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生物素化标签真核表达载体的构建及其在蛋白检测中的应用
目的 构建生物素化标签真核表达载体,利用生物素化蛋白检测快速、灵敏、简便的特点,对传统的Western印迹和pull down技术进行改进和优化.方法 利用pCI neo载体骨架构建生物素化真核表达载体.将红色荧光蛋白插入表达载体,用辣根过氧化物酶标记的链亲和素对融合蛋白进行Western印迹检测;将萤火虫荧光素酶插入表达载体,利用pull down技术定量分析生物素化效率;将丙型肝炎病毒NS4B蛋白插入表达载体,通过pulldown技术研究丙型肝炎病毒NS4B蛋白的蛋白质问相互作用.结果 构建的生物素标签真核表达载体能使目的 蛋白生物素化.报告基因定量分析结果表明目的 蛋白生物素化效率达72%.将该载体表达的融合蛋白应用于Western印迹和pull down技术中可实现无需特异性抗体的一步法快速检测.结论 将生物素化标签真核表达载体用于Western印迹和pull down技术,建立了快速、灵敏、简便的融合蛋白质检测新方法,为生命科学领域提供了一种有利的研究工具和通用技术平台.
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二步法预定位技术对荷人肝癌裸鼠模型的MR免疫成像研究
目的利用生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, BAS)的靶向定位效应和生物放大作用,提高MR分子免疫成像的敏感性.方法制备生物素化抗人肝癌细胞单克隆抗体HAb18并测定其生物素化程度及抗原结合活性.20只荷人肝细胞癌裸鼠分为3组,二步法预定位组8只,先静脉注射生物素化单克隆抗体600 μg,24 h后再给予钆喷替酸葡甲胺-链霉亲和素(Gd-DTPA-streptavidin, Gd-DTPA-SA);HAb18单克隆抗体-Gd-DTPA组6只,经尾静脉注射Gd-DTPA-HAb18;Gd-DTPA对照组6只,静脉注射Gd-DTPA.对实验动物行MR扫描,测量SE T1WI平扫及增强后10、30、60 min及3、6、12、24、48 h图像内肿瘤的信号强度,绘制信号强度-时间曲线,并计算肿瘤强化率及对比度噪声比(contrast-to -noise ratio,CNR ).结果 HAb18单克隆抗体经生物素化后,每个抗体分子平均可结合20个分子生物素,其抗原结合活性约为91%.二步法预定位组内,肿瘤信号强度缓慢升高,增强后第6小时,肿瘤的强化率、CNR达到大值,与其他两组相比较差异有统计学意义.48 h后,肿瘤的强化仍肉眼可辨.单克隆抗体组内,肿瘤表现为缓慢轻度强化,增强后24 h的强化率达13.5%,肿瘤信号强度、CNR与平扫比较差异均有统计学意义(P值均＜0.05).Gd-DTPA对照组内,肿瘤表现为快进快出特点的强化特点.结论二步法预定位技术对肿瘤有特异性增强作用和信号放大效应,可提高靶瘤内Gd+3的浓聚,优于抗体直接标记法,为单克隆抗体MR分子免疫显像提供了新途径.
