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蓝氏贾第鞭毛虫基因快速标记载体的构建
目的 构建可快速标记蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)基因的重组载体.方法 采用重叠PCR法将新霉素(Neo)基因置于gdh启动子调控下,并插入pGEM-5zf载体,获得带有Neo筛选标记的重组载体pGL gdh-Neo;并将基因合成所得3'末端带有3×HA标签的多克隆位点区克隆至重组载体pGLgdh-Neo,构建可快速标记贾第虫基因的重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo.以该载体标记贾第虫H2A基因验证其可用性.PCR扩增组蛋白H2A基因序列,用EcoR Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切后克隆至重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo多克隆位点区.重组质粒线性化后转染虫体,并对G418筛选所获得的H2A贾第虫重组株进行基因组PCR、蛋白质印迹(Western blotting)和免疫荧光分析.结果 构建了带有多克隆位点区和3×HA标签的可快速标记贾第虫基因的重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo,其长度为4260 bp; H2A重组质粒稳定转染至贾第虫滋养体并正确整合至其基因组,可表达相对分子质量(Mr)为16900的H2A(含3×HA标签).结论 构建了可快速标记贾第虫基因的重组载体pGL MCS-3 HA-gdh-Neo.
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人HoxA10基因真核表达载体构建和表达产物的鉴定
目的:克隆人子宫内膜容受性标志分子HoxA 10基因的cDNA,转入真核细胞载体,并在293T细胞中进行表达和鉴定.方法:应用RT-PCR法从人子宫内膜组织中扩增HoxA10基因的cDNA编码区序列,将PCR产物克隆至pCMV-HA真核表达载体中,测序鉴定该载体.以LipofectamineTM2000将该载体转染入293T细胞中,Western blotting检测HoxA10蛋白的表达.结果:PCR扩增出的人HoxA10基因cDNA正确克隆到了pCMV-HA载体,成功构建了pCMV-HA-HoxA10重组载体;将其转染入293T细胞,用HoxA10和HA抗体进行Westem blotting,均检测到了融合蛋白的表达.结论:携带有HA蛋白标签的人HoxA10基因的真核表达载体pCMV-HA-HoxA 10克隆及表达成功,为进一步研究HoxA10与其它蛋白质的相互作用以及建立HoxA10的荧光素酶报告基因分析系统奠定了基础.
