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人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用
目的克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA,并构建其真核表达载体,探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性.方法从KG-1a细胞提取总RNA,RT-PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定,构建其真核表达载体pcDNA3.1-CD34.选取4～6周龄的BALB/c小鼠12只,随机分为3组,预先在股四头肌注射25%的蔗糖溶液50μl,然后在相同部位分别注射PBS空白对照、PBS稀释的空载体pcDNA3.1以及PBS稀释的pcDNA3.1-CD34,每2周1次共3次.免疫结束后定期FACS检测鼠尾静脉血抗人CD34抗体产生情况.结果所扩增的人CD34抗原胞外区cDNA全长886bp,扩增片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道完全一致,并且在5′端引入HindⅢ酶切位点,3′端引入EcoRI酶切位点及终止密码TGA.随后将其定向插入真核表达载体pCDNA3.1中,称之为pcDNA3.1-CD34,经阳性克隆筛选、酶切鉴定证实pcDNA3.1-CD34真核表达载体构建成功.FACS检测结果表明,用pcDNA3.1-CD34真核表达载体免疫的小鼠中仅1/4只在免疫结束后的第2～6周有较低滴度的CD34抗体产生,其余3只血清中均未检测到CD34抗体.结论成功地构建了人CD34抗原胞外区cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-CD34,初步证明用其进行基因免疫制备CD34单克隆抗体是可行性的.
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MGr1-Ag表达上调及下调的胃癌细胞株的建立及鉴定
为研究胃癌细胞耐药相关新基因MGr1-Ag对胃癌耐药细胞多药耐药性的调节作用及其机制.克隆MGr1-Ag的全长cDNA并构建其正反义真核表达载体,以脂质体介导法将正、反义真核表达载体分别转染入人胃癌细胞系MGC803与人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR中.结果显示,经RT-PCR扩增出大小约为1.0 kb的基因片段,成功克隆入pUCm-T载体,经DNA测序证实为MGr1-Ag基因.将其克隆入pCDNA3.1/V5-His后,经限制性核酸内切酶酶切鉴定,获得携有MGr1-Ag基因真核表达载体pCDNA3.1/V5-His-MGr1-Ag及其反义表达载体pCDNA3.1/V5-His-anMGr1-Ag.以脂质体介导法将MGr1-Ag的正、反义真核表达载体分别转染入MGC803与SGC7901/VCR中,经Western blot证实,成功建立了MGr1-Ag表达上调及下调的胃癌细胞株,为研究MGr1-Ag参与耐药的分子机制奠定了基础.
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HBV信号肽区热点变异真核表达载体的构建及对HBeAg表达的影响
采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增HBV 的Pre-C/C片段（1814～2452），经酶切后连于EBO真核表达载体，利用定点突变技术分别对连接载体进行T1862，A1896，A1899，A1896+A1899点的定点诱变。经错配PCR-RFLP和测序分析，确定突变的克隆。将突变前后的质粒以脂质体转染法转染HepG2细胞，检测不同点突变后HBeAg表达的改变。突变前后的质粒转染HepG2细胞经稳定表达，结果未突变的EBO-PreC/C重组质粒HBeAg表达为强阳性，A1899突变的重组质粒HBeAg表达比未突变的重组质粒稍弱，而转染EBO空载体和T1862，A1896，A1896+A1899重组质粒突变体的细胞培养上清HBeAg均为阴性。上述突变体的构建将为体外研究前C信号肽区热点变异对HBeAg在细胞中表达及对肝炎病毒基因组复制的影响奠定基础。
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人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立
目的 构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR1的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础.
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MARCH1真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.
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生物素化标签真核表达载体的构建及其在蛋白检测中的应用
目的 构建生物素化标签真核表达载体,利用生物素化蛋白检测快速、灵敏、简便的特点,对传统的Western印迹和pull down技术进行改进和优化.方法 利用pCI neo载体骨架构建生物素化真核表达载体.将红色荧光蛋白插入表达载体,用辣根过氧化物酶标记的链亲和素对融合蛋白进行Western印迹检测;将萤火虫荧光素酶插入表达载体,利用pull down技术定量分析生物素化效率;将丙型肝炎病毒NS4B蛋白插入表达载体,通过pulldown技术研究丙型肝炎病毒NS4B蛋白的蛋白质问相互作用.结果 构建的生物素标签真核表达载体能使目的 蛋白生物素化.报告基因定量分析结果表明目的 蛋白生物素化效率达72%.将该载体表达的融合蛋白应用于Western印迹和pull down技术中可实现无需特异性抗体的一步法快速检测.结论 将生物素化标签真核表达载体用于Western印迹和pull down技术,建立了快速、灵敏、简便的融合蛋白质检测新方法,为生命科学领域提供了一种有利的研究工具和通用技术平台.
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IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究
目的:构建新型高效真核表达载体,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶(Iin-UK)在CHO细胞中的高表达.方法:利用常规分子生物学方法,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化,构建了一系列新型真核表达载体,以Iin-UK融合基因为目的基因,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力,然后挑选高表达的克隆,通过MTX加压扩增,以提高Iin-UK融合基因的拷贝数及表达水平.结果与讨论:构建了5种新型真核表达载体,并筛选出优化的真核表达载体,通过MTX加压扩增,实现了Iin-UK融合基因在CHO细胞中的高表达,表达量达到10 μg/(106细胞·24h ).
关键词： 真核表达载体 neo基因 CHO/dhfr-细胞 重组蛋白 高表达 -
arresten cDNA在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及活性鉴定
目的:构建arresten cDNA的分泌型真核表达载体,将其转染人胃癌SGC-7901细胞,探讨arresten体外抑制血管内皮细胞生长的活性.方法:利用PCR法将小鼠Ig κ链信号序列的60个碱基拼接至arresten cDNA的氨基端,并克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),然后以脂质体法将重组pcDNA3.1(+)-arresten转染SGC-7901细胞,Western印迹检测arresten的分泌表达,后,提取SGC-7901细胞培养上清,采用内皮细胞增殖抑制试验鉴定上清中arresten活性.结果:成功构建了arresten cDNA的分泌型真核表达载体,获得可表达arresten的SGC-7901细胞系,真核表达的arresten具有抑制血管内皮细胞增殖的活性.结论:arresten是一种有效的血管生成抑制剂,其cDNA的真核表达载体的成功构建为针对人类胃癌的arresten抗血管基因治疗研究奠定基础.
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具有靶向免疫抑制作用新型重组融合蛋白B7-2-PE40KDEL真核表达载体的构建及其生物效应
目的:构建B7-2-PE40KDEL的真核表达载体,探讨通过体内表达重组融合蛋白,特异性杀伤高表达CD28 T细胞,阻断B7∶CD28/CTLA4共刺激信号途径诱导免疫耐受的可能性.方法:以原核表达载体pRSETA-B7-2-PE40KDEL质粒为模板,采用PCR及酶切连接的方法构建真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDEL.利用RT-PCR、Western 印迹及ELISA法从mRNA、蛋白质水平检测了B7-2-PE40KDEL在RPE-CHO真核细胞中的表达情况.采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28 T细胞的生物活性进行测定.结果:成功构建了pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDEL真核表达载体,转染入RPE-CHO细胞后可转录翻译为重组融合毒素蛋白,相对分子质量约为71×103,平均106个转染细胞24 h表达0.23 μg/L.活性测定显示真核载体所表达的B7-2-PE40KDEL可特异性地抑制高表达CD28的人T淋巴细胞系,而对CD28阴性的人白血病细胞系的抑制率较低.结论:真核载体表达的B7-2-PE40KDEL具有良好的靶向性免疫抑制活性,为进一步开展其体内特异性防治移植排斥反应及自身免疫性疾病奠定了基础.
关键词： 重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 真核表达载体 免疫耐受 -
关键词：
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人胰岛素样生长因子-1真核表达质粒的构建及其在成肌细胞中的表达
目的:构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hIGF-1并通过转染成肌细胞来验证其生物活性.方法:应用DNA重组方法将编码hIGF-1 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/hIGF-1真核表达质粒;应用阳性脂质体介导的基因转染技术,将真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hIGF-1瞬时转染C2C12成肌细胞中;采用RT-PCR及免疫组化染色等方法检测hIGF-1基因在成肌细胞中的表达情况;应用MTT法检测转染后细胞上清液中hIGF-1的生物活性.结果:将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hIGF-1转染成肌细胞后,hIGF-1 mRNA及蛋白表达水平明显增高;转染后的成肌细胞培养上清液具有促使成纤维细胞增殖的生物活性.结论:成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hIGF-1,其转染成肌细胞后可获得较高水平hIGF-1蛋白的表达,所表达出hIGF-1蛋白具有生物学活性.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 真核表达载体 成肌细胞 -
人IκBαM对大鼠肝移植缺血再灌注损伤中TNF-α的影响
目的 探讨人核转录因子抑制旦白(IκBαM)对大鼠肝移植缺血再灌注损伤中TNF-α的影响.方法 将SD大鼠原位肝移植模型分4组:组Ⅰ为假手术组(行游离肝脏手术),组Ⅱ为空白对照组(行大鼠原位肝移植手术),组Ⅲ为PcDNA 3.0空载体转染组(移植前2d行人PcDNA 3.0转染供肝),组Ⅳ为PcDNA 3.0-IκBαM转染组(移植前2d行人PcDNA 3.0-IκBαM转染供肝).分别于术后2h、12h、24h、3d取材.应用免疫组化、ELISA测定肝组织和血清中TNF-α的表达,同时检测各时点肝脏酶学的变化.结果 PcDNA 3.0-IκBαM转染组与组Ⅱ、组Ⅲ相比:免疫组化示TNF-α于移植后12h的表达具有显著性差异;术后2h血清TNF-α具有显著性差异;肝脏受损指标(ALT)在各时点具有显著性差异,尤其在术后12h为显著(P＜0.05).各移植组与组Ⅰ差异显著(P＜0.05).结论 IκBαM通过抑制TNF-α的表达减轻大鼠肝移植缺血再灌注损伤.
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pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达
目的:摸索真核细胞翻译启动因子5A(eIF5A)编码基因的合成、pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达.方法:用PCR合成eIF5A基因,将基因分别接在克隆载体pMD 18-T的EcoR V多克隆位点上和真核表达载体pcDNA3.1的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ的多克隆位点之间,构建eIF5A基因的克隆载体和真核表达载体,分别在大肠杆菌E.coli DH5α中转化并提取质粒,将真核表达载体pcDNA3.1/eIF5A的质粒提取后,用脂质体包合并转染真核细胞CCRF-CEM,用流式细胞仪对eIF5A的表达水平进行检测.结果:eIF5A在CCRF-CEM细胞中的表达水平为107.03,eIF5A在转染细胞CCRF-CEM/trans中的表达水平为114.27,表达升高.结论:本实验构建了pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体,发现其在CCRF-CEM细胞中高表达.本实验结果将有助于探讨肿瘤治疗过程中的新靶标.
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preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达
目的 研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性.方法 依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物.从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+ HBsAg(1 ～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6 × His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1 ～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白.采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达.结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值.酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致.转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1 ～ HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致.结论 成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系.
关键词： 真核表达载体 pIRES2-EGFP 乙肝外膜蛋白 293细胞 -
mTEL-cFms激酶结构域融合蛋白真核表达载体的构建及其对信号转导和转录激活因子核转位的影响
目的 构建激酶盘真核表达载体,观察豆蔻酰化的TEL转录调节因子HLH结构域与c-Fms激酶结构域融合蛋白( mTEL-cFmskd)的表达对信号转导和转录激活因子1(STAT1)和STAT3核转位的影响.方法 利用DNA重组技术,将人的c-Src豆蔻酰化多肽、TEL转录调节因子HLH结构域、c-Fms激酶结构域以及c-Myc标签的DNA序列克隆在pCORON/neo载体上,构建pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc真核表达载体.将载体转染至稳定表达GFP-STAT1的人骨肉瘤细胞(U2OS)和稳定表达EGFP-STAT3的幼仓鼠肾细胞24 h后,采用IN Cell Analyzer1000获取细胞图像,分析细胞内GFP-STAT1或EGFP-STAT3融合蛋白的核转位程度.结果 质粒酶切和测序鉴定表明,构建的pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc真核表达载体序列正确.载体转染细胞24 h后,绿色荧光蛋白标记的STAT1和STAT3均进入细胞核,发生核转位现象.c-Fms激酶抑制剂GW2580和Sutent能抑制mTEL-cFmskd诱导EGFP-STAT3核转位的发生.结论 成功构建激酶盘真核表达载体pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc.载体在细胞中表达的mTEL-cFmskd豆蔻酰化融合蛋白具有M-CSF/c-Fms配体受体复合物激活下游信号分子的生物学功能.
关键词： 巨噬细胞集落刺激因子受体 真核表达载体 TEL 豆蔻酰化 信号转导和转录激活因子 核转位 激酶抑制剂 -
一种快速连接及筛选重组阳性克隆的简便方法
目前，生命科学的各个领域已深入到分子生物学水平，在将外源基因向质粒载体的克隆过程中，常规方法操作的步骤繁琐，花费时间长，若忽略一些细小因素可导致克隆失败。本实验室在长期的分子克隆工作中，积累了一些经验，建立了一种快速连接及筛选重组阳性克隆的简便方法。我们以紫杉烯合酶(taxadiene synthase，TS)基因向真核表达载体pIGF2中的克隆为例，报告如下，以供在条件简易情况下的工作者参考使用。
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丙型肝炎病毒NS3蛋白真核表达载体的构建及其基因免疫研究
基因免疫是指将编码特异抗原的目的基因重组表达载体直接接种到宿主组织内,在体内表达基因产物,进而激发宿主产生特异性免疫反应.自1990年首次报道发现基因免疫以来,这一新的免疫技术已经在基础免疫学研究和疫苗研制等许多领域得到广泛应用.对许多疾病(如流感)的基因免疫接种,可以产生抵御再次感染的保护性免疫反应[1].在小鼠体内接种HCV包膜蛋白和核心蛋白的重组质粒可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫反应[2～4].本研究中我们构建了HCV NS3区真核表达载体,对其基因免疫效果进行初步探讨.
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人源性Notch1跨膜段真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建人源性Notch1跨膜段(notch1 transmembrane domain,NTM)真核表达载体pcDNA3-NTM,并观察其在真核细胞中的表达.方法 通过反转录-聚合酶链反应从人胰腺癌细胞系BxPC3细胞中获得编码Notch1跨膜段的cDNA,定向克隆至C端带flag蛋白标签序列的真核表达载体pcDNA3中,经酶切和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内Notch1跨膜区的表达.结果 构建了真核表达载体pcDNA3-NTM,将其转染HeLa细胞48 h后,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Notch1跨膜段的表达显著增高.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3-NTM,为研究Notch信号的活化机制及其在胰腺癌发生发展中的作用奠定了基础.
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人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达
目的 研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础.方法 应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中.G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的peDNA3.1(+)阳性细胞克隆和末转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测.用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性.结果 Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符.细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染peDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性.结论 人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株.
关键词： 血管内皮细胞生长因子 真核表达载体 NIH3T3细胞系 基因表达 -
近交培育五指山小型猪GHR基因的克隆及其真核表达载体的构建
目的 探讨近交培育五指山猪矮小的分子机理,为五指山猪实验动物化奠定基础.方法 近交系五指山猪肝脏组织提取总RNA,然后RT-PCR成功扩增出GHR基因,克隆入pGEM-T easy载体进行测序,并与正常猪GHR基因序列进行比对;然后经Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切回收后与同样经过双酶切回收的pEGFP-C1真核表达载体连接,构建五指山猪GHR基因真核表达载体.结果 测序结果表明:五指山猪GHR基因编码区包括639个氨基酸;经过酶切和测序验证五指山猪GHR基因真核表达载体构建成功.结论 经序列比对后发现GHR信号肽编码区发生两处氨基酸替换,可能会影响到生长激素的胞内运输;生长激素受体胞内域编码区发生多处突变,并且导致相应氨基酸发生替换,可能会影响生长激素受体的下游信号转导.五指山猪GHR基因真核表达载体的成功构建为进一步研究GHR的功能和下游信号转导奠定了基础.
