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卡波西肉瘤相关疱疹病毒编码vFLIP基因真核表达载体的构建
目的 构建卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,vFLIP)真核表达载体,并转染入293T细胞中进行表达鉴定.方法 据GenBank中KSHV编码vFLIP基因核苷酸序列人工化学合成“vFLIP”的碱基序列,在5'端下添加XhoI酶切位点,3'端添加BamHI酶切位点,合成的碱基序列经酶切克隆进真核载体GV144,经双酶切和测序验证,成功构建G-vFLIP真核表达载体,将该质粒转染293T细胞,通过转染后细胞内荧光蛋白的表达和实时荧光定量PCR鉴定转染后KSHV-vFLIP在胞内的表达.结果 通过对构建质粒限制性内切酶产物进行基因测序证实成功构建了携带vFLIP基因的真核表达载体G-vFLIP,G-vFLIP真核表达载体转染293T细胞,24 h后在荧光显微镜可观察到细胞表达绿色荧光,提取细胞总RNA进行逆转录,293T细胞中GvFLIP组vFLIP mRNA的表达水平是GV144组的9 355 080.705倍(P＜0.05).结论 成功构建了KSHV-vFLIP真核表达载体,转染后在293T细胞中初步获得表达.
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携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的构建方法研究
目的 提高构建携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的成功率.方法 通过理论研究结合实验操作经验.结果 利用该方法可以高效率的成功构建真核表达载体.结论 文章提出的方法简便、通用、高效,可以解决重组DNA载体构建技术中的一系列关键问题,为相关研究提供了必要的理论和技术支持.
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人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达
目的 构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP/Survivin,并转染K562细胞.方法 以pDNR/Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定.采用Superfect转染试剂转染K562细胞.提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达.结果 经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达.结论 pIRES2-EGFP/Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达.
关键词： Survivin基因 真核表达载体 转染 K562细胞 -
人类前列腺凋亡反应因子4基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达
目的 构建带有绿色荧光蛋白的人类前列腺凋亡反应因子4(Par-4)基因真核表达载体pIRES2-EGFP/Par-4,并转染K562细胞.方法 以pDNR/Par-4质粒为模板,PCR扩增Par-4基因,T-A克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定.采用Superfect转染试剂转染K562细胞.提取细胞总蛋白,Western blotting柃测Par-4表达.结果 经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/Par-4载体序列止确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,Western blotting 证实转染细胞中存在Par-4蛋白的表达.结论 pIRES2-EGFP/Par-4表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达.
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突变型自杀基因HSV1-sr39tk真核表达载体的构建与鉴定
目的克隆突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV1-sr39tk并构建其真核表达载体.方法通过PCR扩增HSV1-sr39tk基因,用BamH Ⅰ和BglⅡ双酶切纯化的PCR产物,在T4DNA连接酶作用下于室温将其连接于经BamH Ⅰ单酶切的慢病毒载体转移质粒pTK151上,重组质粒经Pst Ⅰ酶切及测序鉴定.结果阳性重组质粒酶切及测序鉴定与预期结果完全相符.结论成功克隆出突变型自杀基因HSV1-sr39tk,并成功构建其真核表达载体.
关键词： 突变型自杀基因HSV1-sr39tk 真核表达载体 -
哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达
目的:构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料.方法:从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体；扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体；后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析.结果:RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列；CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体；运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白.结论:成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白.
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CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定
目的:构建C-末端结合蛋白-1(CtBP1)基因RNA干扰(RNAi)的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+),初步鉴定其干扰效果.方法:以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白(EGFP)基因、卡那霉素(Kanr)抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DHSa菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM 2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+),在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果.结果:构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA(pGenesil-1-CtBP1-shRNA),经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1(ADR+/+)细胞表达绿色荧光蛋白(EGFP),证实重组质粒己转染人细胞,转染效率达到60%～70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1(ADR+/+)细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义(P均<0.05).结论:成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1(ADR+/+)细胞上CtBP1基因表达.为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础.
