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TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR联合检测难辨梭菌菌属基因及毒素基因方法学的建立
目的：建立一种简便、快速难辨梭菌菌属鉴定及其毒素基因筛查的荧光定量PCR检测方法。方法采用TaqMan-MGB探针，通过real-time PCR分析系统，同时检测难辨梭菌菌属基因磷酸丙糖异构酶（Tpi）、A毒素（TcdA）、B毒素（TcdB）及缺失部分基因的A毒素（TcdAT），从特异度、灵敏度及其抗干扰性等方面评价该方法，并联合全自动酶联荧光免疫系统（VIDAS）检测50例临床不明原因腹泻病例粪便标本探讨其应用价值。结果难辨梭菌非产毒株Tpi基因（tpi）的检测下限是6×10-2 CFU/μl，产毒株tpi、tcdA、tcdB、tcdAT的检测下限为6×10-1 CFU/μl；难辨梭菌非产毒株tpi检测下限批内、批间变异率分别为2.1%和2.3%；产毒株tpi、tcdA、tcdB、tcdAT的检测下限批内、批间变异率依次为3.0%和3.4%、2.9%和3.2%、5.3%和5.7%、2.7%和2.8%。临床常见分离菌株及梭菌属其他细菌对检测无干扰。50例不明原因腹泻病例粪便标本中，采用TaqMan-MGB探针实时荧光PCR与VIDAS酶标免疫检测39例阴性标本其符合率为100%；6例两方法检测均为阳性；3例VIDAS酶标免疫检测为可疑及2例为阴性，经TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测为A-/B＋菌株。结论建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR具有高通量、高灵敏度和重复性好的特性，且可筛查携带缺失部分基因的TcdA难辨梭菌菌株。
关键词： 难辨梭菌 TaqMan-MGB探针 实时荧光定量PCR 菌属基因 毒素基因 -
艰难梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值
目的 探讨艰难梭菌毒素A/B及其相关毒素基因检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值.方法 收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹泻疑似艰难梭菌感染患者的粪便标本133例作为研究对象,分别采用艰难梭菌培养法、CDAB法、PCR毒素基因检测法及艰难梭菌毒素GDH检测法进行检测,以艰难梭菌培养法结果为金标准,计算各方法的诊断指标所包含有的特异度、敏感度、阴性预测值和阳性预测值等.结果 本研究收集的133例粪便标本中,经过金标准粪便样本厌氧培养法检出阳性结果20例,阴性结果113例.CDAB法具有低敏感度(0.550)和高特异度(0.912),诊断符合率为0.932,BD-PCR毒素基因检测法具有高敏感度(0.950)和高特异度(0.929),诊断符合率为0.932,艰难梭菌毒素GDH检测法的高敏感度(0.900)和低特异度(0.779),诊断符合率为0.797.结论 对于疑似艰难梭菌感染,可联合艰难梭菌GDH、艰难梭菌毒素A/B(CDAB)或进行荧光定量PCR毒素基因共同检测,有效降低检测时间,为临床医师及时提供准确的诊断依据,并制定行之有效的治疗措施.
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霍乱弧菌的一种新的不含毒素基因 CTXФ基因组的复制功能研究
引起霍乱流行的霍乱弧菌菌株在遗传方面的一个重要特点是都带有霍乱毒素(CT)的基因ctxAB.对O139群菌株的分析中,发现一种新的不含ctxAB的CTXФ基因组,其中的rstR基因和ig-2区与已发现的CTXФ基因组的相应序列无明显同源性,其他的基因很保守,也不含ctxAB基因,命名为nct-CTXO139Ф.
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转导单链免疫毒素基因的PBMCs对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤活性
目的:用携带分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因(sFv-TNF-α)的重组逆转录病毒感染人外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMCs),使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白,观察转导的PBMCs对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用.方法:用感染生重组病毒产生细胞C22(PA317/PST)产生的病毒上清转导人PBMCs,采用PCR和RT-PCR方法对转导的PBMCs(PBMCs/PST)进行DNA和mRNA水平的分析.PBMCs/PST与SMMC-7721共培养,MTT法检测PBMCs/PST表达产物对肝癌细胞的体外杀伤活性.结果:PCR及RT-PCR结果显示PBMCs/PST中扩增出外源目的基因对应的电泳条带.MTT法检测结果,分泌型抗肝癌单链免疫毒素对体外培养肝癌细胞SMMC-7721的杀伤率为(38.2±6.7)%.结论:分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因可以在PBMCs中整合并稳定表达,其分泌的表达产物对 SMMC-7721具有一定的体外杀伤作用.
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蜂毒素基因重组腺病毒转染对肝癌细胞周期及磷脂酶A2表达的影响
蜂毒素(Melittin, Mel)是一种动物毒素,具有显著的抗肿瘤作用[1],但其溶血副作用限制了临床应用.为达到减毒增效的目的,将编码蜂毒素的基因置于人甲胎蛋白(AFP)基因启动子后,以复制缺陷型腺病毒为载体构建重组腺病毒.在初步证实该重组腺病毒对AFP阳性肝癌细胞具有特异性杀伤作用的基础上[2,3],通过观察其对肝癌细胞周期及磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)表达的影响,探讨其作用机制.
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中国部分城市艰难梭菌携带毒素基因特征分析
目的 了解中国5个城市艰难梭菌携带毒索基因特征,为中国艰难梭菌感染诊治提供试验依据.方法 收集2013年6月-2015年6月中国上海、杭州、宁波、郑州和南京5个城市分离自住院患者和环境表面的艰难梭菌,采用多重PCR的试验方法,对所有菌株进行tcdA/tcdB/cdtA/cdtB 4个毒素基因检测,分析所携带的毒素基因特征.结果 中国5个城市共成功复苏出艰难梭菌408株,371株来自患者的艰难梭菌经多重PCR检测,tcdA+,tcdB+基因阳性299株,阳性率为80.59％,tcdA-、tcdB-阳性44株,阳性率为11.86％;37株来自环境的艰难梭菌经多重PCR检测,tcdA-、tcdB-阳性15株,阳性率40.54％;tcdA-、tcdB+阳性9株,阳性率24.32％;中国部分城市的艰难梭菌携带毒素基因以A+B+毒素基因为主,产双性毒素基因占1.08％.结论 研究所揭示的艰难梭菌毒素基因特征应引起临床医师高度关注,尤其是在选择以检测毒素为主的诊断技术时,应考虑不同方法检测毒素基因的能力.
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不同产毒类型艰难梭菌耐药性特征分析
目的 通过研究临床艰难梭菌菌株的临床特征和耐药性,为临床防治艰难梭菌提供理论依据.方法 收集2015年全年分离自临床的艰难梭菌,采用PCR技术检测其毒素基因,采用琼脂稀释法检测其耐药性,对患者的临床资料进行分析.结果 共收集临床送检粪便标本144份,分离培养出艰难梭菌33株,艰难梭菌阳性检出率为22.92％;科室分布以神经外科、神经内科和消化科为主;分离所得到的艰难梭菌体外实验均对万古霉素、甲硝唑和替加环素敏感,对红霉素和亚胺培南耐药检出株数多,其次为克林霉素;33株艰难梭菌毒素基因检测结果A+B+菌株24株,A-B+菌株1株;未检测到二元毒素基因cdtA和cdtB;产毒菌(25株)和非产毒菌(8株),两组菌株均对万古霉素、甲硝唑和替加环素敏感;非产毒艰难梭菌和产毒菌株对抗菌药物红霉素、亚胺培南、克林霉素、利福平和左氧氟沙星的耐药率比较,虽差异无统计学意义,但均高于产毒菌株;患者感染艰难梭菌后,均出现不同程度的腹泻,使患者病情加重,住院时间延长,并出现2例死亡病例.结论 非产毒菌株对多种抗菌药物耐药率均高于产毒菌株,并出现对万古霉素敏感性降低的菌株,提示本地区艰难梭菌耐药性可能增加,甚至可能出现耐万古霉素的艰难梭菌.
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创伤患者金黄色葡萄球菌感染的分子流行病学研究
目的通过对创伤病房金黄色葡萄球菌(SA)感染的分子流行病学研究,为临床预防和治疗SA感染提供科学依据. 方法收集创伤病房近3年SA培养阳性病例29例,采用多重PCR扩增SA的毒素基因tst和sec,分析毒素基因的存在与发热的关系;通过PCR扩增MRSA基因组稀有限制区旁的DNA序列,对MRSA进行基因分型. 结果 29例患者中,12例为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA);17例为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA);MRSA携带tst和sec基因比率(均为88.2%)显著高于MSSA(分别为33.3%和41.7%, P=0.014);19例伴有发热,其中16例含有tst和sec基因,10例不伴发热,其中4例含tst和sec基因,发热组携带两种基因比率显著高于不发热组(P=0.032);稀有限制区PCR(IRS-PCR)分型表明2001年感染MRSA的10例患者有8例为同种基因型. 结论 tst和sec基因的存在可能与金黄色葡萄球菌引起的发热有关,2001年创伤病房可能存在MRSA暴发流行.
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多重聚合酶链反应方法检测艰难梭菌毒素基因研究
目的 探讨同时检测艰难梭菌毒素A、B基因和二元毒素基因的多重聚合酶链反应(PCR)方法.方法 收集2014年1-9月医院120例住院腹泻患者的粪便标本 ,用艰难梭菌选择性培养基CCFA分离培养艰难梭菌 ;采用法国生物梅里埃公司厌氧菌鉴定试剂盒鉴定 ;采用酶免夹心与终点荧光检测相结合技术(ELFA ) ,检测艰难梭菌毒素A、B基因 ,并分析其毒素特征 ;将艰难梭菌纯培养出的菌落用多重PCR方法测定艰难梭菌的毒素A、B基因和二元毒素基因.结果 120例腹泻患者送检粪便标本中 ,分离培养出19株艰难梭菌 ,艰难梭菌分离率达15 .8% ;应用免疫学方法检测毒素检出率为52 .63% ;用多重PCR方法艰难梭菌A、B毒素基因检出率为94 .7% ;15例患者送检粪便标本检测艰难梭菌A、B毒素阳性中 ,10株分离培养并鉴定出艰难梭菌 ;105例患者送检粪便标本检测艰难梭菌A、B毒素阴性中 ,有9例分离培养并鉴定出艰难梭菌.结论 利用多重 PCR检测艰难梭菌毒素A、B基因和二元毒素基因 ,较传统的免疫学方法敏感性高 ,能够准确地区分艰难梭菌毒素基因的类型 ,多重PC R是一种快速、特异的一步筛选艰难梭菌毒素基因的方法.
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健康儿童产毒艰难梭菌定植率研究
目的 调查健康儿童中产毒的艰难梭菌定植情况,了解各年龄段产毒艰难梭菌的定植率及其毒素类型.方法 病例观察性研究,连续性收集2014年9月至2015年1月北京儿童医院保健科健康儿童的粪便标本,按年龄分4组,分别是＜1岁53例,1～＜3岁、3～＜6岁和6～ ＜14岁组各50例,共203例,应用PCR检测艰难梭菌的毒素基因,包括tcdA、tcdB及二元毒素基因,并检测其毒素调节基因,包括tcdC、tcdD、tcdE.对阳性结果进行基因测序分析.计量资料组间比较采用t检验、秩和检验,计数资料采用x2检验.结果 入组的203例标本中共检测出产毒艰难梭菌阳性标本15例(7.4％),其中tcdA阳性而tcdB阴性(A+B-)基因型8例,tcdA、tcdB均阳性(A+B+)基因型4例,tcdA阴性而tcdB阳性(A-B+)基因型3例(20.0％),未检测到二元毒素阳性标本.tcdC、tcdD、tcdE基因阳性的标本分别为8例(53.3％)、6例(40.0％)、11例(73.3％).tcdA、tcdB、tcdC、tcdD、tcdE基因阳性标本经测序未发现基因突变.在15例阳性标本中,＜1岁组检出4例(4/53,7.5％);1～＜3岁组检出4例(4/50,8.0％);3～＜6岁组检出1例(1/50,2.0％);6～＜14岁组检出6例(6/50,12.0％),各年龄组产毒艰难梭菌定植率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 本组产毒的艰难梭菌在健康儿童中的定植率为7.4％,且各年龄组均可检测到产毒的艰难梭菌.
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临床腹泻患者艰难梭菌的感染情况和分子流行特征
目的 了解临床腹泻患者艰难梭菌的感染情况和分子流行特征,为控制医院感染和临床诊疗提供依据.方法 收集2016年1～12月浙江省嘉兴市第二医院临床腹泻患者粪便标本852份作为实验组,同期健康体检成人粪便标本310份作为对照组,厌氧培养获得艰难梭菌的阳性率,并结合毒素基因型和多位点序列分型进行综合分析.结果 实验组852份粪便标本中共分离到108株艰难梭菌,阳性率为12.68％,而对照组310份粪便标本分离到8株,阳性率为2.58％,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组以tcdA+tcdB+菌株为主,占86.11％(93/108),tcdA-tcdB+菌株占5.56％(6/108),tcdA-tcdB-菌株占8.33％(9/108),产毒率为91.67％,而对照组对应毒素基因型别占比为62.50％(5/8),12.50％(1/8),25.00％(2/8),产毒率为75.00％,但两组产毒率比较差异无统计学意义(P>0.05);实验组多位点序列分型发现32种ST型,其中ST54是相对流行的型别,另外CC48是相对流行的克隆群.结论 临床腹泻患者艰难梭菌的感染率较高,亟需引起临床重视并加强院感防控,预防暴发流行.
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天津市滨海新区汉沽市售麻蚶中副溶血性弧菌的分离与分子特征
目的 监测市售贝壳类海产品中副溶血性弧菌的带菌状况、了解副溶血性弧菌的血清型别分布、耐药性特点及基因型别特征.方法 随机采集15份汉沽海鲜市场麻蚶,按照GB4789.7-2013《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》进行分离鉴定,荧光定量PCR对耐热直接溶血素(tdh)和相关溶血素(trh)进行了毒力基因检测,K-B纸片扩散法对分离的菌株用15种抗生素进行耐药性监测,玻片凝集法进行血清分型,脉冲场凝胶电泳(PFGE)用BioNumerics软件,进行聚类分析.结果 15份麻蚶样品分离出副溶血性弧菌108株,毒力基因检测tdh和trh均为阴性.耐药性监测,79株(79/108)呈现单一耐药、22株(22/108)双重耐药、4株(4/108)为多重耐药,分别占73.15％,,20.37％,和3.7％.血清分型O群3个,其中O1群(78株)、O5群(24株)和未定型6株;K抗原定型12个,72株,未定型2个36株.PFGE分出102个不同的带型.结论 汉沽区市售麻蚶中副溶血性弧菌检出率高,但菌株均未携带毒力基因.耐药性监测,97.22％的菌株至少对单一抗生素耐药,血清型别分布呈多样性,PFGE图谱呈多态性.
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PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7
目的研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响.方法选择O157∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物,分别或共同进行PCR扩增,检测40株O157∶H7和非O157∶H7菌株,将细菌按10+1～10+6稀释后比较PCR的检测灵敏度.结果所有O157∶H7菌株均在497 bp和625 bp处出现O157抗原基因和H7抗原基因产物,其产毒株在484 bp和(或)210 bp处出现SLT2和(或)SLT1基因产物,非O157∶H7菌株PCR结果均为阴性;单一PCR检测灵敏度为150 CFU/PCR反应,多重PCR为＞1 500 CFU/PCR反应.结论在经过增菌后,多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便,为产毒和非产毒O157∶H7的诊断提供了新的手段.
关键词： 大肠杆菌O157∶H7 聚合酶链反应 rfbE基因 fliC基因 毒素基因 -
普洱茶中微生物的筛选及其安全性初步评价
目的 在对普洱茶中微生物筛选和鉴定基础上对蜡样芽胞杆菌毒素基因的分布、普洱茶下调毒素基因的表达和改善肠上皮细胞的损伤进行研究.方法 分别采用无菌水和沸水泡制普洱茶, 获得分离株, 通过16SrDNA测序以及生理生化试验确定其归属;对所筛选的菌株进行耐模拟胃肠液能力评价和毒力基因的检测;采用细胞实验和荧光定量PCR技术, 研究普洱茶对蜡样芽胞杆菌毒素的抑制作用.结果 无菌水浸泡普洱茶获得的45株菌中44株为芽胞杆菌属, 沸水浸泡获得的7株菌均为蜡样芽胞杆菌 (FBCE01、FBCE06、FBCE10、FBCE14、FBCE20、FBCE26和FBCE29), 多重PCR技术结果表明其分别含有毒力基因cytK、nheA和hblD的2种或3种.耐模拟胃肠液实验表明, 7株菌均具有很强的耐模拟胃肠液消化能力;细胞实验结果发现, 普洱茶汤能显著降低蜡样芽胞杆菌对Caco-2细胞的粘附 (P＜0.05);MTT实验结果显示, 普洱茶能有效降低蜡样芽胞杆菌对细胞的损伤;荧光定量PCR技术结果进一步说明, 普洱茶使蜡样芽胞杆菌肠毒素的mRNA表达水平下调.结论 普洱茶具有抑制蜡样芽胞杆菌毒素的作用.
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EGF-PE40重组毒素的构建
重组毒素是继单克隆抗体导向药物之后出现的新型导向药物[1,2],它将毒素基因和靶向基因融合,表达融合蛋白,具有识别和选择性破坏特异性受体的靶细胞的功能,它由导向部分和毒性部分二部分组成.绿脓杆菌外毒素通常作为重组毒素的毒性成分,其毒性本质是它能够催化真核细胞延伸因子-2的ADP核糖基化,阻止肽链延长中断细胞蛋白质合成而行使细胞毒作用[3].作为重组毒素的导向部分,除能够与特定靶细胞表面受体结合外,同时能够与毒素基因相融合,表达出融合蛋白,且二者不影响各自独立结构和功能.EGF不仅能够与头颈部鳞癌细胞过度表达的EGFR特异结合,而且对鳞状细胞癌的细胞分裂起抑制作用[4].本项研究的目的是通过基因工程方法将EGF基因与绿脓杆菌外毒素基因的PE40基因片段相融合,构建重组毒素EGF-PE40,并通过其表达蛋白观察EGF-PE40对头颈部鳞癌细胞的细胞毒作用,为临床治疗头颈部鳞状细胞癌提供指导.
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美国微生物学会会讯摘要
1.近来,对囊泡肺纤维化病(cystic fibrosis)患者的细菌群体研究发现,在生物膜中非致病菌可分泌信号,诱导周围的铜绿假单胞菌(又称绿脓杆菌)的毒力基因,引起肺部阻塞性病变.虽然早已了解生物膜中群体细菌的生物活性与浮游的细菌不同,但要证明这一点有一定技术上的问题.加拿大学者Surette等发展了一种技术将细菌混合接种于磁珠上,磁珠上已有不同组织特异的蛋白,形成生物膜后,可利用磁珠吸引法,将生物膜中的细菌与游离菌分离,转人微量孔培养板分析其特性.这一技术称为Magna Film.通过研究发现,口咽部的正常菌群可以启动绿脓杆菌的毒力基因,包括弹性酶和外毒素基因.诱导毒力基因的过程是由自身诱导素-2(autoinducer-2,AI-2)介导的,虽然绿脓杆菌自身不产生AI-2,但自患者痰中分离的咽正常菌群却可产生不等量的AI-2,因此口咽部正常菌群通过分泌信号可诱导绿脓杆菌的毒力基因.
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不同基因型幽门螺杆菌感染与三联疗法根除治疗关系探讨
以质子泵抑制剂(PPI)为基础的三联疗法,是目前常用的根除幽门螺杆菌(Hp)的治疗方案,但并不是所有的三联疗法均能达到满意的疗效[1].近有证据表明,Hp不同根除率与其含有的细胞毒素相关基因(cagA)及空泡形成细胞毒素基因(vacA)亚型有关.为证实这一理论,我们在十二指肠溃疡患者中进行以埃索美拉唑为基础的三联根除治疗,探讨Hp不同基因型及细菌诱导胃黏膜组织学改变时根除率的影响,为今后提高Hp根除率及指导临床治疗提供依据.
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不同来源的副溶血性弧菌毒素基因检测和耐药性分析
目的 了解常熟地区副溶血性弧菌中毒素基因的分布和耐药性情况,为指导用药提供依据.方法 利用实时荧光PCR方法,对常熟地区2013-2014年分离的211株副溶血性弧菌进行毒素基因检测;对2014年分离的134株副溶血性弧菌进行耐药性分析.结果 在211株副溶血性弧菌中,检测出毒素基因阳性98株,占46.4％.其中,来源为食物中毒的菌株60株,检测出毒素基因阳性41株(68.3％);来源为食源性疾病哨点监测的菌株74株,检测出毒素基因阳性57株(77.0％);来源于环境水或水产品的菌株77株,未检测到毒素基因.20种药物的耐药性检测发现,97.76％的副溶血性弧菌对氨苄西林耐药,部分菌株对头孢呋辛、头孢噻吩、阿米卡星耐药,少数菌株对四环素、庆大霉素和复方新诺明耐药,对其他抗生素均敏感.结论 不同来源的副溶血性弧菌菌株毒素基因阳性比例有显著差异;除氨苄西林外,其他抗生素对副溶血性弧菌导致的腹泻有部分或较好的疗效.
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致病性大肠埃希菌毒素基因的Allglo探针技术鉴定
目的：基于Allglo探针技术结合多重荧光PCR，建立快速、简便鉴定致病性大肠埃希菌相关毒素基因的方法。方法选取致病性大肠埃希菌的紧密黏附素基因（ eae）、志贺样毒素Ⅰ基因（ stx I）、志贺样毒素II基因（ stx II）和转录激活因子基因（ aggR）作为靶点。通过设计引物和Allglo探针，建立多重荧光PCR反应体系。同时，构建了4种毒素基因标准质粒，进而评价方法的特异性、灵敏性和重复性。结果基于Allglo探针技术的多重荧光PCR方法可同时准确、特异地鉴定致病性大肠埃希菌所携带的4种毒素相关基因，eae基因和aggR基因的灵敏度为10 copies/μL，stx I基因和stx II基因的灵敏度为1 copies/μL；定量检测的批间和批内变异系数均小于5%。对356份腹泻粪便样本进行评价，结果显示检出39份基因阳性。39份阳性样本中，eae基因阳性为53.85%，stxⅠ基因和stx II基因阳性为23.08%，aggR基因阳性为46.15%。通过直接测序方法进行鉴定，符合率达到100.00%。结论本实验建立的基于Allglo探针技术结合多重荧光PCR方法具有操作简便、特异性好和灵敏度高等特点，为致病性大肠埃希菌鉴定提供了一种快速、可靠的检测方法。
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LAMP法同步检测食物中毒标本中的副溶血性弧菌
副溶血性弧菌是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌,主要存在于近海岸的海水、海水沉积物及鱼虾、贝类等海产品中[1-2].人们食用受该菌污染的食品后,容易引起急性胃肠炎而导致腹泻、呕吐及肠痉挛等,严重的患者还会出现脱水、休克昏迷,甚至死亡.本文应用环介导等温扩增技术(LAMP)技术检测副溶血性弧菌的不耐热溶血毒素基因(tlh),同时以GB/T 4789.7-2008[1]中的方法进行平行对照实验,并对2种方法的结果进行比较分析.
