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不同类型HCV感染者外周血中CD4+ CD25high调节性T细胞的初步分析
文献表明,CD4+CD25 high调节性T细胞(T regulatory cells,Treg)异常与HCV和HBV的慢性感染有关[1],CD4+CD25 high Treg细胞能抑制自身抗原和外来抗原引起的免疫应答[2],对抗感染免疫、抗肿瘤免疫反应均具有明显的抑制作用[3-4].因此,我们分析CD4+CD25 high Treg细胞在不同类型HCV感染中的作用和意义,以明确其与丙型肝炎慢性化和病毒清除的关系.1 材料和方法1.1 对象:143例(男86,女57)不同类型的HCV感染者均选自2011年1月~2011年12月常州市第三人民医院住院及门诊病例,年龄(21～68)岁,平均(42.4±9.8)岁,诊断符合2004年中华医学会传染病和寄生虫病学分会、肝病学分会联合制订的丙型肝炎防治指南[5].患者血清抗-HCV阳性,排除HBV及HIV感染,所有患者排除甲型、乙型、丁型、戊型肝炎病毒及HIV感染,无自身免疫性疾病史,无嗜酒史,无肝毒性药物使用史,且6个月内均未接受抗病毒及免疫治疗,所有患者均为1b基因型.健康对照组32例(男18,女14),年龄(22~42)岁,肝炎病毒标志物及人类免疫缺陷病毒均为阴性,无饮酒及用过对肝有损伤性的药物史.
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抗核抗体谱的检测在自身免疫性疾病诊断中的价值
自身免疫性疾病是指人体免疫系统对自身成分产生免疫反应,导致自身组织损害的病理变化.一般情况下,人类对自身成分不产生免疫应答,但当身体抗原变性、损伤、移位及免疫功能失调,免疫耐受破坏,原发或继发性免疫缺陷或障碍和免疫识别紊乱时,会对自身抗原产生抗体,即自身抗体,从而造成免疫性病理损伤或功能障碍,引发自身免疫性疾病.
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自身抗原Ro/SSA抗原优势决定簇分析
目的:探讨自身抗原Ro/SSA(Mr=60 000)的抗原决定簇,为自身免疫性疾病机制的研究提供依据.方法:根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析,采用PCR法克隆自身抗原Ro/SSA(Mr=60 000)多肽片段的cDNA,定向插入表达载体PGEX-2T,并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白,用GST亲和层析柱进行纯化,经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应.结果:Ro/SSA(Mr=60 000)的抗原优势决定簇主要存在于100～190位和191～300位,不同患者、不同病程抗原优势决定簇有所不同.结论:抗原驱动机制在自身免疫性疾病的发病中起重要作用.
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自身抗原Ro-60 cDNA克隆构建及表达
目的:采用基因工程方法克隆并表达自身抗原Ro-60融合蛋白.方法:用PCR法克隆Ro-60多肽分子的cDNA,经测序证实后定向插入表达载体pGEX-2T,并经酶切电泳鉴定.进而导入大肠杆菌JM109中表达重组融合蛋白.结果:经蛋白印迹证实,重组融合蛋白具有Ro抗原性.结论:重组融合蛋白可用于对Ro抗原表位的精确定位,分析特定抗原表位与疾病的相关性及制备重组抗原用于临床检测.
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人胰岛素瘤相关蛋白-2基因的克隆及原核表达研究
目的克隆1型糖尿病自身抗原人胰岛素瘤相关蛋白-2(IA-2)的编码基因,并从大肠杆菌中表达具有免疫原性的人IA-2重组蛋白.方法抽提胎脑总RNA,通过RT-PCR获得编码IA-2胞内结构域的cDNA,与Pinpoint Xa-1T质粒相连接,构建表达型重组质粒,经转化、筛选并鉴定后,从大肠杆菌诱导表达生物素酰化融合蛋白,进而用亲和层析纯化之,以dot-blot鉴定其免疫原性.结果重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导表达及亲和层析后得到了纯度较高、分子量约为59kd的融合蛋白,表达产物用dot-blot证明具有免疫原性.结论原核表达的生物素酰化人IA-2胞内段融合蛋白具有正确的免疫学构象.
关键词： 1型糖尿病 胰岛素瘤相关蛋白-2 自身抗原 自身抗体 -
U1RNP70KD,Sm-D,SSB及β2GP1自身抗原的重组表达及临床研究
目的制备U1RNP70KD,Sm-D,SSB及β2GP1重组自身抗原,探讨自身免疫性疾病的机理及提高临床自身抗体检测的敏感性和特异性.方法应用逆转录PCR方法克隆β2GP1及其第5功能区(D5),U1RNP70KD及其U1RNA结合功能区(BD),Sm-D和SSB的编码基因,经原核表达系统(PGEX-2T)进行表达、鉴定及纯化,并分析β2GP1及U1RNP70KD抗原表位的定位,进而以重组抗原为基质建立新型免疫印迹及酶联免疫吸附检测法.结果成功表达纯化了上述重组抗原;定位研究显示β2GP1-D5及U1RNA-BD分别为β2GP1及U1RNP70KD的主要抗原表位区域;新型重组检测法的测定结果与常规检测系统比较基本相吻合.结论重组蛋白具有良好的特异性,可进一步作为抗原表位研究的手段,并可用于临床自身抗体检测.
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天疱疮的临床分型与诊断
天疱疮是一组大疱性皮肤和黏膜疾病,具有慢性、复发性和严重性等特点.临床表现为正常皮肤或黏膜表面出现松弛性水疱、大疱,尼氏征阳性.组织病理为棘层松解,表皮内可产生裂隙、水疱和棘松解细胞;真皮水肿,少数嗜酸性粒细胞或中性粒细胞浸润.天疱疮亦是一类自身免疫性疾病,患者血清中存在致病性的针对自身抗原的特异性抗体.
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类风湿关节炎新自身抗原:磷酸丙糖异构酶的初步研究
目的 寻找类风湿关节炎的疾病相关的新的自身抗原.方法 从已知的类风湿关节炎滑膜组织中高表达的蛋白分子中,通过淋巴细胞增殖试验及细胞因子检测,筛选出类风湿关节炎特异性自身抗原,并分析血清中抗原水平与疾病活动度的相关性.结果 磷酸丙糖异构酶能特异性刺激RA外周血淋巴细胞增殖并分泌INF-γ、TNF -α及IL-17等细胞因子；RA 血清中磷酸丙糖异构酶含量明显高于正常人,且血清磷酸丙糖异构酶水平与疾病活动度评分呈明显正相关.结论 磷酸丙糖异构酶是类风湿关节炎新的疾病相关性自身抗原.
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间接酶联免疫法测定抗Jo-1抗体及其临床应用
目的 利用基因工程表达的组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1蛋白,建立ELISA法,初步用于检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体.方法 用表达蛋白建立间接ELISA,摸索反应时间、抗原包被浓度、样本稀释浓度及抗抗体工作浓度等工作条件,进一步检测方法的重复性及稳定性.用建立的方法,检测40例健康体检者、30例系统性红斑狼疮(SLE)、30例类风湿关节炎(RA)、20例干燥综合征(SS)、90例多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)患者血清中抗Jo-1抗体.结果 成功建立间接ELISA法,并确立了一系列反应条件.临床检测结果显示,PM/DM患者抗Jo-1抗体的阳性率为25.6%,而非PM/DM患者均为阴性.PM/DM组Jo-1抗体阳性率与疾病对照组及健康对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论 本研究成功应用基因工程表达的Jo-1蛋白建立了间接ELISA法,检测抗Jo-1抗体,与国外报道的结果基本相当,与常用免疫印迹法对比检测的结果一致.
关键词： 组氨酰转移核糖核酸合成酶 自身抗原 酶联免疫吸附法 -
原发性干燥综合征自身抗原SSB mRNA荧光定量检测方法的建立
目的 分别为6.8%和16.4%,高值的批内、批间的CV分别为7.6%和18.9%;20名PSS患者外周血中均有SSB mRNA的表达,范围为4.65×105～8.49×106拷贝/μg RNA,均值为4.80×106拷贝/μgRNA,20例健康体检者的SSB mRNA的表达范围为2.71×103～1.30×104拷贝/μgRNA,均值1.92×103拷贝/μgRNA,两组相差显著(P＜0.01).结论 成功建立了PSS自身抗原SSB基因表达含量的荧光定量检测方法,检测结果可用拷贝数表示,定量准确可靠.
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人类全基因组编码蛋白质芯片技术筛选胆道闭锁自身免疫靶抗原
目的 筛选胆道闭锁(biliary atresia,BA)自身免疫相关靶抗原,建立疾病差异性抗原谱,寻找疾病诊断及发病机制研究线索.方法 以20例BA患儿、5例疾病对照组患儿(包括婴儿肝炎综合征2例、胆总管囊肿3例)和5例正常儿童对照组的血清为探针,采用全基因组蛋白质芯片技术进行检测,并进行生物学聚类分析和GO功能分析.结果 通过比较BA组与对照组,共筛选出存在明显差异的免疫响应蛋白281个,其中IgG响应105个,IgM响应176个,IgG和IgM同时响应的26个;依据差异倍数≥2、表达稳定的标准得出49个高响应蛋白.GO功能分析发现差异抗原主要涉及调控细胞发育、增殖、凋亡及胆道形成.其中CENP6、UBQLN3、PDCD2、SPEG和RBPJ蛋白在BA组中阳性率显著高于正常对照组(100％vs 0％,P<0.05).结论 成功建立BA相关自身抗原差异谱,为BA的早期诊断、发病机制的阐明提供新的科学依据,但仍需更为深入的鉴定和更多临床样本的验证.
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免疫机制在神经系统副肿瘤综合征中的作用
神经系统副肿瘤综合征(PNSs)是一种自身免疫性神经系统疾病.目前认为由肿瘤产生的相关抗体与神经元自身抗原产生免疫反应为其发病机制,但在大多数PNSs病例中,免疫作用如何导致神经元死亡的机制仍不很清楚.
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重症肌无力发生与发展的临床流行病学研究
重症肌无力(MG)是以神经肌肉接头处乙酰胆碱受体(AchR)受累为主,兼有其他自身抗原受累的自身免疫性疾病.患者的临床和免疫学特点各不相同,这种异质性使之被认为是一综合征[1,2].对临床特征和自然史的临床流行病学研究有助于认识MG发生和发展的特点.质量良好的流行病学研究资料有助于在诊断中正确分型、寻找佳治疗方法和估计预后.现就MG研究中常见的流行病学方法进行综述.
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特应性皮炎自身免疫发病机制的研究进展
特应性皮炎主要表现为皮肤广泛红斑、丘疹、脱屑和顽固的瘙痒和皮肤干燥.在过去的30年中,世界多数国家特应性皮炎的患病率大幅度增加.皮肤屏障破坏、免疫功能异常、皮肤菌群改变是其发病的主要原因.近期研究发现,机体针对自身抗原的免疫反应可能是其顽固迁延的一个重要原因.自身抗原既可以通过与环境过敏原特异性IgE的交叉反应致病,也可通过直接激活T细胞发生自身免疫反应而致病.
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RNP抗原及其抗体
U1RNP抗原是可提取性抗原组成之一,与抗U1RNP抗体反应的主要是U1RNP中的3种多肽:U1-70K、U1A和U1C.目前认为抗RNP抗体是MCTD的标志性抗体.本文将主要介绍RNP抗原的组成、生物学功能和抗原性,以及抗RNP抗体与临床的相关性.
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基于热分离法制备的人表皮侧抗原的Western印迹实验对大疱性类天疱疮的诊断价值评估
目的 通过热分离方法制备人表皮侧蛋白,评价表皮侧蛋白Western印迹在大疱性类天疱疮(BP)诊断中的价值.方法 热分离健康人皮肤制备人表皮侧抗原,以此为底物,对2015年1月至2017年8月在中国医学科学院皮肤病医院住院的22例BP患者及25例非BP对照血清行Western印迹检测,同时对所有受试者血清行BP180 NC16A ELISA检测.应用统计软件SPSS22.0进行统计学分析.计数资料采用x2检验及Fisher精确检验法分析.结果 表皮侧蛋白Western印迹、BP180NC16A ELISA诊断BP的敏感性分别为86.36％(95％ CI为64.03％～ 96.41％)、95.45％(95％ CI为75.11％～ 99.76％)(P=0.294),特异性分别为100％(95％ CI为83.42％～100％)、92％(95％ CI为75.11％ ～ 99.76％)(P=0.149).BP患者表皮侧Western印迹条带分析显示,4例见相对分子质量(RMM)为230000的蛋白条带,18例见180000的蛋白条带,1例见120000和1例见97 000蛋白条带,且为180000蛋白条带的BP患者BP180 NC16A ELISA结果均大于50 U/ml.结论 对BP患者行表皮侧蛋白Western印迹检测,主要阳性条带RMM为180000;表皮侧蛋白Western印迹诊断BP的敏感性低于BP180NC16A ELISA,当患者自身抗体滴度较低时表皮侧蛋白Western印迹结果往往为阴性.
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转谷氨酰胺酶3与树突细胞特异性捕获非整合素的细胞间黏附分子体外结合能力研究
目的 检测树突细胞特异性捕获非整合素的细胞间黏附分子(DC-SIGN)转染的HEK293T细胞和单核细胞来源的树突细胞(MDDC)膜表面DC-SIGN受体对转谷氨酰胺酶3(TG3)的识别和摄取能力.方法 采用脂质体转染的方法将融合有DC-SIGN基因片段及真核表达载体pGCMV-EGFP(增强绿色荧光蛋白)的质粒转染至HEK293T细胞,制备DC-SIGN-EGFP-HEK293T细胞;通过磁珠阴性分选出外周血中CD14+单核细胞,并通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导获得MDDC.利用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测转染的HEK293T细胞及MDDC上DC-SIGN受体对TG3蛋白的识别和摄取,并设立空白对照组(不加入Alexa Fluor-647染料标记的TG3)和阴性对照组(仅加入Alexa Fluor-647染料).结果 TG3与HEK293T和MDDC细胞孵育3h后,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪均显示,TG3可以被HEK293T及MDDC细胞上DC-SIGN受体识别并结合摄取入细胞内,流式细胞仪检测显示TG3与MDDC的结合可被DC-SIGN阻断抗体部分阻断.阴性对照组和空白对照组未见HEK393T或MDDC细胞对TG3的识别和结合.结论 TG3可以作为一种自身抗原被DC-SIGN受体识别、结合,并被介导摄取进入树突细胞.
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特应性皮炎患者血清转谷氨酰胺酶2特异性IgE水平与病情相关性研究
目的 检测特应性皮炎(AD)患者血清中转谷氨酰胺酶2(TG2)特异性IgE(sIgE)的表达水平,并分析与患者病情的相关性.方法 共入组77例AD患者,其中,44例≥12岁,33例＜12岁,内源性AD(特异性sIgE阴性,且总IgE＜150 kU/L)20例,外源性AD(一种以上的外源性过敏源sIgE++以上,或总IgE≥150 kU/L)49例.采用免疫捕获及生物素标记的酶联免疫分析法检测77例AD患者、40例成人寻常性银屑病患者和30例成人健康对照血清中TG2 sIgE水平.记录AD患者年龄、病程、SCORAD评分、嗜酸性粒细胞计数和总IgE及TG2的sIgE水平.结果 ≥12岁AD组、＜12岁AD组、银屑病组和对照组外周血TG2 sIgE水平(A450)分别为1.02±0.2、1.04±0.044、0.93±0.25、0.71±0.13.≥12岁AD、寻常性银屑病和健康对照组外周血中TG2 sIgE表达水平差异有统计学意义(x2=37.407,P＜0.001);两两组间比较发现,≥12岁AD组、银屑病组TG2 sIgE水平均显著高于对照组(t值分别为7.38、4.83,均P＜0.001).内源性AD组TG2 sIgE水平(1.16±0.03)高于外源性AD组(1.02±0.20)(t=2.27,P=0.02).AD患者组TG2 sIgE水平与年龄、病程、SCORAD评分、嗜酸性粒细胞计数、血清总IgE水平均无显著相关性(r值分别为0.03、0.14、-0.04、-0.08和0.06,均P＞0.05).结论 AD患者血清中TG2 sIgE水平明显升高,TG2可能是AD患者的一种自身抗原,但TG2 sIgE与患者的病情严重程度无明显相关性.
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副肿瘤性天疱疮自身抗原表位研究
目的 探讨副肿瘤性天疱疮的自身抗原表位.方法 运用重组融合蛋白免疫印迹实验、合成短肽酶联免疫吸附实验、竞争性酶联免疫吸附实验和斑点免疫印迹实验对副肿瘤性天疱疮的主要自身抗原-斑蛋白家族分子进行研究.结果 斑蛋白家族中周斑蛋白和包斑蛋白的L亚区是副肿瘤性天疱疮患者血清识别的主要抗原,其中包斑蛋白L亚区第1738～1757位氨基酸序列中存在着特异性抗原表位,可被多数副肿瘤性天疱疮血清识别.结论 包斑蛋白L亚区中存在着副肿瘤性天疱疮的特异性抗原表位.
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蛋白质组学技术鉴定白癜风相关的黑素细胞膜抗原
目的 通过蛋白质组学技术鉴定白癜风自身抗体识别的黑素细胞膜抗原的性质.方法 采用活细胞ELISA和免疫印迹法筛选含高滴度抗黑素细胞抗体的白癜风患者血清.提取黑素细胞膜表面蛋白,制备2块平行级双向电泳凝胶,免疫印迹,比较健康对照血清与白癜风患者血清免疫着色差异点,通过图像分析及蛋白质组学服务器查询、分析差异蛋白的性质.结果 黑素细胞膜蛋白的双向电泳显示500个左右的蛋白点,分离效果理想.双向电泳的免疫印迹成功发现3个蛋白差异点,其中一个为已知的细胞膜抗原黑素细胞浓集受体-1(MCHR-1),另两个蛋白点的表观相对分子质量约为75 000和60 000,表观等电点约为6.5和5.5,无法通过生物信息学技术获得其性质,有待进一步进行质谱鉴定.结论 通过蛋白质学技术初步鉴定出3个位于黑素细胞膜的白癜风候选自身抗原,一个是已知的膜抗原MCHR-1,另外2个还需进一步鉴定.
