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四种食源性病毒多重反转录-聚合酶链反应检测研究
目的 建立同时检测诺如病毒、轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒多重RT-PCR检测方法.方法 以四种食源性病毒的高度保守区为靶序列设计特异引物,优化反应体系和条件,确定多重RT-PCR检测四种病毒的特异性和灵敏度,并初步应用于临床样本中四种病毒的同时检测.结果 在灵敏度试验中得到的轮状病毒、诺如病毒和星状病毒稳定的高检测限均为50 pg/ml,甲肝病毒为100 pg/ml.在128份临床粪便样本中,其中轮状病毒阳性62份(48.44%),诺如病毒阳性8份(6.25%),星状病毒阳性11份(8.59%),甲肝病毒阳性4份(3.12%).结论 研究所建立的多重RT-PCR方法,在实际应用中能同时处理大量的样本,提高PCR检测方法的能力,可以应用于临床病例的诊断和流行病学调查等研究.
关键词： 食源性病毒 多重反转录-聚合酶链反应 检测 -
草莓中诺如病毒不同洗脱和富集方法的评估
评估一种快速和敏感富集草莓中诺如病毒的方法,为病毒性食源性疾病的防控提供支持.以鼠诺如病毒-1(MNV-1)为模式病毒,考察Tralk洗脱液、TGBE洗脱液和NaOH洗脱液对MNV-1的洗脱效果,检测5％、10％和15％ PEG6000/0.3M NaCl对MNV-1的富集效果,评估优化后方法对草莓中诺如病毒的富集效果和超滤二次浓缩对诺如病毒富集效果影响.结果表明TGBE缓冲液洗脱效果优于Tralk洗脱液和NaOH洗脱液;10％PEG6000/0.3M NaCl与15％PEG6000/0.3M NaCl对MNV-1的富集效果相同,且二者的富集效果均高于5％PEG6000/0.3M NaCl;该优化方法可在7h内完成草莓中诺如病毒的富集,诺如病毒的回收率高可达44.04％,超滤二次浓缩后,诺如病毒的检测限达到102基因拷贝数/10g草莓.
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基于受体捕获诺如病毒检测方法的特异性及应用
目的 评价新型感染性诺如病毒检测方法原位捕获反转录实时定量PCR(In situ capture realtime quantitative reversetranscription polymerase chain reaction,ISC-RT-qPCR)的特异性,并将其应用于新鲜草莓中诺如病毒的检测.方法 以诺如病毒G Ⅱ组不同基因型和不同浓度的临床粪便标本评价ISC-RT-qPCR方法的特异性.此外,利用ISC-RT-qPCR方法对以G Ⅱ组诺如病毒人工污染新鲜草莓样本进行检测.结果 ISC-RT-qPCR可特异性检测所有G Ⅱ诺如病毒8种基因型临床腹泻样本;与传统RT-qPCR相比,检测的Ct值并未随着诺如病毒滴度的降低而升高.人工污染新鲜草莓的ISC-RT-qPCR检测限为1.36基因组拷贝数.结论 ISC-RT-qPCR是一种可用于临床腹泻样本和草莓中G Ⅱ组感染性诺如病毒的检测方法,为食品中诺如病毒的检测与监测提供了技术储备.
关键词： 食源性病毒 诺如病毒 原位捕获反转录实时定量PCR 草莓 -
食源性致病病毒基因芯片方法检测
目的 将基因芯片技术用于食源性致病病毒诺如病毒、轮状病毒、甲肝病毒、星状病毒和脊髓灰质炎病毒的检测,达到同时检测2种以上病毒的需求.方法 采用基因芯片方法检测贝类食品中引起人类腹泻的5种食源性致病病毒.结果 所研制的检测5种病毒的基因芯片具有良好的特异性,在5种病毒之间无交叉反应;其灵敏度与荧光PCR方法基本一致;芯片在4℃条件下,保存7.5个月,性能稳定.结论 建立了检测5种食源性病毒的基因芯片方法,同时该方法也可用于医疗检验目的 .为基因芯片在微生物检测领域的应用提供基础依据.
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MS2噬菌体在贝类食源性病毒检测中过程质控应用
目的 研究MS2噬菌体作为过程质控品在贝类食源性病毒检测中的应用.方法 采用双层琼脂培养法制备MS2噬菌体悬液,计算效价;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检验其稳定性;比较3种RNA提取方法的提取效率,确定MS2噬菌体的适添加量范围;分析MS2噬菌体添加对贝类食源性病毒检测的影响.结果 稳定性研究表明-20℃和-80℃28 d MS2噬菌体(悬液的效价浓度为7.13×1011 pfu/mL)时RNA含量无明显变化[t =0.464,P=0.653(-20℃);t=0.602,P=0.561(-80℃)].MS2噬菌体适添加量范围为7.13 ×108 ～7.13×107 pfu/mL.在适添加范围内,试剂盒方法和Trizol裂解结合磁珠纯化方法回收率均＞1％.2种阳性样品均被检出,其Ct值比较接近,MS2噬菌体对贝类食源性病毒检测无影响(t=0.170,P=0.873).结论 MS2噬菌体可作为贝类食源性病毒qRT-PCR检测的过程质控品,是监控假阴性结果的一种简便有效的方法.
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食品中病毒提取与检测方法研究进展
随着食源性疾病事件的频频发生,食品安全已成为一个严重的世界卫生问题.研究表明大多数食源性疾病的暴发主要是由食源性病毒引起的.此类病毒在许多食物表面或者内部都有分布,会引起疫病暴发和流行,危害人体健康,对食品企业造成重大经济损失.为及时了解食品中病毒情况,需要对不同食物来源中的食源性病毒进行准确检测.通常食源性病毒的检测分成3个部分:病毒的提取、病毒基因组的纯化和分子检测.但在实际检测中,由于食物的组成成分差异性大以及食源性病毒污染量少、致病性高等特点,使得不同食品中病毒的检测难度增加.本文就已报道文献中食源性病毒提取及检测方法加以阐述,为进一步完善食品中病毒检测方法提供思路.
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舟山市海产贝类常见食源性病毒监测分析
目的 了解舟山市海产贝类常见食源性病毒污染状况,为食源性疾病的防制和预警提供依据.方法 于2016年在舟山市水产养殖场和农贸市场采集毛蚶、 牡蛎和贻贝等贝类样品,经病毒富集浓缩处理后,进行核酸提取和荧光定量RT-PCR检测.结果 共采集贝类样品466份,检出病毒阳性89份,阳性率为19.10%;诺如病毒Ⅱ型(NV2)、 札如病毒(SPV)、 星状病毒(AsV)、 戊肝病毒(HEV)和肠道腺病毒(AdV)阳性率分别为4.08%、9.66%、2.79%、1.07%和1.50%.未检出诺如病毒Ⅰ型(NV1)、 甲型肝炎病毒(HAV)和轮状病毒(RV).不同季节病毒阳性率比较,冬、 春季高于夏、 秋季(均P<0.0083).结论 舟山市海产贝类中食源性病毒阳性率较高,以SPV和NV2为主.
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江苏省部分地区716例食源性疾病病毒感染检测与分析
目的 监测和评价江苏地区食源性疾病常见病毒感染状况,为食源性疾病的控制和早期治疗提供科学依据.方法 收集2012年3月-2013年2月江苏省徐州、常州、南京3市哨点医院相关食源性疾病患者的肛拭子标本,采用荧光定量RT-PCR方法检测轮状病毒、星状病毒、杯状病毒和腺病毒.结果 共计716份肛拭子标本,病毒检测阳性173例,阳性率为24.16％.其中轮状病毒占检出病毒阳性数的50.29％ (87/173),杯状病毒占26.59％(46/173),星状病毒占13.29％(23/173),腺病毒占9.83％(17/173).上述病毒感染均以＜2岁婴幼儿为主.不同月份病毒检出阳性率差异有统计学意义(P＜0.05),其中7月份高,达34.38％.结论 江苏省徐州、常州、南京3市食源性疾病感染的主要病毒为轮状病毒,同时也应重视杯状病毒、星状病毒及腺病毒等感染在食源性疾病中的致病作用.建议提高健康儿童相关疫苗的覆盖率,加强食源性病毒的监测,阻止疾病的传播流行.
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食源性诺瓦克样病毒检测技术研究进展
诺瓦克样病毒(Norwalk-like viruses,NLVs)是世界范围内急性流行性胃肠炎(即非菌性胃肠炎)的重要病因,是一种重要的食源性病毒.食品市场的全球化、国际贸易、国际旅游业的快速增长,引发了食品的高风险性,并使食源性疾病有在全球蔓延的趋势.随着发达国家对NLVs的日益关注和研究的日趋深入,近年来国内对NLVs的研究已开始重视,1995年我国首次从河南报道了腹泻患者中分离到诺瓦克病毒[1].本文主要从食品安全的角度去归纳和反映近年来国内外有关NLVs检测技术的研究进展,以便为研究食品中NLVs的快速检测技术和应用提供参考.
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宁波市食源性腹泻患者中3种相关病毒的检测与分型
目的 了解腹泻患者中食源性相关病毒感染情况与流行特征,为防控病毒性胃肠炎提供依据.方法 采集2 129份食源性腹泻患者粪便标本,用实时荧光定量PCR法检测轮状病毒、诺如病毒和甲型肝炎病毒核酸;用NSP4和VP1基因对轮状病毒和诺如病毒流行株分别测序.结果 检出轮状病毒核酸52份,阳性率为2.44％,以A组感染为主;检出诺如病毒核酸113份,阳性率为5.31％,以Ⅱ型为主.VP1基因将诺如病毒分为GⅠ.2、GⅡ.6和GⅡ.17 3个型;A组轮状病毒均带NSP4毒力基因.全年均可检出病毒,秋冬季是发病高峰;全人群均可检出,5岁～及其以下年龄组的阳性率高于18岁～年龄组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 检测发现A组轮状病毒和GⅡ.17型诺如病毒是本市病毒性胃肠炎主要流行病原.病原感染途径多样、带毒者多、人群普遍易感、全年均可检出,本市人群随时有暴发疫情的可能.应加强关注,强化检测,以减少疾病的流行.
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食品中食源性病毒快速检测方法的建立研究
目的 建立诺如病毒、轮状病毒、甲肝病毒的分子快速检测方法,为食品中食源性病毒检测提供技术支持.方法 建立3种食源性病毒RT-PCR检测方法,通过梯度稀释的阳性对照对检测条件进行优化,分析其特异性和准确性.同时对临床表现为水样便,伴发热、恶心、呕吐等排除细菌性胃肠炎的患者腹泻样本和与食源性病毒流行有关的食品标本进行方法验证和食源性病毒调查.结果 优化试验验证了诺如病毒、轮状病毒、甲肝病毒各自的RT-PCR特异性;并通过在非细菌性胃肠炎患者腹泻标本中检出诺如病毒、轮状病毒验证了其准确性.结论 建立了诺如病毒、轮状病毒、甲肝病毒的分子快速检测方法.本地区病毒性胃肠炎的主要病原体为诺如病毒和轮状病毒,且轮状病毒的感染率高于诺如病毒.
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广东省市售牡蛎中诺如病毒污染调查
目的 调查广东省地区市售牡蛎中诺如病毒污染状况并对阳性株进行鉴定、分型,为控制和预防因食用牡蛎而引起诺如病毒胃肠炎提供基础数据.方法 应用实时荧光定量RT-PCR,对2016年1月-2017年12月期间在广东省8个城市收集的290份牡蛎样品进行诺如病毒定性和定量检测,并对不同季节、城市及采样点诺如病毒的污染情况及基因分型情况进行比较.结果 290份牡蛎样品的诺如病毒总检出率为为17.20％(50/290),不同季节的诺如病毒污染率分别为春12.50％、夏6.90％、秋18.30％和冬30.70％;从病毒污染的不同基因型分析,GⅠ诺如病毒检出率为6.20％,GⅡ型诺如病毒检出率为11.00％.结论 广东省市售牡蛎存在诺如病毒污染,且污染具有季节特点,以冬季污染较严重,具有较高引起食源性胃肠炎疾病感染的风险,其基因型以GⅡ型为主.
