药厂产品,小牛血清购自杭州四季青生物制品公司,Annexin V/PI试剂盒购自法国Immunotech公司.2 细胞培养 HL-60细胞系引自中国科学院上海细胞生物学研究所,培养于含体积分数为10%的小牛血清的RPMI 1640培养液中,置37?℃、体积分数为5%的CO2孵箱中培养.取对数生长期细胞进行实验,接种细胞的起始浓度为2×105/ml.
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细菌外膜泡与致病性的关系
多种革兰阴性菌在其对数生长期可产生外膜泡。它是外膜的新合成部分,不合肽聚糖、内膜和细胞质成分。其主要化学成分是脂多糖,外膜泡的形成与脱落实质是活菌释放内毒素的一种方式。此外,它还能作为一些细菌毒素的载体。外膜泡具有蛋白水解酶活性,能增强细菌的粘附力,并赋予细菌抵抗宿主血清杀菌的能力。它还具有防御作用,细菌通过释放外膜泡可摆脱吸附的噬菌体。外膜泡的多种生物学活性使细菌的致病性大大增强,是一种重要的毒力因子。
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内毒素对气管上皮细胞损伤的实验研究
目的 脱察不同浓度内毒素(LPS)作用不同时程对气管上皮细胞(HBE)的损伤作用.方法 取处于对数生长期的HBE,加入LPS的终浓度分别为0.02 μg/ml、0.04 μg/ml、0.06 μg/ml、0.08 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml、0.4 μg/ml、0.6 μg/ml、0.8 μg/ml、1.0 μg/ml,在培养箱内分别孵育24 h、48 h后,采用MTT比色法于酶联免疫测定仪490 nm波长处测定OD值.结果 作用24 h后,各浓度LPS对HBE具有不同程度的损伤作用,其中以0.1 μg/ml作用为明显(0.4080±0.0217 vs 0.3800±0.0100,P<0.01);作用48 h后,符浓度LPS对HBE具有不同程度的损伤作用,其中以0.1 μg/ml作用为明显(0.3900±0.0122 vs 0.3060±0.0230,P<0.01).结论 根据LPS致气管上皮细胞损伤的量效及时效关系,选择0.1 μg/ml作用24 h作为细胞刺激条件较为适宜.
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钩端螺旋体对数生长期的测定
目的了解在实验室条件下钩端螺旋体的生长规律,为进一步开展蛋白质组和基因表达谱的研究做准备.方法使用pH为7.4的EMJH液体培养基,在30℃条件下置摇床上以90r/min对该菌进行通气振荡培养,记录不同时间点的活菌数和培养物的光密度.结果研究发现,钩体的生长与其它细菌培养相似,也有静止期、对数生长期、稳定期和衰老期.在该培养条件下,钩端螺旋体的对数生长期为培养的第12~54h.在对数生长期,钩端螺旋体复制一代所需的时间约为11.35h.并且,钩端螺旋体活菌计数和光密度值OD600之间有较好的相关性.结论本文比较详细地描述了钩端螺旋体的生长参数-活菌数和OD600,并找到了钩端螺旋体生长的对数生长期,在严格控制试验条件的情况下,可以使用测定液体培养物的OD600值的方法来推算菌体数,代替菌体计数的方法.
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C57BL/6小鼠前列腺癌三种常用动物模型的建立
我们应用C57BL/6小鼠在前列腺原位、腹部皮下及胫骨髓腔注射RM-1细胞方法建立细胞移植瘤模型.一、材料与方法1.模型建立:C57BL/6雄性小黑鼠40只,鼠龄6~8周,随机分为3组:A组:前列腺原位注射组15只、B组:腹部皮下注射组15只、C组:胫骨髓腔注射组10只;取对数生长期的RM-1细胞,消化、洗涤、离心,稀释成1.0×109个/mlRM-1细胞悬液备用.
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二甲双胍对乳腺癌细胞株的抑制作用
本实验旨在观察二甲双胍对乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231的影响,探讨其抗肿瘤的作用及其机制.一、材料和方法1.人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231复苏,扩增.收集对数生长期的细胞,调整细胞浓度为5×105个/ml.共设4组:空白对照组、二甲双胍组、表阿霉素组、二甲双胍+表阿霉素组.每组设3孔,每孔(6孔板)加入细胞总数为5×105个,加入相应的药物及培养液.孵育48 h,计数.流式细胞仪检测.
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人胃癌细胞株增殖迁移和克隆成瘤的比较
我们选取4株常见的人胃癌细胞,通过体内外实验,比较其增殖、迁移和克隆成瘤能力.一、材料与方法1.材料和细胞培养:AGS、BGC-823、SGC-7901细胞株购自上海市细胞生物研究所,MKN-28细胞株由上海内分泌代谢病研究所赠送,Boyden迁移槽购自Costar公司,BALB/C裸小鼠购自扬州大学比较医学中心.细胞用含10%小牛血清的DMEM传代培养,取对数生长期细胞进行实验.
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聚桂醇在体外对肝癌细胞的杀伤作用
聚桂醇是一种新型硬化剂,本研究旨在观察聚桂醇对肝癌细胞的杀伤作用,现报道如下.一、材料与方法1.材料:人肝癌细胞株HepG2;聚桂醇注射液(陕西天宇制药有限公司);四氮唑盐(Sigma-aldrich);680酶标仪( Bio-rad).2.实验方法:(1)细胞株生长杀伤实验[噻唑蓝(MTT)比色法]:取对数生长期HepG2细胞,制成细胞混悬液,接种于96孔板,每孔100μl(含3000个细胞).
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人肝癌多药耐药裸鼠模型的建立及其生物学特性研究
本实验旨在为体内逆转肿瘤多药耐药(MDR)而制作人肝癌裸小鼠模型,并对其生物学特征进行研究.一、材料与方法1.细胞株与裸鼠多药耐药模型建立:人肝癌HepG2细胞株(重庆医科大学医学超声工程研究所提供)及耐药细胞株HepG2/Adm[可在浓度为1.0 mg/L的阿霉素(ADM)培养基中生长并传代,对ADM耐药26倍]由重庆医科大学超声医学工程研究所建立.BALB/C-nu/nu裸小鼠(中国科学院药物研究所)在无特定病原体(SPF)条件下饲养.4~6周龄裸小鼠共100只,雌雄兼用.对数生长期细胞(HepG2及HepG2/Adm)浓度为1×109/ml.微量注射器抽取细胞悬液200 μl,分别接种于裸鼠的右腋下(各50只).
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不同生长时期盐藻无机元素分析
测定了对数生长期和稳定期盐藻中10种无机元素K、Na、Ca、Mg、P、Cu、Zn、Fe、Mn、Se的含量.结果表明,稳定期盐藻中K、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Mn、Se的含量比对数生长期都有不同程度的增加,Na、P的含量反而降低.
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羟基喜树碱对兔晶体上皮细胞的抑制作用
目的:为研究羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine,HCPT)对体外培养的兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长的影响,探索预防后发性白内障的药物.方法:2~3月龄健康家兔20只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;96孔酶标板;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2~3代的对数生长期RLECs于96孔板中,置入CO2孵箱中培养24 h后,将不同浓度的HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的抑制作用;(2)将传代的RLECs接种于96孔板中,立即加入HCPT(浓度为小于半效抑制量的1/10,因该浓度对细胞无杀伤作用)24 h后取出,加入MTT在酶标仪上比色;(3)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的HCPT,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(4)将浓度为1.34 μg/mL的HCPT作用于2~3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,离心弃上清液,戊二醛固定,电镜观察超微结构的变化(另设未加药组为对照).结果:HCPT能有效抑制体外培养的RLECs的增殖.24 h的半效抑制量(ID50)为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.340 μg/mL;且HCPT对RLECs贴壁有影响,使部分RLECs不能贴壁.光镜下可见HCPT主要引起细胞核固缩、碎裂等病理变化,其胞浆的改变表现为空泡及深染的粗颗粒.电镜下见经HCPT处理的RLECs线粒体肿胀,可见典型的凋亡细胞及凋落小体的形成.结论:HCPT是一种新型的抗癌药,其作用靶是拓朴异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ).其低剂量、长时间作用于RLECs,抑制效果明显,该药不仅抑制细胞增殖,还影响细胞贴壁.因此是一种有潜力的预防后发性白内障的侯选药物.
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紫杉醇、羟基喜树碱对晶体上皮细胞生长周期的影响
目的:研究紫杉醇(Taxol)和羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine, HCTP)对兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长周期的影响.观察Taxol和HCPT对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2~3月龄家兔30只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;离心机;流式细胞仪.(1)取2~3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放入CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol和HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将消化的第2代RLECs计数成一定浓度的细胞悬液加入3组培养瓶中,一组为不加药的正常对照组,其余两组为分别加入一定浓度的Taxol和HCPT的实验组,作用48 h,用0.25%胰蛋白酶消化、PBS洗涤、立即进行流式细胞仪分析.结果:本研究发现Taxol和HCPT对体外培养的兔晶体上皮细胞均有抑制作用,Taxol 24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.HCPT 24 h的ID50为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.34 μg/mL.流式细胞仪分析表明Taxol将RLECs的细胞周期阻断于G2/M期,并在G2/M期阻断前还有短时的G0/G1期阻断.HCPT将细胞周期阻断于S期.结论:Taxol和HCPT增多属细胞周期特性药.Taxol为新型抗微管药物,其作用目标为细胞骨架的微管系统,抑制微管解聚.本实验证实Taxol使RLECs周期阻断于G2/M期,至于在G2M期阻断前还有短时的G0/G1期阻断,其机制值得进一步研究.羟基喜树碱靶向高度选择性抑制拓扑异构酶(Topo Ⅰ),主要作用于RLECs的S期.
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紫杉醇诱导兔晶体上皮细胞凋亡的实验研究
目的:从诱导兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)凋亡的角度观察紫杉醇(Taxol)对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2~3月龄家兔40只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;TUNEL试剂;24孔酶标板;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2~3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放进CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将传代RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(3)将一定浓度的Taxol作用于2~3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,戊二醛固定,行超微结构观察(同时设未加药标本为正常对照).(4)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h,固定后行TUNEL染色并在光镜下观察(另将未加药标本为阴性对照.).结果:本研究发现Taxol对体外培养的RLECs有抑制作用,其24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.光镜下,正常对照的RLECs呈多边形上皮样,胞浆丰富、粉红色、胞核呈紫蓝色.部分用药组细胞体积缩小、呈圆形、包浆浓染,可见染色质边集、胞核固缩、碎裂等多种形态改变.电镜下观察用药组细胞见典型的凋亡细胞及凋亡小体的形成.TUNEL染色见部分用药组细胞胞核呈深棕黄色,提示细胞凋亡.结论:本研究通过光镜、电镜以及免疫组化等多方面的证实:Taxol主要是通过诱发细胞凋亡的机制而抑制RLECs生长的.
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不同来源人牙龈成纤维细胞体外降解胶原能力研究
目的: 体外培养条件下比较健康人及侵袭性牙周炎患者的牙龈成纤维细胞对鼠I型胶原降解的影响和差异. 方法: 在6孔板底制备胶原膜,取固定数量的对数生长期健康人及侵袭性牙周炎患者的牙龈成纤维细胞接种于胶原膜中央,分别于孵育24, 48, 72 h后消化弃去细胞,考马斯亮兰液染色胶原膜,显微镜下测定降解区和非降解区的光密度来比较不同时间段各组细胞的胶原降解量. 结果: 健康人和侵袭性牙周炎各3例标本来源细胞的结果基本一致,表现为随时间的延长,胶原降解量相应增加;而各时间段病变组的胶原降解量较健康组明显增加(P<0.05). 结论: 健康人和侵袭性牙周炎的牙龈成纤维细胞对鼠Ⅰ型胶原均有降解作用并呈现出时间效应,而且病变组的作用更强.