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广西菲牛蛭药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究
目的:采用高效毛细管电泳法建立广西菲牛蛭药材的指纹图谱.方法:石英毛细管柱( 75 μm×56 cm)作为分离通道,以25 mmol·L-1Na2HPO4-120 mmol·L-1Tris-16 mmol·L-1SDS(1 mol· L-1NaOH调pH 12.0)为缓冲液,运行电压17kV,柱温25℃,检测波长254 nm,进样参数3.4 kPa×6 s,运行时间27 min.结果:建立了广西菲牛蛭药材的高效毛细管电泳指纹图谱,确定了共有峰为13个,10批药材指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.98.结论:该方法具有良好的精密度、稳定性和重复性,为有效控制该药材质量提供了新方法.
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温度、密度、喂食周期对菲牛蛭育苗影响的研究
研究了温度,密度,喂食周期对菲牛蛭幼苗的生长规律.分别设置7个温度(18,22,26,30,34,38℃和自然温度),5个密度(75,125,200,275,350条/L)和6个喂食周期(2,4,6,8,12,16 d),经30 d的养殖后考察各处理的存活率,增长率,特定增长率等生长指标.特定生长率与温度之间存在二次曲线相关,其回归方程式为y=-0.066x2 +3.543 1x-38.09(R2=0.837 9),当水温为26.84℃,菲牛蛭幼苗的特定增长率为大9.461 4,菲牛蛭幼苗适生长水温在26 ～30℃.水温为38℃时,菲牛蛭幼苗全部死亡;特定增长率与密度之间存在显著直线回归关系,其回归方程式为y=-0.005 7x +9.197 3(R2=0.998 3);特定增长率与喂食周期之间存在显著直线回归关系,其回归方程式为y=-0.468 2x+ 10.574(R2=0.998 8).
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中药菲牛蛭化学成分的分析
目的 定性和定量分析菲牛蛭中的脂肪酸、氨基酸和微量元素成分.方法 采用气相色谱/质谱法、高效液相色谱法和电感偶合等离子发射光谱法,对菲牛蛭中的化学成分进行分析.结果 菲牛蛭中含有16种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的34.05%.18种氨基酸,其中七种人体必需的氨基酸占所得氨基酸总量的28.16%.测得微量元素8种:Ca、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、V和Zn,其中Ca、Zn和Fe的含量明显高于其他微量元素的含量.结论 本文全面报道了菲牛蛭中各种化学成分的含量测定.
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生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性测定的研究
目的 将生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性的测定,探讨反映水蛭生物活性的质量控制方法.方法 采用肝素钠作为对照品,选择活化部分凝血酶时间值作为抗凝活性评价依据,对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭的抗凝活性进行测定,测定结果分别用标准曲线法和生物检定统计法计算.结果 4种水蛭活性部分凝血酶时间法的量效关系曲线与肝素的量效关系曲线类似,突跃范围呈平行关系,上述特点符合生物检定的要求,以肝素钠作为标准品,采用生物检定技术活性部分凝血酶时间法测定水蛭等的抗凝活性是可行的.结论 活化部分凝血酶时间值可以全面反映水蛭的抗凝血作用,测定结果对临床使用更具指导意义.生物检定技术应用于中药质量评价,是对现有中药质量标准控制方法良好的补充.
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双水相萃取-凝胶色谱联用法提取菲牛蛭中的水蛭素
目的 建立水蛭素的双水相萃取-凝胶色谱联用提取法.方法 以抗凝血酶活性单位(ATU)为指标,在优化双水相萃取工艺条件基础上,建立以广西菲牛蛭消化液为原料的聚乙二醇/硫酸铵双水相萃取-凝胶色谱联用提取水蛭素新工艺.结果 在所考察的实验范围内,水蛭素对照品双水相萃取佳工艺条件是:PEG 2000、( NH4)2SO4、NaCl质量分数依次为22％、20％、0.04％,萃取液温度35℃、pH 6.0；萃取物经凝胶色谱除杂以后,得到纯度较高的产品.实验建立的提取工艺处理水蛭素对照品ATU回收率达到81.92％,粗提液分离纯化及小规模工艺放大实验ATU回收率分别为80.34％、80.36％.所获产品比活性达到3 210.27 ATU·mg-1、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳及光谱扫描结果与水蛭素对照品相同.结论 双水相萃取-凝胶色谱联用提取水蛭素效果较好.
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基于分子生物学特异性扩增的方法鉴别菲牛蛭
目的:通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的佳退火温度.结果:通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为佳实验引物,且确定了引物7的佳退火温度为49℃.结论:通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考.
关键词： 菲牛蛭 聚合酶链式反应(PCR) COI DNA条形码 特异性扩增 -
广东菲牛蛭中有效抗凝物质的分离纯化
目的 从广东菲牛蛭鲜体中分离纯化有效抗凝物质,并对其生化性质进行测定.方法 用水提醇沉、离子交换、反相层析法等分离纯化广东菲牛蛭中的抗凝物质,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白的分子质量,并运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)进行分析.结果 从广东菲牛蛭中分离出得到一种电泳纯的活性多肽,其相对分子质量为19.2kDa.所得菲牛蛭抗凝活性多肽每克蛋白所含单位抗凝活性≥2548000ATU,活性回收率约为53％.结论 从广东菲牛蛭鲜体中分离出的活性抗凝多肽对凝血酶具有极强的抑制作用,开发应用前景广阔.
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正交试验法优选菲牛蛭饲料配方研究
目的 优化菲牛蛭Poecilobdella manillensis的人工饲料3种主要成分配比,确定饲料的佳配方.方法 采用湿土网箱法养殖菲牛蛭,以存活率和个体体质量增长率为考察指标,采用L9(34)正交试验法,考察血球蛋白粉(NP-90)、血浆蛋白粉(NP-2002)和维生素C(VC)3个因素,优选菲牛蛭人工饲料.采用层次分析法统计正交试验,分析各因素各水平对试验结果的影响权重.结果 以菲牛蛭存活率为考察指标时,3种因素对成活率的影响为VC ＞NP-90＞ NP-2002,以0NP-90、1％ NP-2002和0.05％ VC组合为佳;以菲牛蛭个体体质量增长率为考察指标时,3种因素对个体体质量增长率的影响大小依次为NP-2002＞ NP-90＞ VC,饲料配方以0.5％ NP-90、3％ NP-2002和0.05％ VC组合为优.层次分析表明,各因素对正交试验的指标值影响的主次顺序为NP-90＞NP-2002 ＞VC,0.5％ NP-90、3％ NP-2002和0.05％ VC的权重大,正交试验的优方案为0.5％ NP-90、3％ NP-2002和0.05％ VC.按0.5％ NP-90、3％ NP-2002和0.05％ VC及其他成分配制饲料饲喂菲牛蛭,进行验证试验,结果饲料组菲牛蛭成活率达100％,个体体质量增长率达19.91％.结论 按0.5％ NP-90、3％ NP-2002和0.05％ VC及其他成分配制饲料可作为菲牛蛭人工饲料.
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广东菲牛蛭生长和生殖的研究
目的研究室内菲牛蛭生长动态和生殖,为人工饲养菲牛蛭提供基础资料.方法在同一个卵袋产下的幼蛭,放入盛有天然水的80 cm×60 cm×50 cm的玻璃缸内饲养,每10 d称牛蛭体重1次,每天记录水温,每月换水一次,每次在野外采回的水要检测10种化学成分.在活兔身上吸血,每次称出吸血量.观察生长发育变化、记录交配产卵过程.结果从孵化出的幼蛭经14个月时间,吸血5,6次,生长发育达到性成熟,第1,2,3次吸血为幼体阶段,第4次吸血后进人亚成体阶段,第5次吸血后,部分个体达到性成熟,有的个体第6次吸血后进人性成熟.生长动态曲线是一跳跃曲线.记录了交配、产卵过程.结论阐明牛蛭生长动态和生殖过程.在室内饲养牛蛭成功.
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中药菲牛蛭化学成分的分析
菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson)系医蛭科,牛蛭属环节动物,别名为马尼拟医蛭,俗名金边蚂蟥,其资源在我国的广东、广西和海南十分丰富[1].菲牛蛭是水蛭的一种,水蛭是一味传统的中药,始载于《神农本草经》,历代本草均有记述[2].中医认为它有破血、逐瘀、通经的功能,历来用于治疗症瘕、痞块、血瘀闭经、跌打损伤.
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菲牛蛭及其制品的抗血栓、溶血栓作用
已有较多的文献报道了水蛭的抗血栓、溶血栓药效学研究结果[1～4],而与菲牛蛭相关的抗血栓与溶血栓作用却未见较详细的研究报道[5].菲牛蛭是一种药典尚未收载的吸血水蛭物种,作者对其氨基酸组成成分、有害元素含量、农药残留量、体外生物活性、急性毒性试验及动物药效学试验进行了较深人的研究,本实验报道其在抗血栓、溶血栓方面的药
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菲牛蛭成分与急性毒性试验研究
目的:分析菲牛蛭中的氨基酸成分、有害物质含量与急性毒性,为评价菲牛蛭药材质量提供科学依据.方法:应用日立835-50型氨基酸自动分析仪、原子吸收分光光度法、CGC-ECD和CGC-NPD气相色谱法测定了菲牛蛭中含有的氨基酸成分、有害物质含量,并进行了菲牛蛭的初步急性毒性试验研究.结果:比较分析了宽体金线蛭、日本医蛭、欧洲医蛭、菲牛蛭四种水蛭的氨基酸含量结果,其差别不显著;菲牛蛭中重金属含量和有机氯以及有机磷农药残留量符合国家有关要求;菲牛蛭急性毒性试验结果表明其LD50大于10 g/kg,未见明显毒副作用.结论:菲牛蛭含有较高的氨基酸含量,而重金属和有机氯、有机磷农药残留量则较低,急性毒性试验LD50＞10 g/kg,可考虑作为一种新药用资源而加以研究利用.
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广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA的克隆与序列分析
目的 克隆广西菲牛蛭水蛭素基因的cDNA,并对该基因以及氨基酸进行序列分析.方法 根据已发表的马尼拉菲牛蛭水蛭素基因cDNA设计一对引物,从广西菲牛蛭的头部提取总RNA后,采用RT-PCR扩增cDNA,将产物克隆至载体PMD-19T,PCR鉴定后进行测序.结果 广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA序列长度为251bp,编码框由83个氨基酸组成,其中包括由20个氨基酸的信号肽,以及63个氨基酸组成的成熟肽.广西菲牛蛭水素基因的氨基酸序列和已报道的广东菲牛蛭、马尼拉菲牛蛭水经素基因HM1、HM2基因的氨基酸序列相比较,同源性分别为94%,91.8%,84.7%.结论 广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA序列长度为251 by,由83个氨基酸组成.
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广西菲牛蛭消化液中抗凝物质的分离纯化
目的 从广西菲牛蛭中分离纯化抗凝物质,并对其生化性质进行测定.方法 用三氯醋酸沉析、离子交换、凝胶过滤和高效液相色谱法分离纯化广西菲牛蛭消化液中的抗凝物质,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白质的相对分子质量(Mr),用等电聚焦法测定蛋白质的等电点.结果 从广西菲牛蛭中分离出2种抗凝物质--菲牛蛭素A(BDA)和菲牛蛭素B(BDB),BDA Mr约为15 200,等电点为3.97;BDB Mr为14 600,等电点为4.61.每1 000 mL菲牛蛭消化液(含抗凝活性10 ATU/mg )可分离出BDA 630 μg,收率约为0.303%,比活为2 777.8 ATU/mg,活性收率约为27.8% ;BDB 615 μg,收率约为0.300%,比活为2 845.5 ATU/mg,活性收率约为28.4%.结论 从广西菲牛蛭消化液中分离出的BDA,BDB对凝血酶具有极强的抑制作用,具有广阔的运用前景.
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蚂蝗及其混淆品菲牛蛭的高效毛细管电泳法鉴别
目的 探求更为快捷、准确的水蛭药材的鉴定方法.方法 采用高效毛细管电泳法对蚂蝗和混淆品菲牛蛭进行蛋白多肽的分析.条件为石英毛细管 (75 μm×57 cm ),电解缓冲液为20 mmol/L,硼酸盐溶液(pH 8.5),电压为20KV,检测波长254 nm.结果 蚂蝗与菲牛蛭的高效毛细管电泳图谱之间有明显差异,重复性良好.结论 高效毛细管电泳可作为鉴定方法,用于快速准确地鉴别蚂蝗与菲牛蛭.
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我国菲牛蛭的研究概况
综述了我国菲牛蛭的地理分布、野生资源情况、生态习性和采收季节、化学成分、生物活性成分、药理学作用、分离纯化以及菲水蛭素基因的克隆和序列测定.认为菲牛蛭可作为一种新的药用资源加以研究.
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菲牛蛭提取物体外抗肿瘤活性的研究
目的 研究菲牛蛭提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用.方法 ①进行细胞毒性检测:采用MTT法检测菲牛蛭提取物对小鼠成纤维细胞L-929的细胞毒性作用,计算致半数细胞毒性所需要浓度(CC50);②采用MTT法,以半数抑制浓度(IC50)为评价抗肿瘤活性强度的指标,分别对BEL-7402人肝癌细胞、LoVo人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、TCA-8113人舌鳞癌细胞、MCG-803人胃癌细胞、NCI-H460人肺癌细胞等6种不同来源部位的常见人恶性肿瘤细胞进行抗肿瘤活性的筛选.结果 菲牛蛭提取物对正常细胞L-929的CC50值为165.159ATU/ml;对BEL-7402、LoVo、Hela、TCA-8113、MCG-803、NCI-H460肿瘤细胞的IC50值分别为2.9105,7.5605,5.2885,10.331,1.7815,2.7825ATU/ml.结论 菲牛蛭提取物对6种以上肿瘤细胞的增殖均具有抑制作用,但对正常细胞L-929毒性作用较弱.
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菲牛蛭近20年的研究进展
菲牛蛭（poecilobdella manillensis ）俗称金边蚂蟥，别名马尼拟医蛭，在动物分类上隶属于环节动物门（annelida）、蛭纲（hirudinea）、无吻蛭目（arhynchob‐dellida blanchard）、医蛭科（hirudinidae whitman）、牛蛭属（poecilobdella blanchard），是吸血类水蛭中个体较大的品种，生活在稻田、水沟、江河或池塘里，以吸吮人和脊椎动物（如牛、青蛙等）的血液为生，主要分布于我国华南的广西、广东、福建、海南和香港，国外主要分布于菲律宾、印度尼西亚、泰国、越南等［1‐3］。云南省于2013年将菲牛蛭收录到《云南省中药材标准》中，推动了菲牛蛭药材的标准化进程［4］。
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基于斑马鱼模型比较宽体金线蛭和菲牛蛭对血管新生的影响
目的:探讨及比较宽体金线蛭和菲牛蛭对Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼的血管新生影响.方法:将受精后6~8 h(6~8hpf)的胚胎暴露在含不同浓度宽体金线蛭和菲牛蛭水提取物的胚胎培养液中,每24 h更换一次含药培养液.72 hpf时,在显微镜下观察发育形态和节间血管,测定48,72 hpf孵化率,72 hpf节间血管数目、心率.结果:在抑制血管新生方面,宽体金线蛭组浓度≥30μg·ml-1时,菲牛蛭组浓度≥20μg·ml-1时,斑马鱼节间血管数目均较空白组明显减少(P<0.01).毒性方面,在48 hpf,给药组浓度≥40μg·ml-1时,宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的孵化率均较空白组明显降低(P<0.01);在72 hpf,宽体金线蛭组斑马鱼的孵化率在100μg·ml-1时较空白组明显降低(P<0.01),而菲牛蛭组斑马鱼的孵化率在80μg·ml-1就明显降低(P<0.01).宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的卵黄囊、心囊无明显水肿,脊柱未弯曲;两组心率显著降低(P<0.01),但在正常心率范围内.结论:宽体金线蛭和菲牛蛭都具有抗血管生成活性,且菲牛蛭的抗血管生成活性强于宽体金线蛭.两者对斑马鱼发育有一定程度的影响,但毒性不大.
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宽体金线蛭与菲牛蛭抗凝血酶活性及抗凝机制比较研究
目的：：比较宽体金线蛭和菲牛蛭抗凝血酶活性及对凝血途径的影响,为进一步揭示水蛭抗凝作用机制提供参考。方法：采用凝血酶滴定法、发色底物法-萃取-HPLC联合法测定水蛭对凝血酶的作用；同时采用凝固法测定其活化部分凝血活酶时间( APTT)、凝血酶原时间( PT)和凝血酶时间( TT),比较宽体金线蛭与菲牛蛭对不同凝血途径的影响。结果：凝血酶滴定法的结果表明,不同水蛭的抗凝活性顺序依次为：菲牛蛭活体冻干品>菲牛蛭清水吊干品>>宽体金线蛭清水吊干品；发色底物法-萃取-HPLC法测定不同水蛭对凝血酶抑制作用的结果表明：不同水蛭水提取物对凝血酶的作用均表现出低浓度促进,高浓度抑制,且菲牛蛭具有强烈凝血酶抑制活性,而宽体金线蛭在加入更高剂量时才表现出抑制作用,且抑制作用较弱,菲牛蛭的抗凝血酶活性远远高于宽体金线蛭；不同水蛭样品均使APTT、PT、TT延长,但是菲牛蛭活体冻干品主要延长TT,清水吊干品主要延长APTT,而宽体金线蛭使APTT、TT延长更加显著。结论：宽体金线蛭和菲牛蛭对凝血酶及凝血途径的作用很大区别。
