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天然水蛭素对人微血管再生作用的初步研究
目的 研究天然水蛭素对人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells,HMVECs)增殖的影响及其诱导血管再生的机制.方法 取HMVECs接种至Matrigel基质胶培养24 h,体外建立三维培养模型,于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况.然后将细胞三维培养模型随机分为不同浓度天然水蛭素培养组(1、4、7 ATU/mL组)以及单纯含10％FBS的DMEM培养基培养组(对照组).各组细胞三维培养模型加入对应培养基后,培养24、48、72h采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖情况;培养24h行成管实验并采用免疫荧光染色法测定细胞VEGF及Notch1表达水平.结果 细胞三维培养观察示,HMVECs于基质胶上贴附良好,24 h时完全形成管腔样结构.CCK-8检测示,各时间点1、4 ATU/mL组A值均高于对照组(P＜0.05),其中4ATU/mL组高;而7 ATU/mL组A值显著低于对照组以及1、4ATU/mL组(P＜0.05).细胞成管实验示,1、4 ATU/mL组成管数量较对照组及7ATU/mL组明显增多,且4ATU/mL组多于1ATU/mL组,差异有统计学意义(P＜0.05);7ATU/mL组与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).免疫荧光染色示,与对照组比较,1、4 ATU/mL组Notch1表达量增高,7 ATU/mL组降低;其中4、7ATU/mL组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).1、4、7 ATU/mL组VEGF表达量均较对照组增高,4 ATU/mL组高于1、7 ATU/mL组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 低、中浓度天然水蛭素可促进HMVECs增殖使血管再生,高浓度天然水蛭素则对HMVECs增殖及血管再生起抑制作用;其作用机制可能与VEGF-Notch信号通路有关.
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菲牛蛭的含量测定方法改进及检测中的注意事项
改进菲牛蛭的水蛭素含量测定方法及总结检测中的注意事项,提高方法的重复性及准确度,更有效地控制菲牛蛭的质量.
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疏血通注射液对老年人凝血、血管内皮、抗血小板聚集功能影响的临床研究
目的:评价疏血通注射液对老年人凝血、血管内皮、抗血小板聚集功能的影响及其安全性. 方法:将97例老年疏血通注射液治疗适应症患者,疏血通注射液静脉缓慢滴注,1次/日,连续用药14天.测定治疗前后血浆凝血酶原时间(PT)用国标标准化比值(INR)表示、部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、及凝血酶时间(TT),血管内皮功能检查.血小板聚集功能检查. 结果:治疗后INR由(1.17±0.13)和延长至(1.32±0.21)和APTT由(30.9±6.2)秒延长至(36.9±7.3)s、TT由(15.5±2.2)s延长至(17.3±2.9)s均较治疗前明显延长,FIB由(3.04±1.17)g/L,降低至(2.30±0.6)g/L,均有显著差异(P<0.05).血管内皮依赖性舒张功能由(8.5±5.9)%提高至(16.9±6.7)%有明显增加(P<0.001).血小板聚集较治疗前明显下降,其中花生四烯酸诱导血小板聚集率由(31.5±24.2)%下降至(21.4±16.3)%,ADP诱导血小板聚集率由(53.1±26.0)%下降至(38.8±19.9)%(P<0.05). 结论:疏血通注射液对老年患者具有抗凝血功能,改善肱动脉内皮依赖性舒张功能,抑制花生四烯酸、ADP诱导的血小板聚集功能.
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凝血酶滴定法测定云南菲牛蛭中水蛭素含量的改进研究
目的 改进原云南省菲牛蛭质量标准中水蛭素的含量测定方法.方法 考察白瓷板法代替原试管方法、两种浓度的凝血酶溶液、几种滴定体积对含量测定的影响;用原方法和改进后的方法分别对五批样品进行滴定比较.结果 改进后,用白瓷板法测定,配制两种浓度的凝血酶溶液(40NIH·mL-1与20NIH·mL-1),采用几种滴定体积(1～5μL),每1min滴加1次,先滴加高浓度凝血酶溶液初测消耗的凝血酶溶液体积后,再用两种浓度的凝血酶溶液重新进行精确测定;增加空白对照实验,限定反应时间为10min;菲牛蛭样品浓度在0.00678～0.0597g·mL-1(r=0.9983)内与消耗的凝血酶单位量呈线性相关;五批样品的含量为156.68～234.25U·g-1,RSD均小于5％;含量供试品溶液在4℃下24h内稳定.结论 改进后的方法简便、快速,重复性和准确度较原方法好,可作为一种新的云南菲牛蛭水蛭素含量测定方法.
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噬菌体改组库的构建及高活性水蛭素变异体的筛选
目的: 运用DNA家族改组方法提高水蛭素的抗凝血酶活性.方法: 将水蛭素HV1、 HV2、 HV3基因等量混合, 用DNase I消化, 回收50 bp左右的片段, 再经无引物和有引物PCR扩增获得与原基因大小相同的改组分子, 构建噬菌体展示的水蛭素改组文库, 经凝血酶亲和淘选, ELISA筛选高活性的水蛭素变异体.结果: 经过DNA改组和噬菌体亲和筛选, 成功获得抗凝血酶活性提高的水蛭素变异体HV2-N47K.结论: 用DNA家族改组及亲和淘选技术能够筛选出高活性的水蛭素变异体蛋白, 这为其他分子的改组提供了借鉴.
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水蛭素对大鼠DIC模型脑组织水通道蛋白4表达的干预作用
目的 探讨水蛭素对DIC模型的大鼠脑组织水通道蛋白4(AQP4)表达的干预作用.方法 通过鼠尾静脉滴注脂多糖制作DIC模型,将大鼠分为三组即对照组、DIC组和水蛭素组,选取4个时间点(4,6,8,12 h)测定血小板计数,PT,APTT,纤维蛋白原和D-D水平的变化;同时用免疫印迹杂交法检测大鼠脑组织水通道蛋白4的表达.结果 与对照组相比,DIC组及水蛭素组血小板计数,PT,APTT,纤维蛋白原和D-D差异具有统计学意义(P＜0.05);水蛭素组上述指标变化明显低于DIC组(P＜0.05);AQP4表达在水蛭素组明显低于DIC组(P＜0.05).结论 DIC时产生的凝血酶可能通过上调AQP4蛋白的表达,参与脑水肿形成和发展;水蛭素通过抑制凝血酶的形成,减轻脑水肿.
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水蛭素对瘢痕成纤维细胞基质金属蛋白酶作用的实验研究
目的:探讨水蛭素对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)表达水平的影响.方法:取10例烧伤愈合后6个月内瘢痕挛缩需手术治疗的患者的瘢痕组织,采用组织块法分离培养增生性瘢痕成纤维细胞.取第4～7代细胞实验,加入0、1、10、50U/ml的水蛭素干预.观察加药后24h、48h成纤维细胞形态学变化,利用MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法及酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast,HSFB)及基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的作用.结果:①1、10、50U/ml组水蛭素对HSFB均有抑制作用(P＜0.05),以50U/ml作用明显(24h、48h抑制率分别为14.75％、15.42％)；②水蛭素作用成纤维细胞24h后MMP-2、MMP-9表达含量均增加,分别以1U/ml、50U/ml作用明显,差异有统计学意义(P＜0.05)；48h后MMP-2表达降低,MMP-9表达有增加但无意义.结论:水蛭素能够抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖,能促进增生性瘢痕成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-2,MMP-9)有利于细胞外基质降解减少沉积.
关键词： 水蛭素 增生性瘢痕 基质金属蛋白酶(MMPs) -
水蛭素对皮肤增生性瘢痕成纤维细胞bFGF及TGFβ1表达的影响
目的:检测水蛭素对人皮肤瘢痕成纤维细胞碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGFβ1)表达的影响,探讨水蛭素抑制瘢痕形成的作用及机制.方法:体外培养并鉴定人皮肤瘢痕成纤维细胞,实时荧光定量RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测不同浓度水蛭素作用人成纤维细胞24h后,bFGF、TGFβ1的mRNA和bFGF、TGFβ1蛋白表达水平.结果:浓度为0.156～2.5 U/L的水蛭素可下调瘢痕成纤维细胞TGFβ1mRNA、蛋白的表达,同时上调bFGF的mRNA、蛋白的表达,不同浓度组间比较,差异有统计学意义.水蛭素可抑制增生性瘢痕成纤维细胞分泌TGFβ1,促进其分泌bFGF.结论:水蛭素抑制瘢痕可调节bFGF、TGFβ1分泌,由此抑制成纤维细胞的生长、增殖并进一步抑制瘢痕形成.
关键词： 瘢痕 水蛭素 成纤维细胞 碱性成纤维细胞生长因子 转化生长因子β1 -
水蛭素和重组链激酶联合应用于脑出血血肿腔中的实验研究
目的研究水蛭素和重组链激酶联合应用于脑内出血(ICH)血肿腔中对血肿周围脑组织的影响.方法 72只SD雄性大鼠制成ICH模型,随机分为对照组、重组链激酶组、水蛭素+重组链激酶组(联合组),各组分别在ICH后8 h、16 h、24 h、48 h向血肿腔中注入生理盐水、重组链激酶、或重组链激酶加水蛭素.ICH后72 h处死大鼠,观察脑组织中的含水量、Na+、K+以及血脑屏障通透性的变化.结果在ICH后8 h、16 h、24 h、48 h应用重组链激酶,可引起脑组织含水量增加以及Na+、K+的变化(P<0.05),在ICH后8 h重组链激酶组,脑组织中伊文思蓝(Evans blue,EB)含量明显升高(P<0.05).联合组与重组链激酶组比较脑组织的含水量在8 h、16 h、24 h、48 h明显降低(P<0.05),脑组织中EB含量在8 h、16 h、24 h、48 h也明显降低(P<0.05).结论 ICH血肿腔内单独应用重组链激酶可加重ICH血肿周围脑组织的损伤,联合应用水蛭素不但可防治重组链激酶溶化血块时对脑组织的损伤,而且还可降低血肿本身所释放的毒性物质所引起的脑水肿及血脑屏障的破坏.
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水蛭素的分子改造与结构修饰研究进展
目的 为更好地开发利用重组水蛭素,综述国内外水蛭素结构修饰研究状况.方法 依据近年来国内外文献,进行分析、归纳和总结.结果 与结论笔者通过对水蛭素进行各种分子改造或者结构修饰来产生新的类似物蛋白,从而解决水蛭素在临床应用中出现的种种问题,有的也可能会出现新的功能.
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水蛭素与凝血酶作用的探讨
水蛭素具有极强的凝血抑制作用,能高效抗凝血、抗血栓形成,在临床治疗和预防各种血栓形成方面有着显著的作用.目前国内外医药界把水蛭素作为治疗许多疾病的有效药物进行研究.笔者从分子生物学角度简述了水蛭素和凝血酶的结构特点,对水蛭素和凝血酶之间的生物学作用作一综述.
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水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达
目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.
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重组水蛭素通过降低白细胞浸润减轻心肌缺血再灌注损伤
目的:探讨重组水蛭素(r-hirudin)对兔心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其对缺血心肌中白细胞浸润的影响.方法:24只日本大耳白兔随机分为2组,每组12只.缺血再灌注(I/R)组:心脏左冠状动脉前降支缺血45 min、再灌注120 min;重组水蛭素(r-H)组:缺血45 min、再灌注120 min,再灌注前15 min静注重组水蛭素(1 mg/kg),再灌注时继以持续静滴重组水蛭素[1 mg/(kg*h)]120 min.测定血浆肌酸磷酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,并观察缺血心肌内白细胞聚集、心肌缺血及梗死范围的变化.结果:I/R组缺血心肌内白细胞聚集,血浆CK、LDH活性明显增高,心肌梗死面积明显增大;给予重组水蛭素,可显著降低缺血心肌内白细胞聚集,降低梗死面积,减轻心肌再灌注损伤(P<0.05).结论:重组水蛭素能够抑制再灌注期缺血心肌内白细胞浸润,拮抗心肌缺血/再灌注损伤.
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水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选
目的:构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得重组水蛭素蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础. 方法:根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子,设计HV1编码基因,分为8条寡核苷酸片段进行DNA合成,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,得到pPIC9K-HV1,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1168,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合. 结果:获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K-HV1,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中. 结论:成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化HV1蛋白及其临床应用奠定了基础.
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中西医结合治疗男性精液不液化症的临床研究
目的：观察中西医结合治疗精液不液化的临床疗效。方法对照组采用传统的中药知柏地黄丸汤剂（知母8黄柏10山茱萸10淮山药10茯苓20丹皮10泽泻15熟地20）1剂/d反渣，共连用90 d。治疗组采用单味中药水蛭粉3 g，2次/d，90 d，强力稀化粘素0.3 g，2次/d，共用90 d，并辅助其它综合治疗措施包括心理辅导、饮食调节、盆浴、规律生活和适当运动。每30 d复查精液常规，6个月后随访夫妻妊娠情况。结果治疗组患者治愈为20%，显效为63.33%，总有效率为83.33%；对照组患者治愈为3.33%，显效为15.00%，总有效率为18.33%。两组治疗效果差异有统计学意义（P<0.05）。6个月后回访妊娠情况，治疗组63.33%，对照组20.00%，两组差异有统计学意义（P<0.05）。
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蜞针疗法
随着水蛭素的发现以及活体水蛭吸血疗法在显微外科、整形外科的应用，水蛭以其独特的医用价值再次活跃于临床。祖国传统医学素来就有利用活体蚂蝗吸食恶血而治病的方法，称为蜞针疗法。笔者认为应当加强蜞针在中医放血疗法中的应用，将现代医学卫生的有利条件与传统的蜞针疗法相结合，集两者之优，极大可能地为患者减轻痛苦。
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局部应用水蛭素对大鼠血管吻合模型术后血栓形成的观测
目的 探讨局部应用水蛭素对微血管吻合术后血栓形成的影响.方法 将120只Wistar雌性大鼠随机分为生理盐水组、肝素组、水蛭素组,建立大鼠微血管损伤后吻合模型,于术后2小时、24小时、3天、5天观察血管吻合后的愈合情况及血管通畅情况.将血栓连同血管段一起取出,切片、HE染色,取血管血栓体部中点切片,用Image Pro Plus 6.0医学图像处理系统测量血栓形成的面积和血管腔面积的比值(简称血栓比值).结果 随观察时间的延长,3个实验组血管吻合口通畅率呈下降趋势.血栓比值术后2小时肝素组和水蛭素组低于生理盐水组(P＜0.05).术后24小时、3天和5天生理盐水组、肝素组和水蛭素组血栓比值3组间两两比较,有显著性差异(P＜0.01).结论 Wistar大鼠股动脉吻合术后局部应用水蛭素能够有效减少血栓的形成,使通畅率明显提高.
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凝血酶对脊髓组织毒性损伤机制及水蛭素的干预作用
目的:研究凝血酶对大鼠脊髓组织毒性损伤机制及水蛭素的干预作用.方法:用免疫组化法检测凝血酶受体1(PAR-1)在脊髓组织中的表达,显微镜和MOTAC病理图像分析仪检测PAR-1免疫组化阳性细胞数;HE染色病理切片观察脊髓组织形态学的改变.结果:实验各组PAR-1阳性表达及脊髓组织水肿在脊髓损伤后6小时开始,72小时达到高峰(P<0.01);水蛭素可明显降低各时相PAR-I阳性表达(P<0.01或P<0.05).结论:凝血酶对脊髓组织有细胞毒性损伤作用,且于72小时时损伤严重;凝血酶抑制剂水蛭素可以选择性和特异性抑制凝血酶对脊髓组织的损伤.
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水蛭注射液抗凝与溶栓作用
目的:探讨水蛭提取物(extract from hirudo,EFH)的抗凝溶栓作用.方法:凝血时间、体外血栓形成及溶解,正常与脑血栓模型大鼠的纤维蛋白溶解酶活性.结果:EFH组大鼠凝血时间较生理盐水组明显延长,体外血栓干、湿重低于生理盐水组,血凝块溶解率显著高于生理盐水组,血栓形成组大鼠EFH(4 gkg-1) 给药后纤维蛋白溶解活性明显增高于模型组.结论:EFH具有一定的抗凝溶栓作用.
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大鼠脑出血急性期给予水蛭素后血肿周围组织胶质纤维酸性蛋白的表达
目的 通过观察水蛭素对大鼠脑出血后血肿周围组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响,探讨能否早期应用活血化瘀药物.方法 采用胶原酶生理盐水0.8 μL(1μL含胶原酶0.5 U和肝素6U)注入法制作实验性脑出血动物模型.Wistar大鼠随机分为甘露醇6 h、甘露醇3 d、水蛭素6 h、水蛭素3 d、甘露醇+水蛭素6 h、甘露醇+水蛭素3 d组.光镜下定性观察脑出血后血肿周围脑组织的病理变化;免疫组化染色法观察脑出血后GFAP的表达.结果 甘露醇+水蛭素6 h组及3 d组的灰度值分别高于单用水蛭素组或单用甘露醇组(P＜0.05),且6 h组灰度值高于3 d组(P＜0.05),说明近期效果优于远期效果.结论 脑出血早期在控制脑水肿基础上加用水蛭素可阻止过度的GFAP上调,抑制过度的反应性胶质化,促使星形胶质细胞形态向正常方向发展,可减轻急性期脑组织损伤,脑出血后早期应用水蛭素有可能缩短病程,改善预后.
