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hCGβ-C3d3融合蛋白在乳酸杆菌的表达及鉴定
目的 探讨融合基因人绒毛膜促性腺激素(hCG)β-C3d3在干酪乳酸杆菌有效表达,为研究携hCGβ-C3d3融合基因的乳酸杆菌直接黏膜免疫奠定基础.方法 用分子生物学技术构建质粒pIlac.hCGβ-C3d3,电穿孔转化干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)CECT 5276,挑选转化后的耐药菌落,在含红霉素的MRS培养基中培养,0.5%乳糖诱导后,在不同时间取上清,化学发光法检测hCGβ,免疫细胞化学鉴定融合蛋白.结果 经测序证实目的基因构建正确.免疫化学发光测定显示,转化成功的重组干酪乳酸杆菌在乳糖的诱导下可分泌hCGβ.免疫细胞化学鉴定显示hCGβ与C3d3融合成功.结论 实现了重组乳酸杆菌Lb.hCGβ-C3d3分泌性表达融合蛋白hCGβ-C3d3.
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hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白在CHO细胞中的分泌性表达、鉴定与纯化
目的:构建带有6个组氨酸纯化标签的hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白的分泌型真核表达质粒,在CHO细胞中获得具有生物学活性的重组蛋白的高效表达.方法:利用高效真核表达载体phCMV1, 构建phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1-6His-hCGβ-C3d3,脂质体法转染CHO细胞,G418(800μg/ml)筛选抗性克隆.放射免疫法检测抗性克隆培液中hCGβ表达量,Western blotting和Raji细胞免疫化学法鉴定hCGβ-C3d3融合蛋白.用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物.结果:酶切及测序结果显示,phCMV1-6His-hCGβ及phCMV1-6His-hCGβ-C3d3构建正确.在CHO细胞中成功地获得了hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表达,phCMV1载体的表达效率是pcDNA3的1.6倍.表达产物经纯化后得到了所需的hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白.结论:hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白在CHO细胞的高效表达为下一步比较hCGβ抗原及hCGβ-C3d3融合蛋白免疫动物的体液免疫效应和抗生育效果奠定了基础.
