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持续释放人血管抑素的基因修饰化工程细胞hE/293细胞株的建立
目的:在人胚肾HEK293细胞中转染真核表达载体pSNA2/hEndostatin(hEndostatin,人血管抑素),建立能稳定分泌hES的基因工程细胞株.方法:将含有IL-2分泌肽的人endostatin(ES)全长cDNA插入真核表达载体pSNA2,产生重组质粒pSNA2/hEndostatin;利用阳离子脂质体介导将其转染入HEK293细胞中;用G418筛选出阳性克隆细胞,将其命名为hE/293细胞.用Western blot法检测hE/293细胞培养上清中分泌的hES蛋白.血管内皮细胞(ECV304)增殖抑制试验及鸡胚尿囊膜试验观察其分泌的hES蛋白的抗增殖活性.结果:经过双酶切和DNA测序证实构建出了含hES基因的真核表达载体.通过G418抗性筛选筛选出稳定表达hES的细胞株3株,将其命名为hE/293细胞;Western blot检测该细胞株培养上清中存在分子量为20 kDa的ES蛋白;ECV304增殖抑制试验显示,与HEK293细胞组相比,hE/293细胞组分泌的ES蛋白对bFGF刺激的血管内皮细胞增殖有明显的抑制作用(48 h:0.125±0.007 vs 0.159±0.020,P<0.01;72 h:0.088±0.016 vs 0.249±0.070,P<0.01);鸡胚尿囊膜试验证实hE/293细胞分泌的ES蛋白可以抑制鸡胚尿囊膜血管生长.结论:所构建的hE/293细胞株可以稳定的分泌hES蛋白,并能抑制ECV304细胞生长及鸡胚尿囊膜血管生长.
关键词: 人内皮抑素 真核表达载体 人胚胎肾细胞 hES细胞株 Western blot -
人工构建含丙型肝炎病毒核糖体插入位点的双顺反子表达载体
目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中.在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心基因,测序鉴定后获得的质粒经脂质体转染hepG2细胞,间接免疫荧光染色和Western-blot检测.结果:在间接免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见乙型肝炎病毒S基因和核心基因表达.转染细胞破碎后免疫沉淀检测和图像分析表明,两种基因有相似的表达量.结论:人为截断HCV 5'NTR区17个碱基,并不影响IRES对下游基因蛋白质翻译,为成功构建了含丙型肝炎病毒IRES的双顺反子表达载体打下基础.
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P21真核表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖的影响
目的:构建核定位信号突变型P21基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法:采用基因定点诱变技术获得核定位信号突变型P21基因.采用DNA重组技术,将突变型P21基因亚克隆至pDsRed1-C1真核表达质粒中,重组为pDsRed1-C1-P21NLS-.酶切鉴定及DNA测序,脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR检测目的基因pDsRed1-C1-P21NLS-的表达,荧光显微镜观测目的基因亚细胞定位,台盼蓝拒染法检测质粒转染HepG2细胞生长曲线.结果:成功克隆了核定位信号野生型及突变型P21基因,成功构建TpDsRed1-C1-P21WT及pDsRed1-C1-P21NLS-重组质粒,酶切片段分别为4.7和0.5 kb,酶切鉴定正确,测序结果与GenBank核酸序列数据库比对表明,核定位序列中共9个核苷酸发生变异,由CGAAAACGG突变为GCGGCCGCG,测序成功.高效表达的红色融合蛋白,野生型主要定位于细胞核:而突变型主要定位于细胞质.野生型P21抑制HepG2细胞的生长;突变型促进HepG2细胞的生长,二者差异具有统计学意义(P<0.01).结论:P21的亚细胞定位,对HepG2细胞增殖影响具有明显差异.胞核P21抑制肿瘤生长,而胞质P21促进肿瘤生长.
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HBsAg基因启动子Ⅰ DNA结合蛋白1下调IL-18基因启动子
目的:研究HBsAg基因启动子I DNA结合蛋白1(SBP1)与白介素-18(IL-18)基因表达的关系,研究SBP1在HBV致病的分子生物学机制中的作用.方法:构建质粒pcDNA3.1(-)-SBP1,pCAT3-IL-18,转染HepG2细胞进行表达,应用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1和pCAT3-IL-18P共转染的HepG2细胞的pCAT表达活性是pCAT3空载体的0.37倍,是转染pCAT3-IL-18P的0.17倍,抑制率达到86.32%.结论:SBP1可以下调IL-18启动子的活性,抑制IL-18基因的表达.
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鼠CD40配体基因的克隆及表达
目的:克隆和在真核细胞中表达鼠CD40配体(mCD40L)基因,为进一步研究打下基础.方法:用RT-PCR法扩增mCD40L基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,重组质粒用脂质体转染H22细胞,G418筛选抗性细胞,用RT-PCR检测目的基因的插入,间接免疫荧光检测目的基因的表达.结果:含mCD40L基因重组表达质粒用酶切分析和序列测定进行鉴定后,转染H22细胞经G418筛选获得抗性细胞,经RT-PCR鉴定有含目的基因,间接免疫荧光鉴定有mCD40L的表达.结论:成功克隆mCD40 L基因并在真核细胞得到有效表达.
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携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌在大鼠胃溃疡治疗中的组织分布
目的: 阐明携带肝细胞生长因子(HGF)基因的减毒沙门氏菌在大鼠胃溃疡治疗中的组织分布规律,为HGF在胃溃疡基因治疗中的实际应用提供依据.方法:乙酸诱发80只大鼠胃溃疡模型,随机分成2组:HGF灌胃组(40只)和绿色荧光蛋白(GFP)灌胃组(40只).将携带HGF和GFP基因真核表达质粒的减毒沙门氏茵分别给予大鼠灌胃,每只0.2mL,隔日1次,共3次.GFP灌胃组第1、3、5、7、9天分别处死大鼠3只,取胃、肠、肝、脾及肾组织制备成冰冻切片,荧光显微镜下观察目的基因组织分布;HGF灌胃组第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天分别处死大鼠3只.ELISA方法检测HGF在各组织中的表达;PCR方法检测真核表达载体在组织中的分布.结果:GFP组大鼠在荧光显微镜下观察到胃、肠组织有较强的荧光,在肝、脾、肾组织有微弱的荧光,荧光强度在第5、7天达到峰值;HGF组大鼠胃、肝、脾、肾、大肠、小肠组织,均检测到有HGF表达,但胃、肠组织中表达较高;大鼠胃、肝、脾、肾、大肠、小肠均可检测到真核表达载体的启动子CMV片段.结论:在大鼠胃溃疡治疗中,减毒沙门氏茵作为细胞载体以po方式可将携带目的基因的真核表达载体相对靶向性转入胃、肠组织中.
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组织因子途径抑制物2对胰腺癌细胞浸润能力的影响
目的:探讨TFPI-2表达与胰腺癌细胞体外和体内浸润能力之间的关系.方法:脂质体介导人类TFPI-2真核表达载体pBos-Citeneo/TFPI-2转染胰腺癌细胞系Panc-1,G418筛选阳性细胞,RT-PCR,Western blot技术检测转染前后胰腺癌细胞中TFPI-2 mRNA以及相应蛋白质的表达水平;利用Boyden小室检测转染前后胰腺癌细胞穿膜的细胞数,比较转染前后胰腺癌细胞的裸鼠成瘤大小,以此作为评价胰腺癌细胞体外和体内浸润能力的指标.结果:转染成功的胰腺癌细胞证实有TFPI-2 mRNA和相应蛋白质的表达;与未转染的细胞相比,转染TFPI-2的细胞体外浸润能力显著下降(穿膜细胞数为60.7±7.6,109.7±5.5和110.7±9.0,P<0.001);3 wk后裸鼠成瘤明显缩小(0.39 cm×0.36 cm,0.56 cm×0.50 cm和0.60 cm×0.52 cm,P<0.001),病理切片亦证实没有肌层浸润现象.结论:TFPI-2表达可显著抑制胰腺癌细胞的体外和体内浸润能力,为进一步开展胰腺癌的基因治疗提供实验依据.
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PcDNA3.1(+)-MCP-1和PcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα.方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro DNA疫苗奠定了基础.
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HBeAg结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆化
目的:克隆HBeAg结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能.方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-Teasy载体进行TA克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质,蛋白质结构和功能.结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因,命名为HBeBP4A.利用生物信息学分析推定其ORF为1104个核苷酸(nt),编码产物为367个氨基酸残基(aa).结论:发现了HBeAg结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pcDNATM3.1/myc-HisA真核表达载体.
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小鼠甲胎蛋白基因的克隆表达鉴定及稳定表达甲胎蛋白的小鼠肿瘤细胞株的建立
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(AFP)基因并进行表达鉴定,构建小鼠AFP真核表达载体并建立稳定表达甲胎蛋白的小鼠肿瘤细胞株.方法:从Hepa1-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,克隆出小鼠AFP基因,亚克隆于pcDNA3.1中构建真核表达载体pmAFP,进行酶切、测序和表达鉴定,pmAFP稳定转染EL-4细胞建立EL-4(mAFP)细胞株,RT-PCR检测EL-4(mAFP)细胞mAFP mRNA的表达,Western blot检测mAFP蛋白表达,将EL-4(mAFP)细胞种植于6只小鼠背部皮下观察成瘤情况.结果:RT-PCR成功克隆出小鼠AFP基因,酶切、测序和表达鉴定证实真核表达载体pmAFP构建成功,RT-PCR及Western blot检测证实EL-4(mAFP)细胞中有mAFP mRNA及蛋白的表达,5只小鼠背部皮下种植处有肿瘤形成,22 d肿瘤体积为2 279.97±235.13 mm3.结论:小鼠mAFP基因克隆成功,真核表达载体构建成功,建立的EL-4(mAFP)细胞株能有效表达小鼠甲胎蛋白,在小鼠体内成瘤性良好.
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核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用
目的:构建HBV核心启动子及NPIP的重组载体,研究NPIP对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及NPIP的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和NPIP基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在NPIP的影响下,其活性有降低3-4倍.通过体内实验证明NPIP可以下调HBV核心启动子的表达.结论:NPIP明显降低HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的线索.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选
目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因.方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低.结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究
目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因
目的:应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因.方法:构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP13,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP13后,有86条差异基因表达,其中46条基因表达增强,40条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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乙型肝炎病毒X蛋白上调前-X基因启动子表达活性
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)对前-X基因启动子的调节作用,研究HBxAg在HBV致病的分子生物学机制中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV前X基因启动子,以T-A克隆法,将前-X基因启动子(promoter)的基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pGEMT-前-X-promoter与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切后构建前-X启动子报告基因表达载体pCAT3-前-X-promoter,以重组表达质粒pCAT3-前-X-promoter分别与pcDNA3.1空载体和HBxAg表达载体pcDNA-HBxAg瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HBxAg对前X基因启动子的调节作用.结果:构建的报告载体pCAT3-前-X-promoter经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-X和pCAT3-前-X-promoter共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3启动子的3.12倍,是pCAT3-前-X-pro-moter的2.65倍,是pCAT3-3.1空载体和pCAT3-前-X-promoter共转染的2.28倍.结论:HBxAg可以上调乙型肝炎病毒基因组中前-X基因启动子的活性.
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应用表达谱芯片技术筛选HBcAg反式调节基因
目的:筛选与克隆HBcAg激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg,以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HBcAg表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg经酶切鉴定和DNA测序鉴定正确.经基因表达谱芯片分析,29种基因的表达水平上调,17种基因的表达水平下调.结论:筛选到一些与细胞内信号传导、免疫调节、细胞凋亡、蛋白质翻译合成、肿瘤发生相关的HBcAg反式调节的靶基因.
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MTS1真核表达载体的构建和鉴定
多肿瘤抑制基因(MTS1)表达产物P16蛋白作为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制物,使Rb蛋白磷酸化受阻,细胞不能由G1期进入S期,进而抑制细胞分裂增殖.为进一步开展消化道肿瘤防治研究,我们构建了MTS1真核表达载体,现报告如下.
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基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP11反式调节基因
目的:应用基因芯片技术研究未知功能基因NS5ATP11的表达对于肝细胞基因表达谱的影响.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RTPCR)扩增出NS5ATP11编码区DNA,常规分子生物学技术构建NS5ATP11的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP11,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,NS5ATP11的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:证实构建pcDNA3.1(-)-NS5ATP11在HepG2细胞中表达正确.NS5ATP11重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达改变进行分析.结果表明,8种基因的表达水平上调,10种基因的表达水平下调.结论:NS5ATP11对于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解NS5ATP11对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
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基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能.方法:设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析.结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.
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抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响
目的:探讨抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞的抑制作用.方法:利用脂质体介导法将真核表达载体pcDNA3.1/MycHis(+)C-p27Kip1基因导入肝癌细胞株HHCC细胞中,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,用MTT、3H-TdR掺入法和克隆形成实验观察抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响,电子显微镜技术探讨过表达的p27Kip1抑制肝癌细胞生长的可能机制.结果:抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成均有明显抑制作用,抑制率达56%(P<0.01 vs 转染空载体组),电镜结果显示肝癌细胞发生凋亡.结论:抑癌基因p27Kip1可能通过诱导肝癌细胞凋亡抑制肝癌细胞生长.