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基于COI条形码的中药材蛇蜕及其易混伪品的DNA分子鉴定
目的：对中药材蛇蜕及其易混伪品进行分子鉴定，以确保该中药材的临床用药安全。方法：以COI序列作为DNA条形码，对蛇蜕原药材进行DNA提取，PCR扩增和序列测定，对13个物种的68份样品进行DNA Barcoding Gap分析和系统聚类分析。结果：蛇蜕3种基原黑眉锦蛇 Elap he tae niura Cope、锦蛇Elap he c arinata（Guenther）和乌梢蛇 Zaoc ys dhumnade s（Cantor）具有DNA Barcoding Gap ，在邻接（NJ）系统聚类树上分别聚为独立一枝。结论：COI作为DNA条形码，不仅可以鉴定中药材蛇蜕的3种基原，而且可以区分蛇蜕及其易混伪品，表明DNA条形码可以用于中药材蛇蜕的鉴定。
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基于COI条形码序列的蛤蚧及其混伪品的DNA分子鉴定
目的：利用COI序列对蛤蚧药材及其常见混伪品进行DNA条形码鉴定，为蛤蚧药材鉴定提供新的方法。方法：以COI作为条形码序列，对蛤蚧实验样品进行DNA提取，PCR扩增和双向测序，用MEGA6.0对所有11个物种的103份样品进行序列比对和邻接（NJ）树构建。结果：所有实验样品均可以获得COI序列，蛤蚧COI序列种内平均K2P距离为0.005，种内大K2P距离为0.013，基于COI序列构建的NJ树中蛤蚧单独聚在一支，与其混伪品可以相互区分。结论：运用COI条形码序列能够准确鉴定蛤蚧及其混伪品，为保障蛤蚧药材临床用药安全和市场监管提供新的方法。
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鳖甲及其混伪品的DNA分子鉴定
目的:探讨快速、准确鉴定鳖甲及其混伪品的方法.方法:本文对中华鳖及其混伪品的COI序列用MEGA 4.0等软件进行遗传距离等分析,并构建中华鳖及其混伪品的NJ树.结果:中华鳖种内COI序列变异很小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离.由所构建的系统聚类树图可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成相对独立的支.结论:基于COI序列的DNA条形码技术可以很好地鉴定鳖甲及其混伪品.
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基于COI条形码序列的金钱白花蛇及其混伪品的DNA分子鉴定
目的:利用COI序列对金钱白花蛇及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别,考察其可行性.方法:对金钱白花蛇及其混伪品共4个种11份样品的COI条形码序列进行研究,分析药材正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及系统树中物种的聚类情况.结果:银环蛇COI序列种内变异较小,大K-2P距离为0.0185,与混伪品的种间序列差异较大,种间小K-2P距离为0.1561,种间小K-2P距离远大于种内大K-2P距离.由所构建的系统聚类树可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成相对独立的支,银环蛇COI序列可以明确地与混伪品区分开.结论:运用COI条形码序列能够准确鉴定金钱白花蛇的基源动物及其混伪品,为金钱白花蛇的鉴别提供了新的方法,在其他动物药基源物种鉴定中也具有较大的应用价值.
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基于细胞色素C氧化酶基因(COI)和核糖体16S rDNA条形码的中药海蛇品种鉴定
海蛇是我国名贵药材之一,新鲜捕捞的海蛇不易保存,一般立刻晒制保存,晒干后海蛇外观变化大,不宜再用外观鉴定,而基因条形码作为一种较新的分子鉴定方法则不再受外观变化困扰,适用于海蛇晒干制品的品种鉴定.该以平颌海蛇Lapemis hardwickii、环纹海蛇Hydrophis fasciatus、尖尾海蛇Aipysurus eydouxii、贝尔切海蛇 H.belcheri和兰伯特海蛇H.lamberti等5种海蛇为研究对象,通过提取实验和基因测序技术测定了这5种海蛇的COI和16S rDNA基因序列,对这些序列进行互相比对并用相似性搜索算法评价5条序列的鉴定成功率.研究显示,16S rDNA基因条形码能初步区分海蛇种属,COI基因条形码序列种内种间差异明显,能进一步区分海蛇品种.因此表明COI序列可以作为海蛇晒干制品的品种鉴定方法.
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基于COI与SRY序列建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的分子鉴别方法
为了建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的特异性PCR鉴别方法.采集不同来源的梅花鹿、马鹿鹿及其杂交鹿的鹿角或鹿茸样品共48份,其中24份为市场流通的待测样品.分别利用COI与SRY基因序列作为其父母本的鉴别标记,对已知样品的COI与SRY基因进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异鉴别引物,分别基于COI与SRY基因建立对梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸的特异PCR鉴定方法,并随机对市场流通的24份待测鹿茸样品进行鉴别分析.该实验所构建双位点特异PCR体系,基于COI的鉴别位点,可通过PCR扩增获得232 bp的梅花鹿特异片段,而产生518 bp的马鹿特异片段;而基于SRY的鉴别位点,通过PCR扩增获得803 bp的梅花鹿特异片段,而产生425 bp的马鹿特异片段.随机抽取市场流通中的24个待测鹿茸样品,经鉴定有3个样品属于马·花杂交的鹿茸样品.该实验建立对梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠.
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中药材蜈蚣及其混伪品DNA条形码鉴别研究
利用DNA条形码技术对蜈蚣药材进行鉴别,为蜈蚣药材鉴定提供新的方法.该研究以COI条形码序列为基础,对蜈蚣实验样品进行DNA提取,PCR扩增和双向测序,用MEGA6.0软件对所有5个物种的50份样品进行序列比对和邻接(NJ)树构建.结果显示实验样品均可以获得COI序列,蜈蚣药材与其混伪品COI序列种间平均K2P距离为0.222,种间小K2P距离为0.190,基于COI序列构建的邻接(NJ)树中少棘巨蜈蚣单独聚在一枝,与其混伪品可以相互区分.因此基于COI条形码序列可以准确鉴定蜈蚣及其混伪品.
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中国动物药材DNA条形码数据库
课题组联合相关研究者开展动物药材DNA条形码分子鉴定研究,并结合分析GenBank序列,采用BLAST分析防错、系统树分析防错和Barcoding Gap检验防错等方法核验序列的可靠性,构建了中国动物药材DNA条形码数据库.该库由样品数据库、序列数据库和文献数据库组成,包含800余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物种.中国动物药材DNA条形码数据库可以通过中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)进行网络访问并实现未知动物样本的DNA条形码鉴定.该研究首次构建统一的中国动物药材DNA条形码数据库,对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义.
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名贵动物药材穿山甲的DNA条形码分子鉴定研究
利用COI序列作为DNA条形码对名贵珍稀动物药材穿山甲及其混伪品进行鉴定,为穿山甲药材分子鉴定提供科学依据.该实验采用试剂盒法提取穿山甲及其混伪品的基因组DNA,通过PCR扩增和双向测序,应用CodonCode Aligner软件进行校对拼接,采用MEGA 6.0软件对所有7个物种的56份样品进行序列比对,构建邻接(NJ)树.结果表明穿山甲药材COI序列扩增成功,所构建的NJ树结果显示穿山甲及其混伪品均可明显区分.因此,基于COI序列,应用DNA条形码技术可有效鉴定名贵动物药材穿山甲及其混伪品,为其市场监管提供了新的技术手段.
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基于分子生物学特异性扩增的方法鉴别菲牛蛭
目的:通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的佳退火温度.结果:通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为佳实验引物,且确定了引物7的佳退火温度为49℃.结论:通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考.
关键词： 菲牛蛭 聚合酶链式反应(PCR) COI DNA条形码 特异性扩增 -
基于COI条形码序列的鹿茸及其混伪品的DNA分子鉴定
目的:利用COI序列对鹿茸及其混伪品进行DNA条形码鉴别,考察其可行性.方法:对鹿茸及其混伪品源自动物鹿科4属7种共14份样品的COI条形码序列进行研究,分析药材正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及系统树中物种的聚类情况.结果:梅花鹿和马鹿COI序列种内变异较小,混伪品的种间序列差异较大,种间小K-2P距离远大于梅花鹿和马鹿种内大K-2P距离.由所构建的系统聚类树可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成相对独立的支,支持率较高.基于COI序列的NJ树能够明显地看出,鹿茸与其混伪品能够明确地区分开.结论:运用COI条形码序列能够准确鉴定鹿茸的基源动物及其混伪品,本研究为鹿茸的鉴别提供了新的可行性方法.
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基于COI条形码的麝香及其混伪品的DNA分子鉴定
目的:利用COI序列对麝香及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别,研究鉴定麝香的新方法.方法:对麝香及其混伪品共7种12份样品的COI条形码序列进行研究,分析药材正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及NJ树的聚类情况.结果:麝香种内COI序列变异很小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离.由所构建的系统聚类树可以看出,麝香的正品聚在一起,支持率较高,且各物种又形成相对独立的枝,与其混伪品能够很明显区分开.结论:运用COI条形码序列能够准确鉴定麝香的正品来源及其混伪品,本研究为麝香的鉴别提供了新方法,在其他动物药品种鉴定中也具有一定的参考价值.
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海马、海龙基于COI条形码的DNA分子鉴定
目的:利用COI序列对海马、海龙及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别,考察其可行性.方法:对海马、海龙及其混伪品共14个种20份样品的COI条形码序列进行研究,分析药材的正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及系统树中物种的聚类情况.结果:海马、海龙种内COI序列变异很小比较稳定.海马、海龙及其混伪品种间COI序列变异较大,存在较多的变异位点,分析结果表明种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离,这与形态学分类的结论相一致.由所构建的系统聚类树可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成相对独立的枝,其支持率均为100,海马、海龙COI序列可以明确的与混伪品COI序列区分开.结论:运用COI条形码序列能够准确鉴定海马、海龙的基源动物及其混伪品,本研究为海马、海龙的鉴别提供了新的可行性方法,在其他动物药品种鉴定中也具有较大的应用价值.
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古尼虫草与亚香棒虫草亲缘关系初探
目的:用分子生物学方法,对古尼虫草和亚香棒虫草进行研究,对其寄主昆虫COI( cytochrome oxidase subunitⅠ,细胞色素氧化酶亚基Ⅰ)和真菌ITS(Internal Transcribed Sequence,内转录间隔区)区的基因序列进行比较,以确定两者亲缘关系.方法:在古尼虫草和亚香棒虫草性状研究的基础上,对两者来源真菌ITS区和寄主昆虫COI基因进行了PCR扩增和序列测定,对序列进行比对分析,并与GenBank核酸序列数据库中的序列进行BLAST检索比对.结果:发现古尼虫草和亚香棒虫草的来源真菌ITS区和寄主昆虫COI基因序列均有较高相似度.结论:古尼虫草和亚香棒虫草有较近的亲缘关系.
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DNA条形码技术应用于口岸吸血蠓类快速分子鉴定的研究
目的 建立口岸吸血蠓类快速分子鉴定方法,提高鉴定效率和准确率.方法 选择口岸区域采集点,采集吸血蠓类.经形态学鉴定后,单只蠓提取基因组DNA,采用自行设计的COI基因扩增引物进行扩增.PCR产物经电泳鉴定后,进行双向测序.序列经分析后,去除引物序列和不稳定序列,进行拼接.提交至NC-BI和BOLD数据库进行比对,并建立系统进化树进行验证.结果 得到12个新序列,已登录至GenBank,登录号为KF528689～ KF528700.其中台湾蠛蠓的COI序列(683 bp)填补了NCBI数据库的空白.所得序列经分析后可以将多种蠛蠓、库蠓很好地区分开.结论 本项目所建立的基于吸血蠓类COI基因的DNA条形码快速分子鉴定方法可以很好地鉴定各吸血蠓种,值得进一步推广应用.
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广东省部分地区卫氏并殖吸虫分布与DNA序列分析
目的 调查广东省卫氏并殖吸虫分布现状.方法 解剖采集自广东省从化市良口、龙门县南昆山、乐昌市大洞和平远县木溪与郭屋等5个调查点山溪的螺蛳及溪蟹,检查卫氏并殖吸虫尾蚴、囊蚴.以所获囊蚴人工感染家猫、犬,解剖查找并殖吸虫成虫.取成虫样本,进行线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ基因(COI基因)和核糖体基因第二间隔区(ITS2基因)基因序列分析,并与GenBank中现存并殖吸虫的COI、ITS2基因序列进行比对.结果 良口、南昆山、大洞、木溪和郭屋5处疫源地的第一中间宿主螺蛳鉴定均为放逸短沟蜷,其尾蚴感染率分别为0.33％、0.15％、0.058％、0.10％和0.05％；第二中间宿主溪蟹鉴定均为平和华溪蟹,其囊蚴感染率分别为100％、100％、38.09％、55.36％和65.26％.良口、南昆山、大洞、木溪和郭屋平均每只蟹检出囊蚴数量分别为79.4、105.66、9.16、16.18个和15.6个,平均每克蟹含囊蚴数量分别为11.12、7.87、0.58、0.69个及0.85个,囊蚴鉴定均为卫氏并殖吸虫.人工感染家猫、犬体内检获卫氏并殖吸虫成虫与虫卵.良口、南昆山、大洞、木溪和郭屋5处调查点卫氏并殖吸虫成虫样本COI基因序列与GenBank中的AF219379.21、AF540958.1号基因序列同源性分别为99％、99％、99％、98％、99％,ITS2基因序列与DQ836243.1、DQ351845.1、AB354217.1号同种基因同源性分别为98％、99％、98％、98％、98％.结论 广东省新发现2处卫氏并殖吸虫超高度疫源地和3处卫氏并殖吸虫高度疫源地,5地虫种间无明显差异.
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DNA条形码技术在麻蝇亚科鉴定中的应用
目的 建立麻蝇亚科种类鉴定的DNA条形码技术,以期解决麻蝇亚科雌性个体无法通过形态鉴定的问题.方法 通过对福建口岸截获的黑尾黑麻蝇、黄须亚麻蝇、褐须亚麻蝇、棕尾别麻蝇、酱亚麻蝇等标本进行PCR扩增和序列测定,与BOLD上下载的88条麻蝇亚科蝇种序列进行比对,计算遗传距离、构建系统进化树.结果 5份样本扩增获得COI的长度为658 bp,在线BLAST比对结果显示相似度99％以上,遗传距离计算结果显示种内差异0～0.015 4,种间差异0.024 9～0.153 8,系统进化树显示麻蝇亚科同种能聚在一块,Bootstrap值为1 000.结论 DNA条形码技术可以作为麻蝇亚科蝇种鉴定在形态学鉴定之外的重要方法补充.
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DNA条形码技术鉴定我国部分白蛉蛉种
目的：探讨DNA条形码技术在白蛉物种鉴定中的可行性。方法通过研究白蛉亚科3个属9个物种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列，以Kimura双参数模型进行种内种间遗传距离分析、使用邻接法构建系统发育树。结果种内平均遗传距离（0．8％）远远小于种间平均遗传距离（11．2％），同种个体聚为高支持度的单一分支。结论基于线粒体COI基因的DNA条形码可以将不同蛉种很好的区分开来，可以作为一种有效的工具在白蛉物种鉴定中应用。
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基于线粒体COI基因序列进行库蠓二囊亚属近似种的分子鉴定
目的 通过采用线粒体COI基因进行库蠓近似种分子鉴定的方法,来弥补传统形态学在种类鉴定中存在的操作繁琐、难度大等不足,从而实现库蠓近似种的快速、准确鉴别.方法 采用DNA测序的方法获得库蠓属二囊亚属的林岛库蠓(C.gaponus)、标翅库蠓(C.insignipennis)、无害库蠓(C.innoxius)、连斑库蠓(C.jacobsoni)、南山库蠓(C.lansangensis)、新竹库蠓(C.liui)、长喙库蠓(C.longirostris)、异域库蠓(C.peregrinus)等8种库蠓近似种的部分线粒体COI序列,并对其进行分子鉴定;基于Kimura 2-parameter模型分析遗传距离,同时应用MEGA 6.0软件以荒川库蠓C.arakawai为外群构建系统发育树.结果 8种库蠓COI序列长度约650 bp;遗传距离在种内和种间具有统计学差异(t=119.452,P＜0.05);系统发育树中不同库蠓种类各自构成单系(群),同种类不同地理种群聚为一支.结论 本研究证实了线粒体COI序列可用于进行库蠓近似种的分子鉴定.
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我国旋毛虫地理株遗传变异与系统发生关系的研究
目的 通过分析旋毛虫线粒体基因分子标记,研究我国旋毛虫地理株间的遗传变异与系统发生关系.方法 应用旋毛虫线粒体核糖体小亚基DNA(mitochondrial small subunit ribosomal DNA,mtSSU)和线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因(mitochondria cytochrome coxidase,COI)为分子标记,分别对我国7个旋毛虫地理株扩增后进行双向测序,利用DNAMAN软件将测序结果和GenBank中相应序列进行比对研究,并使用MEGA4.0程序包构建系统进化树.结果 PCR对7个旋毛虫地理株分别扩增出了649bp(mtSSU)和419bp(COI)的DNA片段,7个地理株的DNA片段与GenBank中T.spiralis的相应片段相比存在一定差异,其中mtSSU基因有4个变异位点(248、293、537和539位),而COI基因仅存在2个变异(273和382位),所有变异均为T-C或C-T的转换；进化树显示南阳株和云南株位于比较近的分枝,而西安株、广西株及西藏株亲缘关系较近.结论 我国7个旋毛虫地理株的遗传变异较小,亲缘关系较近.
