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水蛭素的生理处置及药动学研究现状
水蛭素为活血化瘀中药水蛭的重要成分,现已通过基因重组技术大量制备,具有强大的抗凝抗栓作用.现对水蛭素的生理处置、临床前药动学和临床药动学及其血药浓度测定的研究进展进行综述,为水蛭素的进一步研究和临床应用提供科学依据.
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重组水蛭素体内抗凝活性的实验研究
目的研究重组水蛭素的抗凝活性,为水蛭素新药开发提供实验依据.方法家兔iv重组水蛭素前及后心脏采血,应用血凝仪测定凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(APTT),并考察其抗凝活性的量效和时效关系.结果重组水蛭素能明显延长TT和APTT,且呈剂量依赖性,但在所试剂量范围内对PT无明显影响;其延长TT和APTT的作用随时间而下降,作用持续时间约60 min.结论重组水蛭素具有明显抗凝作用,明显强于现有抗凝药肝素,且其作用强度与同剂量德国产基因重组水蛭素Refludan相同.
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不同药物对人肺巨细胞癌PGCL3细胞表面表达的血小板免疫相关抗原的影响
利用铺有Matrigel的Boyden小室观察抗CD9、抗CD42a、抗CD 63、抗TS P抗体对PGCL3细胞侵袭作用的影响;采用流式细胞术观察2.5、10、20 mg/L的川芎嗪、丹参酮ⅡA和50、500、1 000 U/L的水蛭素和凝血酶对PGCL3细胞膜表面CD9、CD42a、CD 63、TSP表达的影响,观察川芎嗪、丹参酮ⅡA、水蛭素和凝血酶对人肺巨细胞癌PGCL 3细胞表面血小板免疫相关抗原CD9、CD42a、CD63和TSP表达的影响,部分阐述各种药物对肿瘤粘附和侵袭影响的不同作用机制.结果抗CD9抗体明显增加PGCL3细胞的侵袭,而抗CD 42a、抗CD63、抗TSP抗体不同程度减少PGCL3细胞的侵袭.川芎嗪可使CD9+、CD42a+ 、TSP+细胞的数目减少,PGCL3细胞表面CD9的表达减少;丹参酮ⅡA使CD9的表达有所增加,CD63和CD42a的表达有所下降,CD42a+、TSP+的细胞数目下降;水蛭素使CD9 、CD63和CD42a的表达有所减弱,CD42a+、CD63+细胞的比例下降;凝血酶使CD9和CD42a 的表达有所减弱,并使CD42a+的细胞数目减少.提示川芎嗪、丹参酮ⅡA、水蛭素和凝血酶对PGCL3细胞表面表达的血小板免疫相关抗原CD9、CD42a、CD63、TSP的不同影响可能与它们对PGCL3细胞粘附和侵袭的不同作用有关.
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水蛭素对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及对C-met表达的影响
目的:观察水蛭素对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用,并探讨其作用机制.方法:小鼠右前腋窝下皮下种瘤建立实体瘤模型,将40只小鼠随机分为4组,模型对照、阳性对照、水蛭素高剂量和水蛭素低剂量组,每组10只.水蛭素高、低剂量组分别以2.0、1.0 g/(kg·d)灌胃,阳性对照组以氟尿嘧啶20 mg/(kg·d)腹腔注射,模型对照组以生理盐水0.1 mL/(10 g·d)灌胃.用药14 d后取瘤称重,计算抑瘤率,采用免疫组织化学方法对瘤组织进行染色,利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测算平均光密度值,检测瘤组织中C-met的表达.结果:水蛭素高、低剂量组对小鼠H22肝癌细胞均有明显的抑制作用,抑瘤率分别为37.63%、23.71%,与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05),C-met在4组中均呈阳性表达,经用药后水蛭素高、低剂量组C-met的表达均下调,与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:水蛭素对小鼠H22肝癌细胞有明显的抑制作用,其机制可能与降低肝癌细胞内C-met的表达有关.
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新型抗凝药——水蛭素的应用进展
近年来对凝血酶抑制剂的研究比较活跃,特异性的凝血酶抑制剂包括水蛭素、水蛭素衍生物以及一些特异性较低、分子量较小的肽类抑制剂,其中水蛭素的发展快.
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多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达
目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.
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国产水蛭素真空采血管检测全血细胞计数
全血细胞计数(complete blood count,CBC)是筛查疾病的重要手段,五分类全自动血细胞分析仪有效地提高了临床血液学检验的质量和效率~([1]).常规CBC检查时采集静脉血后用乙二胺四乙酸钾(EDTA-K_2)抗凝.目前水蛭素(Hirudin)作为抗凝剂用于医学检验尚处于探索阶段,笔者对水蛭素与EDTA进行对比,观察用水蛭素进行CBC分析的有效性.
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水蛭素对动脉内皮保护作用的实验研究
目的:探讨水蛭保护动脉粥样硬化动脉内皮的作用及可能机制.方法:55只大耳白兔随机分为2组.正常对照组(A组)予普通喂养,模型组予高脂喂养9周.确定模型成功后模型组再次分为未处理组(B组)继续高脂喂养;低剂量水蛭组(C组)加用水蛭粉0.5 g/(kg·d);高剂量水蛭组(D组)加用水蛭粉1.5 g/(kg·d);阿托伐他汀组(E组)加用阿托伐他汀2.5 mg/(kg·d).继续喂养8周后比较各组的胸主动脉大体形态、组织形态差异和血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、一氧化氮(NO)、内皮素(ET)-1、前列环素(PG)F-1-α、血栓烷(TX)B2及C-反应蛋白(CRP)等指标差异.结果:B、C、D、E组平均斑块面积分别为74％、45％、21％、20％.D组TC、TXB2、ET-1、CRP低于B组,NO、PGF-1-α显著高于B组,TC、LDL、NO高于E组,ET-1低于E组,差异有统计学意义(均P＜0.05).结论:水蛭可能通过升高NO、PGF-1-α,抑制TXB2、ET-1及炎症反应来保护动脉内皮.
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水蛭素抑制凝血作用探讨
水蛭素是从医用水蛭唾液腺中分离出来的一种单链多肽,是中药水蛭中的重要活性成分,为迄今发现的作用强的凝血酶抑制剂.水蛭素具有极强的抑制凝血作用和抗血栓形成作用,在临床治疗和预防各种血栓形成方面有着广阔的应用前景.近年来,国内外在水蛭素治疗疾病方面进行了研究,并在重组水蛭素的研发方面取得了令人瞩目的进展<'[1]>.我们综合国内外文献从分子生物学角度简述水蛭素作用于凝血酶的机制,对水蛭素和凝血酶之间的生物学作用研究进展探讨如下.
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含水蛭的中成药干预颈动脉粥样硬化斑块的M eta 分析
目的：系统评价含水蛭的中成药治疗颈动脉粥样硬化的疗效，为临床应用提供依据。方法计算机检索Cochrane Library、美国国立医学图书馆（ PubMed）、中国生物医学文献数据库（ CBM）、中国期刊全文数据库（ CNKI）、维普中文科技期刊数据库（ VIP）、万方数据库等数据库，Google学术搜索，文种不限，检索时限均从各库建库起截止2014年11月30日，由2名评价者独立评价并交叉核对纳入研究质量后，对纳入的随机对照试验进行方法学质量评价，并用RevMan 5．3软件进行Meta分析。结果共纳入14个随机对照试验，共1418例患者。研究结果显示含水蛭的中成药联合或不联合他汀类药物的治疗组在降低颈动脉内膜－中层厚度（ CIMT）、颈动脉斑块Crouse积分、斑块面积方面均优于单独使用他汀类对照组（P均＜0．01）。含水蛭的中成药联合或不联合他汀类药物的治疗组胃肠道反应发生率与对照组比较差异均无统计学意义（P均＞0．05）；含水蛭的中成药联合他汀类药物的治疗组肝肾功能异常发生率与对照组比较差异无统计学意义，治疗组仅予含水蛭的中成药时，肝肾功能异常的发生率低于对照组（ P＝0．04）。结论含水蛭的中成药联合或不联合他汀类药物治疗颈动脉粥样硬化，在降低CIMT、斑块积分及斑块面积方面均优于单独使用他汀类药物，且不增加不良事件（胃肠道反应、肝肾功能异常）的发生；其中含水蛭的中成药与他汀类药物相比，肝肾功能异常的发生率明显降低。但纳入RCT质量均较低，该结论还需更多设计合理、高质量、大样本的研究进一步验证。
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疏血通注射液治疗不稳定型心绞痛的临床观察
不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris,UAP)是一种介于稳定型心绞痛和心肌梗死之间的临床综合征,若不及时治疗,易导致急性心肌梗死或猝死.我们应用疏血通注射液治疗不稳定型心绞痛获得满意疗效.现介绍如下.
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水蛭素对大鼠脑出血后细胞黏附分子1mRNA表达及血脑屏障通透性的影响
目的 探讨水蛭素对大鼠脑出血后细胞黏附分子1(ICAM-1)mRNA的表达及血脑屏障通透性的影响.方法 采用自体动脉血注入大鼠尾状核建立脑出血模型,将75只大鼠分成对照组、脑出血组、水蛭素组.各实验组分6小时、1天、3天、5天、7天5个时间点,每个时间点各5只大鼠.分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、伊文思兰染色法测定不同时间点的ICAM-1 mRNA表达量和血脑屏障通透性的变化.结果 ICAM-1 mRNA表达和血脑屏障通透性在脑出血后6小时开始升高(1.220±0.044,0.592±0.106),3天达到高峰(1.638±0.071,0.791±0.520),5～7天开始下降.给予术蛏素治疗后,二者均明显下降,水蛭素组与脑出血组在各个时段差异有统计学意义(P＜0.01).结论 水蛭素可以减轻脑出血后的ICAM-1 mRNA的高表达及血脑屏障通透性的增加,从而减轻脑水肿程度.
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第51讲不稳定性心绞痛和非Q波心肌梗死的诊治进展(2)
(上接第21期)3.2 抗凝药普通肝素(UH)对UA/NQMI患者是有益的,过去建议用于中、高危亚群,使用2～5天或至冠脉介入.但由于UH是不同链长的硫酸粘多糖的混合物,在不同个体量效关系是不同的,也就是说其抗凝活性不能预知,需监测aPTT,同时UH也能激活血小板聚集而致血栓形成,也可致血小板减少症,甚至有时是致命的,这就促使一些新的抗凝药的研制,主要包括LMWH和水蛭素.
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疏血通注射液对2型糖尿病患者炎性因子的影响
目的 观察疏血通注射液对2型糖尿病患者炎性细胞因子影响.方法 175例2型糖尿病患者随机分为对照组和治疗组,分别给予双胍类和双胍类基础上加疏血通注射液.入选后第2天和第1 6天分别测定肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL -6)、C反应蛋白、纤溶酶原激活抑制物-1(PAI -1)和脂联素.结果 治疗16d后,治疗组TNF -a、IL -6、C反应蛋白、PAI -1和脂联素与对照组显著差异(P＜0.05).结论疏血通注射液对2型糖尿病患者炎性细胞因子调节有一定效果.
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疏血通注射液治疗脑出血的研究进展
疏血通注射液由动物类中药水蛭和地龙提取而成,有效成分为水蛭素和蚓激酶,具有抗凝、溶栓、抗血小板聚集、改善血液流变学、调节血脂、细胞保护等作用.
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核转录因子κB在大鼠脑出血后血肿周围组织中的表达及水蛭素的保护作用
目的 探讨大鼠实验性脑出血后脑组织核转录因子κB(NF-κB)的表达及水蛭素对其表达的影响.方法 采用自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型,免疫组化染色法检测脑组织NF-κB 的表达和采用干湿比重法测定脑含水量.结果 脑出血后6 h血肿周围组织NF-κB开始表达,3 d达高峰,脑含水量6 h升高,3 d达高峰.水蛭素组脑含水量、NF-κB表达与对照组及脑出血组比较均有统计学意义(P<0.05 or P<0.01).结论 NF-κB参与了脑出血继发性脑组织损伤.
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大鼠脑出血后IL-1β表达及凝血酶的干预作用
目的 观察在大鼠实验性脑出血(ICH)后不同时间点血肿周围白细胞介素-1β(IL-1β)表达情况及凝血酶对其影响.方法 采用自体血、凝血酶注入法分别制作大鼠模型,应用免疫组化法观察不同时间点各组大鼠IL-1β的表达情况及凝血酶对其表达的影响.结果 在造模后1 h,脑出血组和凝血酶组病灶周围即可见IL-1β表达,6 h达高峰,以后逐渐下降,48 h阳性细胞基本消失.在相应时间点,ICH+水蛭素组血肿周围IL-1β的表达水平均明显低于ICH组(P＜0.01),且细胞着色浅,凝血酶+水蛭素组病灶周围IL-1β的表达水平均明显低于凝血酶组(P＜0.01),且细胞着色浅.假手术组仅有少量阳性细胞表达.结论 IL-1β参与了ICH后脑损伤,凝血酶可能通过促进IL-1β的表达而发挥脑损伤作用.
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水蛭素对被动型Heymann肾炎模型大鼠足细胞Nephrin表达的影响
目的:探究水蛭素对被动型Heymann肾炎模型大鼠足细胞Nephrin表达的影响.方法:成功建立被动型Heymann肾炎模型,将实验动物分为空白对照组、模型安慰剂组、贝那普利组和水蛭素干预组,每组10只,实验观察周期为4周.于4周后观察大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐(Scr)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血小板(PLT)的变化情况,且取出SD大鼠肾脏,采用RT-PCR法测定大鼠肾皮质中Nephrin mRNA的相对表达水平,Western印迹测定Nephrin蛋白的相对表达量,免疫组化法对Nephrin蛋白进行半定量分析.结果:与模型组相比,贝那普利组在Nephrin mRNA和Nephrin蛋白方面差异无统计学意义(P＞0.05),但水蛭素干预后可增加Nephrin mRNA和Nephrin蛋白的表达(P＜0.05).相比于贝那普利组,水蛭素组可增加Nephrin mRNA的表达,但在Nephrin蛋白方面差异无统计学意义.免疫组化半定量分析:空白组Nephrin蛋白的表达量高,贝那普利组、水蛭素组的Nephrin蛋白表达量强于模型组,水蛭素组大鼠肾脏Nephrin蛋白的表达量高于贝那普利组,其差异均有统计学意义(P＜0.01).生化指标显示:与正常组比较,贝那普利组和水蛭素组的24h尿蛋白、PLT升高,模型组、贝那普利组和水蛭素组Scr显著降低;与模型组比较,贝那普利组的Scr、ALT降低;与贝那普利组比较,水蛭素组Scr偏高.结论:水蛭素可上调被动型Heymann肾炎模型大鼠足细胞Nephrin mRNA和蛋白的表达.
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水蛭素基因工程菌的培养条件优化
通过正交实验对水蛭素基因工程菌的发酵培养基进行了优化,并由此得到较佳培养基配方为玉米浆4.5%,牛肉膏2.5%,谷氨酸钠1.5%;以此优化培养基在初始PH6.5,种龄12小时和温度37℃等条件下,摇瓶发酵液水蛭素活力可达到1200ATU/ml.
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水蛭对慢性肾脏病疗效及安全性的Meta分析
目的:系统评价水蛭干预慢性肾脏病的效果及安全性分析,为防治慢性肾脏病提供参考.方法:计算机检索PubMed、EMbase、CENTRAL、VIP、CBM、CNKI、WanFang Data数据库,均从初检索至2017年3月10日.检索水蛭干预慢性肾脏病的相关文献,只纳入RCT文献.根据Cochrane协作网评价员手册评价纳入研究的偏倚风险,由2名研究人员独立筛选、评价文献和收集数据.采用RevMan 5.3软件进行Meta分析.结果:共纳入11篇RCT,患者760例,Meta分析结果显示:联合用药组的24 h尿蛋白含量比单用常规治疗下降更明显[MD=-2.81,95％ CI(-4.82,-0.80),P＜0.0001];联合用药组的血肌酐含量比单用常规治疗下降更明显[MD=-26.16,95％ CI(-46.65,-5.81),P=0.01];血尿素氮水平两组间差异无统计学意义[MD=-2.05,95％ CI(-4.28,0.17),P=0.07];不良反应发生率两组间差异无统计学意义[RD=0.03,95％ CI(-0.05,0.12),P=0.43].结论:水蛭联合常规治疗与单用常规治疗比较,更能延缓肾脏损害及保护肾脏.但纳入研究质量限制,上述结论尚待更多高质量RCT予以验证.
