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hBMP-2真核正反义表达载体的构建及鉴定
0 引言人骨形成蛋白-2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP-2)具有显著的诱骨功能,此外有研究[1]表明,它在胚胎发育、神经胶质细胞发育及诱导细胞凋亡方面也起着重要作用. 新研究[2～4]证明它对生物体的抗辐射及造血功能也有重要意义. 国外许多学者对BMP诱骨作用机理进行了初步探讨,而hBMP-2在造血作用机理方面的研究较少,鉴于此,我们以pcDNA3为载体,构建了hBMP-2的真核表达载体pcD-B2. 同时我们还得到了hBMP-2反义表达载体pcD-AnB2,为进一步研究hBMP-2的作用机理,尤其是其在造血以及抗放射病方面的作用机理创造了条件.
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9.1C3胞内抗体基因的克隆及其对9.1C3分 子表达的抑制作用
[欧阳为明，金伯泉，夏海滨，刘 飞，李德敏，张建平. 中华微生物学和免疫学 杂志，2001;21(1):58-61] 目的 获得9.1C3胞内抗体基因的真核表达载体，观察胞内抗体对9.1C3分子表 达的抑制作 用，为进一步研究9.1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础. 方法 设计引 物，以9.1C3 ScF v基因为模板进行PCR扩增，引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标 记的Etag序列. 回收纯化PCR产物，酶切后连接到pUC19载体上，并进行序列测定. 序列正确 后 切下胞内抗体基因片段，重组到真核表达载体pRc/CMV中，酶切鉴定后用DEAE-dextran方法 瞬时转染真核细胞COS7，用胞内染色和Westem blot 方法检测胞内抗体的表达. 接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入9.1C3阳性的Jurkat细 胞，用FCM观察胞内抗体对9.1C3分子表达的影响. 结果 DNA序列测定证明 ，通过PCR成功地 为9.1C3 ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E-tag序列，成功地构建了胞内抗体 真核表达载体，通过胞内染色方法和Westem blot证明胞内抗体在COS7中得到表达. 转入Jur kat细胞后发现胞内抗体能下调9.1C3分子的表达水平. 结论 以9.1C3 ScF v基因为模板PCR扩增得到9.1C3胞内抗体基因，并构建了真核表达载体.(井晓梅)
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两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)包膜基因E1E2，对核心基因C DNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用. 方法 构建包含HCV C或CE1E2基因片段的真核表达载体pHCV-C和pHCV-CE1E2，分别接种于BALB/c小鼠股四头肌(以空载体pcDNA3作为对照)，每间 隔2 wk加强免疫1次. 用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCV C特异性抗体的产生. 以pHCV-C转染并表达HCcAg的Sp2/0细胞为靶细胞，采用51Cr释放试验检测特异性CTL的杀伤作用. 结果 两个实验组免疫的20只小鼠均产生抗HCV C特异性抗体，当效/靶细胞比例为100∶1时，CTL的杀伤率均明显高于对照组(P<0.01)；而pHCV-CE1E2与pHCV-C组之间，无论是抗HCV C抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异(P>0.05). 结论 E1E2基因的加入，并没有增加HCV C基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用.(潘伯荣)
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人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立
目的 构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达.结果 构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础.
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人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建
目的 通过生物技术获得促甲状腺激素受体膜外区表达载体,为TSHR膜外区的研究提供有力工具.方法 从人甲状腺组织中提取总RNA,RT-PCR分离得到TSHR膜外区cDNA,双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(+).结果 经酶切鉴定、测序分析表明TSHR膜外区片段与GenBank提供的完全相同.结论 成功构建了人TSHR膜外区真核表达载体.
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先天性长QT综合征相关人类HERG基因真核表达载体的构建及其功能表达
目的 构建先天性长QT综合征相关HERG基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,建立稳定的细胞系,探讨基因的功能.方法 原核克隆载体pGEM-HERG经限制性内切酶获得HERG cDNA,将HERG cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3中,用Lipofectamin2000转染试剂介导将pcDNA3-HERG及荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染至HEK-293细胞,利用G-418进行细胞筛选,并用稀释法建立稳定的HEK-HERG细胞系.用全细胞膜片钳技术检测HERG基因的功能表达情况.结果 在原核克隆载体pGEM-HERG的基础上构建了HERG的真核表达载体pcDNA3-HERG,并使其在HEK-293细胞中成功表达,建立的HEK-HERG细胞系稳定传代.膜片钳技术检测到了HERG通道电流的表达.结论 该方法可成功构建及表达HERG的真核表达载体,为今后突变型HERG的研究奠定了基础.
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反义HSP70真核表达载体的构建和在人喉癌细胞的表达
目的进行促凋亡治疗喉癌实验,构建和鉴定携带反义HSP70(heat shock protein 70)基因的真核表达载体.方法将HSP70 cDNA反向克隆入pcDNA 3.1,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AHSP70,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人喉表皮样癌细胞Hep-2,G418筛选阳性克隆;western blot和免疫组化检测转染前后瘤细胞的HSP70的表达.检测转染前后瘤细胞的生物学性状.结果获得pcDNA-AHSP70真核表达载体,HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70.转染反义HSP70的真核表达载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有.结论本研究成功构建了反义HSP70真核表达载体并在人喉癌细胞得以表达.
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hGPx-1-198Leu真核表达载体的构建与鉴定及在H9C2细胞中的表达
目的 构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据.方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,通过限制性内切酶酶切目的 片段和真核表达载体pEGFP-N3,再用T4 DNA连接酶将含有目的 基因的片段定向插入到载体pEGFP-N3真核人巨细胞病毒启动子下游.连接产物转化至DH5α中.挑取克隆、提取质粒进行鉴定.将hGPx-1-198Leu真核表达载体转染HEK293细胞,观察转染效率,并采用RT-PCR检测转染重组载体后细胞中GPx-1的mRNA表达水平.重组载体转染H9C2细胞,观察补硒之后的GPx-1表达情况.结果 获得目的 基因cDNA片段全长869bp,PCR和测序鉴定载体中含有人GPx-1-198Leu基因cDNA.重组载体转染HEK293细胞后检测到GPx-1的mRNA水平比未转染组及空质粒转染组明显升高,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制奠定了基础.H9C2细胞在转染后GPx-1蛋白水平升高并且随着硒浓度的升高而升高.结论 成功构建了含Pro198Leu多态位点的hGPx-1真核表达载体,并且也插入了保证该基因有效表达的硒代半胱氨酸插入序列.
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pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定
目的 构建pEGFP-Nl-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础.方法 以pMD19 Simple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFα CDS区片段,将PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFa的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接.连接产物转化至DH5α中.挑取克隆,提质粒,进行鉴定.结果 PCR扩增片段、双酶切出现722 bp大小的目的基因条带与预期结果相符；插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致.结论 成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础.
关键词： 肿瘤坏死因子 真核表达载体 质粒pEGFP-N1 基因疗法 CIK细胞 -
ASM 真核表达载体的构建与鉴定
目的：构建含有酸性鞘磷脂酶（Acid sphingomyelinase ，ASM ）融合基因片段的质粒，并在真核细胞中表达、鉴定。方法：由人淋巴结cDNA 文库中扩增基因片段，将ASM 基因插入真核表达载体pEGFP-N1中，获得融合基因构建真核表达载体ASM-pEGFP-N1。以其瞬时转染He-la细胞，应用免疫印迹与流式细胞术检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达。结果：正确获得A S M融合基因，DNA序列分析表明所构建的含ASM 融合基因的质粒与设计相同，融合蛋白与绿色荧光蛋白均正确表达。结论：成功构建了含有ASM 融合基因的真核表达载体，并在真核细胞中正确表达，为进一步研究肿瘤与ASM 表达之间的关系奠定了基础。
关键词： 消化系统肿瘤/病理学 鞘磷脂磷酸二酯酶/代谢 真核表达载体 -
真核表达载体pIRES2-EGFP-p93的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达
目的:构建肿瘤抑制基因DOC-2的真核表达载体pIRES2-EGFP-p93,将其转入人源性卵巢癌细胞株HO-8910中,并得到稳定表达.方法:利用XhoI酶切含有p93cDNA 的质粒得到p93cDNA基因片段,将其正向连接入真核表达载体pIRES2-EGFP,并通过酶切鉴定.用脂质体介导的方法,将真核表达载体pIRES2- EGFP-p93 转染人卵巢癌细胞系HO-8910,通过G418筛选稳定表达克隆;分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察人DOC-2蛋白在卵巢癌细胞系HO-8910中的表达.结果:构建了DOC-2的真核表达载体pIRES2-EGFP-p93,并通过酶切鉴定.在荧光显微镜下,转染了pIRES2-EGFP-p93的人卵巢癌细胞HO-8910发出绿色荧光,荧光全部集中于胞浆内.免疫细胞化学染色结果显示转染了pIRES2-EGFP-p93的人卵巢癌细胞HO-8910胞浆呈棕黄色,而转染空载体的细胞呈阴性染色.结论:成功构建了真核表达载体转染了pIRES2-EGFP-p93,并在人卵巢癌细胞系HO-8910中稳定表达,为研究DOC-2蛋白对卵巢癌细胞的作用奠定了基础.
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抑癌基因p27真核细胞表达质粒的构建
目的:构建抑癌基因p27真核细胞表达质粒,为研究p27在创面修复及瘢痕形成中的分子机制提供物质基础.方法:PCR法从含有p27全长的质粒中合成p27 cDNA片段, 连接酶连接至pUC19质粒测序,证明PCR产物序列完全正确,限制性酶切pUC19-p27,获得p27 cDNA片段,连接酶连接至pcDNA3,克隆出真核表达质粒pcDNA3-p27.结果:PCR合成p27 cDNA片段序列正确,凝胶电泳证明已将p27 cDNA片段正确克隆到pcDNA3-p27中.结论:成功构建了抑癌基因p27的真核表达载体pcDNA3-p27.
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Fas／APO－1基因真核表达质粒的构建
目的：构建凋亡信号受体Fas／APO－1基因真核表达质粒，为进一步研究Fas／APO－1在肿瘤细胞凋亡中的作用提供物质基础。方法：将质粒pBluscript-Fas cDNA酶切后，回收DNA片段并提纯；用连接酶连接到真核表达载体pBK-CMV内，克隆出重组基因载体pBK-Fas cDNA。结果：原始质粒pBluscript-Fas cDNA及重组质粒pBK-Fas cDNA酶切后，凝胶电泳鉴定均含有大小正确的Fas／APO－1碱基片段。结论：本实验成功地构建了Fas／APO－1基因的真核表达质粒。
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载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A的表达及其DNA去甲基化功能鉴定
目的 真核细胞内,DNA甲基化调控在转座子沉默、基因表达调控、甚至病毒感染过程中起关键作用,其中HIV-1启动子的甲基化修饰在病毒潜伏感染中扮演重要角色.为明确载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A (APOBEC3A,A3A)对HIV-1启动子5'LTR上CpG岛甲基化程度的调节作用,本研究构建并筛选出A3A异构体A3A Isotype a(A3A-a)和A3A Isotype b(A3A-b)高表达真核载体,分析其去甲基化功能.方法 从THP-1细胞mRNA中扩增得到A3A-a和A3A-b的cDNA,分别克隆至真核表达载体pASIB-HA和pCAGGS-HA.转染HEK-293T细胞,蛋白印迹法检测A3A-a和A3A-b的蛋白表达,并筛选出A3A-a和A3A-b的高表达载体.接着将A3A-a和A3A-b高表达载体与实验室构建并修饰的HIV-1启动子甲基化载体p-meLTR-EGFP共转染HEK-293T,检测指示蛋白EGFP在细胞水平中的表达,评价A3A-a和A3A-b的去甲基化调节作用.结果 PCR结果、酶切鉴定和测序结果均表明A3A真核表达载体pASIB-HA-A3A1-a、pCAGGS-HA-A3A2-a、pASIB-HA-A3A1-b、pCAGGS-HA-A3A2-b构建成功.经过筛选,pCAGGS-HA-A3A2-a和pCAGGS-HA-A3A2-b中A3A蛋白表达量高,并用于后续实验.甲基化载体共转染实验显示,相较于对照A3G转染组,A3A-a和A3A-b组中EGFP的表达量明显上调.结论 本研究在细胞水平上证实A3A分子Isotype a和Isotype b均可识别DNA中5-甲基化胞嘧啶,催化HIV-1启动子CpG岛去甲基化,为后续研究A3A对HIV潜伏感染调控奠定了基础.
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小鼠Akt基因真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建含有小鼠Akt基因以及绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pDoubleEx-EGFP-Akt1.方法 以小鼠卵巢RNA为模板,通过RT-PCR扩增Akt,并将其克隆到pDoubleEx-EGFP载体中.通过酶切和测序鉴定,构建真核表达载体pDoubleEx-EGFP-Akt1.之后转染人卵巢癌上皮细胞SKOV-3.结果 经测序鉴定,构建的Akt基因序列与野生型Akt序列完全相符.将pDoubleEx-EGFP-Akt1转染进入人卵巢癌上皮细胞SKOV-3,观察到稳定转染后的细胞有明显绿色荧光蛋白表达.结论 成功构建含有小鼠Akt基因的真核表达载体pDoubleEx-EGFP-Akt1,为进一步研究Akt基因的功能提供初步的实验基础.
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反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响
目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性的影响.方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列,将该片段分别正向和反向插入PEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分(hTR)基因正、反义真核表达载体,随后采用脂质体转染法将该正、反义载体转染入人胃癌细胞株MKN-45,用TRAP法观察后者端粒酶活性的改变.结果所克隆的基因片段其碱基序列与文献报导完全一致,且插入载体的方向完全正确.与正常对照、转染正义载体、空载体者比较,转染反义载体者端粒酶活性显著下降.结论本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体,而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性.
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小鼠微小RNA miR-21真核表达载体构建及其在293细胞的活性表达
目的：构建小鼠微小RNA miR-21的真核表达载体,在人胚肾293细胞中验证其活性表达,为进一步以此载体研究miR-21的功能打下基础。方法根据小鼠miR-21的成熟序列及其上下游约170 bp的序列设计引物,利用PCR技术从小鼠基因组DNA扩增含有miR-21前体的片段382 bp,克隆到质粒pRc/CMV,对重组质粒经双酶切及测序分析,鉴定完全正确后转染人胚肾293细胞,G418(1000 mg/L)筛选后获得miR-21稳定表达细胞系, Northern blot验证其在293细胞的过表达；同时构建pmiR-21-Luc reporter荧光素酶报告质粒,与miR-21重组质粒共转染293细胞进行荧光素酶活性分析,验证其调控活性。结果成功构建小鼠miR-21的真核表达载体,其可以在293细胞中稳定高效表达,荧光素酶活性实验证实其有生物活性。结论成功构建小鼠miR-21的真核表达载体,为进一步探讨miR-21的生物学功能奠定了实验基础。
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人HoxA10基因真核表达载体构建和表达产物的鉴定
目的:克隆人子宫内膜容受性标志分子HoxA 10基因的cDNA,转入真核细胞载体,并在293T细胞中进行表达和鉴定.方法:应用RT-PCR法从人子宫内膜组织中扩增HoxA10基因的cDNA编码区序列,将PCR产物克隆至pCMV-HA真核表达载体中,测序鉴定该载体.以LipofectamineTM2000将该载体转染入293T细胞中,Western blotting检测HoxA10蛋白的表达.结果:PCR扩增出的人HoxA10基因cDNA正确克隆到了pCMV-HA载体,成功构建了pCMV-HA-HoxA10重组载体;将其转染入293T细胞,用HoxA10和HA抗体进行Westem blotting,均检测到了融合蛋白的表达.结论:携带有HA蛋白标签的人HoxA10基因的真核表达载体pCMV-HA-HoxA 10克隆及表达成功,为进一步研究HoxA10与其它蛋白质的相互作用以及建立HoxA10的荧光素酶报告基因分析系统奠定了基础.
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靶向人类白细胞抗原G1(HLA-G1)的siRNA真核表达载体的构建及表达
目的:构建靶向人类白细胞抗原G1(HLA-G1)的小干扰NA(siRNA)真核表达载体(pSUPERHLA-G1),并检测其在滋养细胞系HTR-8/SVneo中的敲减效率.方法:将设计的HLA-G1 siRNA寡聚脱氧核苷酸链与真核表达载体pSUPER连接,构建重组pSUPER-HLA-G1真核表达载体,并用脂质体法将其转染入HTR-8/SVneo细胞系中.pSUPER-HLA-G1质粒转染后采用RT-PCR检测HLA-G1在HTR-8/SVneo细胞中的基因转录情况,Western blotting检测HLA-G1蛋白的表达情况.结果:构建的真核表达载体pSUPER-HLA-G1可在HTR-8/SVneo细胞中表达,HLA-G1 mRNA和其蛋白表达抑制率分别为74.85±7.43％和71.07±6.11％.结论:构建的人HLA-G1 siRNA蛋白真核表达载体pSUPER-HLA-G1有效地沉默了HLA-G1在HTR-8/SVneo滋养细胞中的基因表达及蛋白表达,为今后以HLA-G1为靶点的基因研究奠定了基础.
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CD59与CD3在T细胞活化信号转导中的协同作用
目的 前期构建的真核表达载体pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi在Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD3分子在T细胞活化信号转导中的相互作用,进一步探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制.方法 酶切鉴定构建的pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi；脂质体法将两种载体分别转染Jurkat细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞系；RT-PCR技术检测转染后CD59和CD3ζ在mRNA水平的表达抑制效果；采用噻唑蓝比色法检测转染前后各组Jurkat细胞的增殖效应,Western Blot技术检测各组细胞ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平,激光共聚焦扫描显微镜检测各组细胞内Ca2+变化,ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素2(IL-2)的变化.结果 重组载体转染后RT-PCR结果表明,转染pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi质粒的细胞组CD3ζ分子和CD59分子的表达分别受到抑制.转染干扰质粒的细胞组细胞增殖能力、ZAP-70酪氨酸磷酸化水平、Ca2+浓度及IL-2水平均明显低于未转染组和空质粒组,差异有显著性(F=96.13～328.60,q=6.27～32.664,P＜0.01).结论 CD59和CD3在T细胞活化信号转导中具有协同作用.
