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背索核的研究进展
背索核(DCN)由薄束核(NG)和楔束核(NC)两部分组成,传统上认为DCN属于躯体感觉核,负责机体的精细触觉和本体感觉.近年来,大量的研究资料以及临床治疗学的经验对此观念提出修正:DCN不仅是躯体感觉核,还是重要的内脏感觉核,即该核为躯体内脏信息的整合中枢.除此之外,离体与在体相结合的研究以及膜片钳、分子生物学等新技术的广泛应用也加深并拓宽了我们对DCN功能的认识.
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神经元和胶质细胞共培养方法的建立
目的 介绍改良的Banker共培养方法,并通过膜片钳、原子力显微镜检验神经元的生长状态.方法 利用烙铁在培养皿底面滴入4个高度约为0.1 mm的石蜡,以支持盖玻片建立共培养体系.当星形胶质细胞生长至底面积70%～80%后,将胰酶消化、分离的神经元接种在盖玻片上,4 h后翻转盖玻片并移到含有星形胶质细胞的培养皿内,进行共培养,4～5 d半量换液.膜片钳记录神经元动作电位和自发性突触后电位,原子力显微镜观察培养25 d的神经元生长状态.结果 神经元长培养40 d,接种后4 h～6 d和9～13 d是两个快速增长期.膜片钳实验中,神经元能够产生动作电位,并且随刺激强度增大动作电位频率增加;能够记录到神经元的兴奋性突触后电位(EPSP)、抑制性突触后电位(IPSP)和自发性动作电位(sAP).原子力显微镜观察可见神经元胞体呈典型锥体形状,细胞表面光滑平整.结论 神经元和胶质细胞共培养方法稳定性强,容易操作,培养的神经元存活时间长、生长状态良好.
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培养鼠视皮层神经元γ-氨基丁酸激活电流的特点
目的:研究体外培养大鼠视皮层神经元GABA激活电流的特点.方法:用膜片钳记录仪采用全细胞模式记录体外培养大鼠视皮层神经元GABA激活电流.结果:大部分受检细胞可记录到明显去敏感的内向电流,且具有剂量依赖性.IGABA可被足量bicuculline完全阻断.GABAA受体的失敏恢复时间为5min.结论:体外培养视皮层神经元GABA激活电流的特点为探讨视觉形成及其发育机制提供了电生理学依据.
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单个耐钙心肌细胞的分离方法
运用膜片钳或激光共聚焦技术进行电生理学研究或影像形态与功能研究需要制备单个细胞作标本.由于单个细胞具有细胞外液易渗透、易控制膜电流及计算细胞电容、易运用荧光染料等优点,因此成功分离单个心肌细胞非常重要,但也较困难.我们依自己的实验体会,总结出以下单个耐钙心肌细胞的分离方法.
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大鼠脊髓背角胶质层神经元的"超极化反跳"现象
目的:研究脊髓背角胶质层神经元在超极化脉冲刺激下的细胞膜反应性,揭示神经元在超极化状态下膜的基本性质. 方法:在大鼠脊髓新鲜薄组织片上,利用脊髓薄片膜片钳全细胞记录技术,记录脊髓背角胶质层神经元接受超极化刺激后膜电位的变化情况. 结果:在电流钳模式下,膜电位在超极化刺激结束后,从超极化电位水平恢复到静息水平的过程中出现一个长时程的对抗回到静息水平的现象超极化反跳,该超极化反跳幅值的大值为(16.5±3.8) mV;在电压钳模式下,同时可以记录到一个对应的长时程超极化激活的外向流,该外向流的大幅值为:(45.0±2.1) pA,时程为:(475.0±0.8) ms. 该超极化反跳和超极化激活的外向流具有电压依赖性,没有时间依赖性. 结论:超极化刺激能引起大鼠脊髓胶质层神经元出现"超极化反跳",该现象是神经元在超极化状态下的基本膜特性之一.
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葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的影响
目的: 探讨葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的影响及其抗心律失常的电生理学机制. 方法: 采用Langendoff胶原酶灌注加浸泡法分离大鼠心室肌细胞,据不同细胞外灌流液将实验分5组:对照组;葛根素1.2, 2.4, 4.8和9.6 mmol/L组. 分别用膜片钳全细胞记录各组内向整流钾通道(Ik1)、瞬时外向钾通道(Ito)的电流. 结果: 在500 ms去极化的实验条件下,葛根素使不同去极化水平时的Ik1瞬间电流及稳态电流均明显下降. 随着药物剂量的增加,这种抑制作用也增强. 结论: 葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的作用主要是抑制Ik1,且抑制呈浓度依赖性.
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Loose-patch方法及其诱发的钙火花
目的:采用Loose-patch方法在心室肌单细胞上诱发出钙火花并探讨其主要特征,并与以往有关的研究结果作比较分析.方法:Loose-patch方法,即非紧密封接的细胞贴附式低阻抗膜片钳制技术和共聚焦显微镜钙成像技术相结合的方法.结果:Loose-patch方法可以较高的概率(72.2%)成功地诱发钙火花;其诱发的平均钙火花的幅度为(1.07±0.06)(单位为△F/F0,其中F0为静息时的钙荧光强度);空间范围为(1.44±0.03) μm;n=124.结论:Loose-patch方法可在保证膜上的L型钙通道与胞内相邻近的Ryanodine受体之间正常的信息耦联关系的前提下,定点诱发钙火花,并通过共聚焦显微镜钙成像技术实现实时准确记录.这对于明确钙火花的特征,准确理解兴奋-收缩耦联的微观机制有重要意义.
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大鼠背根节内两类兴奋性神经元的放电特征
目的:观察大鼠背根节(DRG)神经元兴奋性分类的放电特征.方法:在新鲜分散的中、小型大鼠背根节神经元运用全细胞膜片钳技术,观察给予胞内去极化,超极化电流刺激引起细胞放电的特征.结果:根据大鼠背根节神经元的放电特征可将它们区分为两类兴奋性.1类:神经元兴奋性与刺激强度相关,逐渐增强的去极化刺激可引发频率由低到高的动作电位.一般于超极化刺激后不产生反跳动作电位.动作电位的幅值一致,符合"全或无"定律.2类:神经元的兴奋性与去极化刺激强度关系不明显,神经元放电频率比较稳定,不随刺激强度的增强而增加,放电前后有规律的膜电位振荡.于较弱的超极化刺激后可产生反跳动作电位.动作电位的幅值不一致.结论:大鼠DRG两类兴奋性神经元各具不同的放电特征.
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应用红外可视脑片膜片钳技术研究大鼠海马CA1神经元的电生理特性
目的:建立红外可视脑片膜片钳技术,初步观察大鼠海马CA1细胞的电生理特性. 方法:应用红外微分干涉相差技术,结合脑片膜片钳记录,对健康SD大鼠海马CA1细胞电生理特性进行观察,并分析影响记录成功的主要因素. 结果:红外可视膜片钳技术可实时观察到脑细胞形态结构,有助于对封接过程的判断. 大鼠海马脑片CA1细胞可分为多种类型. 生理条件下,锥体细胞处于静息或自发低频状态,具有膜阻抗低、频率适应现象、后放电等特点;中间神经元自发放电频率高、膜阻抗高、无频率适应现象. 结论: 红外可视膜片钳技术克服了盲法膜片钳的缺陷,实现了实时、直视的特点,可操作性强. 应用该项技术,可根据电生理特性对大鼠海马CA1区细胞作出初步分类.
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耐钙心肌细胞的分离及基本电生理特性
目的探讨分离单个心肌细胞的方法并进行基本电生理指标测定.方法改进的Langendorff灌流法及膜片钳全细胞记录法.结果单个心室肌细胞静息电位为(-85±2.3)mV(n=10),记录到单个心室肌细胞典型的L型钙电流特性.结论用该方法分离的细胞具有耐钙性和正常电生理特性.
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模拟失重大鼠心肌细胞ICa对β-受体激动剂的反应性
目的研究模拟失重大鼠心肌细胞钙电流（ICa）对β-肾上腺素受体激动剂的反应性变化. 方法用尾部悬吊大鼠模型模拟失重（4 wk），胶原酶分离心肌细胞，用膜片钳全细胞方式记录单个心肌细胞的膜电容和ICa等. 给予β-肾上腺素受体激动剂（异丙肾上腺素），记录观察ICa的反应性. 结果对照组与悬吊组的ICa密度无明显差别（P>0.05），ICa电流密度-电压曲线基本一致；加入异丙肾上腺素后，两组ICa密度均明显增大，但是两组的增加幅度不同，悬吊组的增加幅度（84.3±8.2)%明显小于对照组（109.3±7.9）%（P<0.05）. 结论模拟失重4 wk大鼠心肌细胞的ICa密度无明显改变；模拟失重后心肌细胞ICa对β-肾上腺素受体激动剂的反应性降低.
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异氟醚和安氟醚对大鼠海马神经元自发放电活动的影响
目的研究吸入麻醉剂安氟醚和异氟醚对大鼠海马神经元自发放电活动的影响.方法将新生SD大鼠迅速断头取全脑,置于通入1.36 g·L-1(95%)O2和0.098 g·L-1(5%) CO2混合气体的4℃人工脑脊液(ACSF)中,再用振动切片机切制成300～400 μm 含海马的脑薄片,然后用全细胞膜片钳记录技术,分别观察不同浓度的安氟醚和异氟醚对海马神经元自发放电频率的影响.结果安氟醚和异氟醚都能浓度依赖性地抑制海马CA1区神经元放电频率.安氟醚(0.2 g·L-1～ 0.6 g·L-1)和异氟醚(0.12 g·L-1～ 0.36 g·L-1)能使海马CA1区神经元放电频率产生明显的抑制作用,冲洗5 min后,放电频率可逐渐恢复到给药前水平.结论安氟醚和异氟醚对大鼠海马CA1区神经元自发放电活动可产生明显可逆性的抑制作用,表明海马CA1区是吸入麻醉剂在中枢神经系统中的重要作用部位.
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心脏传导阻滞SCN5A基因L1001Q突变体构建和功能研究
目的 对作者发现的一个中国3代人心脏传导阻滞家系SCN5A基因新突变L1001Q,构建突变表达载体,利用分子生物学方法和全细胞膜片钳技术观察L1001Q突变的功能.方法 一步定点诱变法构建pEGFP-L1001QSCN5A突变体;激光共聚焦和Western blotting技术检测突变蛋白定位和表达;全细胞膜片钳技术观察突变体钠电流.结果 野生型和L1001Q突变均表达在细胞膜上,且表达量无明显变化.二者大激活电流分别为(148.34±0.77) pA/pF和(132.59±0.96)pA/pF(P＞0.05),L1001Q突变半失活电压V1/2为(-73.25±0.87)mV,较野生型正向转移约3.5 mV[V1/2为(-76.71±0.73)mV,P＜0.05],L1001Q突变失活后恢复时间常数较野生型稍减小,差异无统计学意义(WT tau=16.8 ms,L1001Qtau=14.1ms,P＞0.05).结论 L1001Q突变未影响钠通道蛋白的表达和转运,主要通过改变钠通道门控特性引起钠通道功能减弱进而导致心脏传导阻滞.
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Cav1.3 L-型钙通道K228E突变体的构建及功能研究
目的 通过构建Cav1.3基因K228E突变,观察K228E突变对L-型钙通道电生理特性及蛋白表达和转运的影响.确定钙通道α1亚基结构域ⅠS4段上N-端带正电荷的氨基酸对该通道电生理学特性的作用,从而为创建钙通道起搏器奠定基础.方法 ①一步法快速定点诱变构建Cav1.3基因K228E突变体的真核表达载体;②膜片钳观察突变钙通道电流,激光共聚焦技术观察突变钙通道蛋白在细胞内的表达和定位.结果 ①检测表达于HEK293细胞上的L-型钙电流:转染野生型Cav1.3质粒和相关亚基质粒,可检出L-型钙电流,其半激活电压V1/2=(-36.56±2.08)mV、半失活电压V1/2 =(-42.93±0.14)mV(5mmol Ba2+);而转染K228E-Cav1.3质粒和相关亚基质粒的HEK293T细胞上未检测到钙电流;②检测K228E突变通道蛋白在细胞内的表达和定位:转染野生型和突变型Cav1.3质粒及相关亚基质粒,48h后观察到野生型与突变型钙通道蛋白在细胞膜上都有表达.结论 Cav1.3基因K228E突变虽不影响L-型钙通道蛋白质的表达与转运,但却不表达钙通道电流,是一种功能丧失性突变.
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交界区逸搏节律的细胞及电生理学基础
目的 探讨交界区逸搏节律的细胞及电生理学基础.方法 组织切片Masson染色;酶解分离单个心肌细胞;单细胞膜片钳技术研究具有自律特性细胞的动作电位特征.结果 组织学研究发现家兔致密结及房室结后延伸细胞组成具有异质性且呈规律性排列;单细胞形态学观察可见不同于普通心房肌细胞的起搏细胞(PC)、过渡细胞α(TCα)和β,且PC和TCα呈现自发规律性收缩.三种细胞相比较,在动作电位波形、大舒张电位、0期除极速度、动作电位复极至90%时程(APD90)、舒张期自动除极速率(VDD)、动作电位超射值及幅值方面,PC和TCα之间除APD90和VDD外,其他各指标差异无统计学意义(P>0.05).TCβ与PC、TCα分别相比,各项指标差异均有统计学意义(P均<0.05). 结论家兔致密结及房室结后延伸具有自律特性的PC及TCα可能是交界区逸搏节律的细胞学基础.
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自发性高血压大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道的活性及表达改变
目的 观察自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats, SHR)与Wistar-Kyoto(WKY)大鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)大电导钙激活钾通道(large conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)电流及通道α亚单位表达的差异.方法 实验采用16～18周龄SHR(N=20)及WKY(N=20)大鼠,尾套法测量大鼠尾动脉血压;胶原酶分离VSMCs,全细胞膜片钳技术记录全细胞总钾电流密度及BKCa电流;激光共聚焦观察BKCaα亚单位在VSMCs胞膜及胞质内的分布.结果 SHR较WKY大鼠的收缩压与舒张压均有显著升高(P<0.05);全细胞外向钾电流密度及BKCa电流密度均有显著性增加(P<0.05);SHR的BKCaα亚单位在胞膜及胞质内均有广泛分布,SHR大鼠VSMCs胞质与胞膜的荧光强度较WKY大鼠均有显著性升高(P<0.05).结论 BKCa电流密度增加可能与BKCa通道α亚单位的表达增多有关,SHR大鼠VSMCs的BKCa电流密度增加引起血管的舒张,不能抵消平滑肌细胞的肌源性收缩可能是导致高血压的发生机制之一.
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豚鼠心房肌细胞的分离及其电生理特性
目的建立单个心房肌细胞的急性分离方法并记录其电生理特性.方法采用改进的酶解分离法分离单个细胞并经膜片钳全细胞记录法进行鉴定.结果采用本方法分离出典型的豚鼠单个心房肌细胞并记录到豚鼠心房细胞毒蕈碱型钾电流及L-型钙电流.结论此方法简单、快捷,分离出的心房肌细胞具有正常的电生理特性.
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针灸调节缺血性中风病非选择性阳离子通道的思考
从非选择性阳离子通道(NC)在缺血性中风病中的作用及缺血性中风病的发病机制,酸感受离子通道(ASIC)与磺酰脲类受体1(SUR1)在缺血性中风中表达的意义角度分析了针灸治疗缺血性中风病的可能机制,提出利用激光共聚焦、膜片钳等技术可望进一步揭示针灸治疗缺血性中风病的作用机制.
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宝宝乐口服液对瘦素调节VMN神经元mIPSC的影响
目的 观察中药宝宝乐口服液对瘦素调节下丘脑腹内侧区(VMH)神经元mIPSC的影响.方法 利用红外可视脑片膜片钳技术记录对照组、模型组和治疗组3组实验大鼠VMN神经元的mIPSC,取给药前1 min和给药后1 min的数据,分析瘦素及宝宝乐口服液对mIPSC频率的影响.结果 瘦素使3组大鼠大部分VMN神经元的mIPSC频率减少,小部分VMN神经元的mIPSC频率增加.mIPSC频率抑制或增加的程度在3组间无显著性差异(P＞0.05),但模型组mIPSC频率抑制的神经元比例显著多于对照组(P＜0.05),而mIPSC增加的神经元显著少于对照组(P＜0.05),且模型组mIPSC对瘦素无反应的神经元比例也减少;治疗组中mIPSC频率抑制或增加的程度恢复正常.结论 厌食模型动物VMN对瘦素的整体敏感性增加,使VMN发出过度的饱信号,从而产生厌食;宝宝乐口服液可以纠正和改善这一病理过程,这应当是小儿厌食发生发展及运脾复方作用的中枢机制之一.
关键词： 宝宝乐口服液 微小抑制性突触后电流 下丘脑腹内侧核 膜片钳 -
瘦素对幼龄厌食大鼠VMN神经元膜电位改变的影响
目的:观察瘦素对幼龄厌食大鼠下丘脑腹内侧核(VMN)神经元膜电位的影响.方法:利用红外可视膜片钳技术记录对照组、模型组两组动物VMN神经元的膜电位,分析瘦素对VMN神经元膜电位的影响.结果:瘦素使两组动物大部分神经元去极化,组间比较无显著性差异.少数VMN神经元在瘦素作用下超极化,组间比较亦无显著性差异.然而,模型组VMN神经元的膜电位被瘦素去极化而导致自发放电增加的细胞比例增多,被瘦素超极化而自发放电减少的细胞比例减少,对瘦素无反应的细胞比例也减少.结论:造模因素可能通过提高VMN对瘦素的整体敏感性,使VMN发出过度的饱信号,从而产生厌食,这应当是小儿厌食发生发展的中枢机制之一.
