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多巴胺对大鼠前额叶皮层锥体神经元NMDA受体通道的影响
[目的]探讨多巴胺(DA)对前额叶皮层锥体神经元谷氨酸/N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的调节作用.[方法]使用细胞贴附式膜片钳技术进行单通道记录,观察不同浓度DA对急性分离的前额叶皮层锥体神经元NMDA受体通道电流的影响.[结果]结果表明:当DA浓度为0逐渐升高到60 μmol/L时,NMDA受体通道的电流幅度由(2.78±0.68)pA升高到(5.42±1.26)pA;短开放时间常数变化不明显,但长开放时间常数由(13.59±1.26)ms升高到(36.19±1.17)ms;长关闭时间常数由(19.73±1.46)ms降低到(2.67±0.75)ms;通道开放概率由0.25±0.09升高到0.56±0.25;当DA浓度继续由60 μmol/L升高到100 μmol/L时,NMDA受体通道的电流幅度回落到(3.56±0.79)pA,长开放时间常数回落到(14.40±1.37)ms;长关闭时间常数恢复为(17.74±1.79)ms,与对照组比较无显著性变化;通道开放概率由0.56±0.25降低到0.17±0.08.[结论]DA可以影响前额叶皮层锥体神经元NMDA受体通道的活动,而且具有浓度依赖性,低浓度有明显促进作用,高浓度则促进作用减弱,甚至有抑制作用.
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自发钙火花与诱发钙火花的形态特征比较
[目的]钙火花是胞内基本的钙释放事件,既可以在静息的状态下随机产生,也可以被通过L-型钙通道内流的少量钙离子诱发产生.对钙火花特征和产生机理的研究极大地深化了我们对兴奋-收缩耦联过程的理解.本研究的目的旨在比较同一条件下自发钙火花和由loose-patch方法诱发的可以准确测量的钙火花之间在形态特征上的异同,以加深我们对钙火花的认识.[方法]激光共聚焦显微镜线扫描成像技术可记录到加载有荧光染料fluo-4的成年大鼠心肌细胞中随机产生的自发钙火花;而非紧密封接膜片钳技术与激光共聚焦显微镜线扫描成像相结合的方法(1oose-patch方法)可准确记录诱发钙火花.[结果]总体上,在相同条件下共聚焦显微镜线扫描方式记录到的自发钙火花与诱发钙火花的基本特征相似;但诱发钙火花的幅度高于自发钙火花的幅度(1.00±0.05)vs(0.80±0.06),P＜0.05),而空间扩散范围则小于自发钙火花的空间范围(1.35±0.05)μmvs(1.94±0.08)μm,P＜0.05).[结论]自发钙火花和诱发钙火花因其记录方法不同而在形态特征上有不同表现,这对于正确分析钙火花数据和准确理解胞内钙信号的实质有重要意义.
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小干扰 RNA 对大鼠心房超快激活延迟整流钾通道的影响
目的：探讨小干扰RNA（siRNA）对大鼠心房超快激活延迟整流钾通道（Ikur）的影响。方法体外转录法合成针对大鼠心房肌细胞Ikur通道的siRNA，将原代培养的心房肌细胞随机分为6组：空白对照组、阴性siRNA对照组、siRNA序列1组、siRNA序列2组、siRNA序列3组及胺碘酮组。空白对照组加入DMEM／F12培养基，阴性siRNA对照组、siRNA序列1组、siRNA序列2组及siRNA序列3组分别转染终浓度为20 nmol／L的阴性对照siRNA、siRNA序列1、siRNA序列2及siRNA序列3，胺碘酮组加入终浓度为3μmol／L的胺碘酮，6 h后各组加入10％的胎牛血清继续培养，48 h后以膜片钳记录Ikur电流。结果阴性siRNA对照组及胺碘酮组的Ikur峰值电流密度与空白对照组相比均差异无统计学意义，siRNA各组均可使Ikur峰值电流密度显著降低（P＜0.05），以siRNA序列1组明显。针对大鼠心房肌细胞Ikur基因编码区起始位点453的siRNA对该通道有佳的抑制作用。结论 siRNA可高效抑制Ikur，有可能作为治疗心房颤动的潜在手段。
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髓袢升支粗段管周膜钾通道电流特性的研究*张成标1
目的 研究肾脏髓袢升支粗段管周膜钾通道的类型及其电流特征.方法 应用单通道膜片钳技术记录大鼠肾脏髓袢升支粗段管周膜钾通道电流.结果 在髓袢升支粗段上皮细胞的管周膜可记录到多种单通道钾电流.其中,50pS、70pS和100pS 3种钾通道占90%以上,不同类型钾通道的电流大小、开放概率及开放时间和关闭时间不同.结论 髓袢升支粗段管周膜存在不同类型的钾通道,这些通道具有不同的电流特性.
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银杏内酯B诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的功能
探讨银杏内酯B诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生理功能.方法取扩增5～10代的大鼠骨髓MSCs,40 mg/L银杏内酯B诱导1周后,用膜片钳全细胞记录方式检测细胞内外的离子通道电流,步阶刺激从-70 mV到+60 mV,步阶10 mV.结果 6例银杏内酯B诱导后的神经元样MSCs的全细胞电流,除可见钾电流Ik外,还可见外向整流IA,类似于神经元对照.结论银杏内酯B诱导的MSCs,不仅具有神经细胞的外形和免疫学特征,而且具有神经元的基本电生理功能.
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对吸入麻醉药敏感性不同的果蝇幼虫脑神经元钙激活钾电流的研究
目的 神经元的兴奋性受钙激活钾电流(IKCa)调节,利用膜片钳技术,研究对吸入麻醉药具有不同敏感性的果蝇幼虫脑神经元的IKCa.方法 分离制备对吸入麻醉药敏感(S)、耐药(R)和野生(H)果蝇品系脑神经元,以膜片钳技术记录其全细胞IKCa.结果 在果蝇晚三龄幼虫脑神经元上只记录到外向钾电流,未见其他电流成分.三品系脑神经元膜电容(细胞大小)差异无显著性(P＞0.05),而全细胞IKCa峰值差异有显著性:耐药＞野生＞敏感(P＜0.05).结论 果蝇幼虫脑神经元IKCa峰值在三品系之间差异有显著性,这种差异可能解释三品系果蝇的不同耐药特性.
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心肌细胞分离方法的改进及其钾电流的观察
目的:探索建立简单可靠的心肌细胞的酶解分离方法,提高细胞存活率和膜片钳实验成功率.方法:采用Langendorff装置,无钙液和胶原酶P二步灌流法分离心肌细胞.显微镜下观察细胞形态结构,并应用膜片钳全细胞技术记录大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流.结果:心肌细胞存活率高,形态结构良好,可成功记录出瞬时外向钾电流.结论:通过改进的分离方法获得的心肌细胞存活率高,具有正常的电生理特性.
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耳蜗血管纹对内淋巴电位的影响及其意义
血管纹是耳蜗内代谢活跃的组织,对维持内淋巴液的高钾低钠状态及耳蜗内淋巴电位有重要的作用,耳蜗内环境的稳定和正常的内淋巴电位是听觉产生过程中的重要环节,内耳必须维持内环境的相对稳定才能保证正常的生理功能.随着免疫组织化学技术、内耳螺旋韧带解剖技术的发展和完善以及膜片钳等技术在该领域中的应用,内耳血管纹已成为听觉机制研究的重要内容之一.
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柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠钠通道稳态失活及再恢复的影响
目的 观察柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠心室肌细胞膜钠通道电流及钠通道稳态失活及再恢复的影响,寻求该药治疗心律失常的分子细胞学机制.方法 将所有大鼠随机分为假手术组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组、胺碘酮组各10只,建立缺血性心律失常动物模型,酶解法分离心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录各组钠通道电流(INa)的变化.结果 各组细胞Ⅰ～Ⅴ曲线均在-70 mV时激活,-20 mV时出现峰值,+40 mV出现反转,组间比较,以胺碘酮组和中药高剂量组Ⅰ～Ⅴ曲线较低;各组INa峰值比较,中药高剂量组和胺碘酮组均较模型组明显下降(P＜0.01),两组组间比较,差异无统计学意义(P＞ 0.05).中药高剂量组和胺碘酮组INa稳态失活曲线较模型组有明显左移趋势;各组INa半数失活电压V0.5比较,中药高剂量组和胺碘酮组较模型组明显降低(P＜0.01),两组组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).中药高剂量组和胺碘酮组INa灭活后再恢复曲线较模型组有明显下移趋势;各组在时间间隔为45、95、145 ms时INa恢复程度比较,中药高剂量组和胺碘酮组较模型组明显降低(P＜0.01),两组组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 柴胡三参胶囊能够结合钠通道失活态并对其产生抑制作用,延缓钠通道失活后再恢复,这可能是其抗心律失常的机制之一.
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大鼠肝星状细胞钙激活钾通道的表达及其意义
活化的肝星状细胞是肝纤维化形成的关键细胞,其收缩是肝纤维化早期门静脉高压形成的基础,而钙激活钾通道是该细胞膜上的离子通道,它与细胞的活化功能有关.我们观察了肝星状细胞膜上该通道的特性,现报道如下.
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钙耐受大鼠心肌细胞分离方法研究
目的:探讨钙耐受大鼠心肌细胞的快速、高效分离方法.方法:采用自行改进的 Langendorff 心脏灌流装置,逆行主动脉恒流灌注获得单个耐钙心肌细胞,KB液温育后以全细胞膜片钳方式记录离子流.结果:分离所得70%存活心肌细胞有80%为钙耐受心肌细胞,可记录到典型的瞬时外向钾电流.结论:根据灌注压力变化掌握消化时间,控制好细胞分离过程的各种因素,能够获得大量具有正常电生理特性的钙耐受心肌细胞.
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新生大鼠海马神经元癫痫样放电模型的初步研究
目的:研究"无镁细胞外液"诱导海马神经元产生癫痫样放电形式,建立离体癫痫模型.方法:采用24h新生Wistar大鼠,取海马神经元原代培养,神经元特异性烯醇化酶Neuron specific enolase,NSE)免疫荧光鉴定神经元.体外培养至第9d时,用"无镁细胞外液"处理3h,使用全细胞膜片钳技术记录神经元在相应时间点的放电情况.结果:通过鉴定可见,所培养的海马神经元纯度接近100%.在"无镁细胞外液"处理3h后致恢复正常细胞培养液培养24h,神经元仍存在自发的"癫痫样放电".结论:采用本方法体外培养的海马神经元在"无镁细胞外液"的作用下可形成稳定的癫痫样放电,为今后进行癫痫发病机制的研究提供了一种的理想模型.
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汉防己碱对大鼠皮层神经元钙通道的阻滞作用
在急性分离的大鼠大脑皮层神经元上,用膜片钳单通道记录技术研究汉防己碱(Tet)对电压依赖性钙通道的影响.结果表明,Tet 7.5μ mol/L、15μ mol/L和30μmol/L可浓度依赖性抑制大鼠皮层神经元膜L-和N-型电压依赖性钙通道,使其开放时间缩短,关闭时间延长,开放概率降低,从而降低钙内流,其对L-型钙通道的作用与钙通道阻滞剂Verapamil相似但较弱.Tet的多种药理作用可能与其阻滞钙通道有关.
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急性分离大鼠心房肌细胞方法的改进及对钾、钠、钙电流的记录
目的:介绍1种改进的成年SD大鼠心房肌细胞分离方法.方法:SD大鼠麻醉后,快速取出心脏,将主动脉结扎在Langendorff灌流装置上,无钙台式液灌流5 min后换用酶液灌流10～12 min,剪取心耳组织于KB液中剪碎并吹打,200目细胞筛网过滤,将细胞滤液500 r离心2 min,梯度复钙后将细胞悬液置于4℃冰箱中静置1h,应用全细胞膜片钳技术记录大鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)、快钠电流(INa)以及L型钙电流(ICa-L).结果:本方法分离出的心房肌细胞存活率高,结构完整,具有良好的耐钙性,可成功记录出Ito、INa、ICa-L.结论:改进的实验方法可获得大量耐钙心肌细胞,并具有正常的电生理特性.
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膜片钳技术在成年大鼠海马脑片应用的初步研究
目的:制备成年大鼠海马脑片,使其适应于膜片钳全细胞记录,并观察海马锥体神经元的电生理特性.方法:选200 g左右的成年SD大鼠,雌雄不拘,10％水合氯醛腹腔注射麻醉,四肢固定,剪开胸腔,夹闭下腔静脉,以0℃切片液进行心脏灌注,断头,取下全脑,置入0 ℃切片液中冰镇3 min,再修块,切片,厚度约350 μm,移入37℃预热的人工脑脊液中孵育1h后,转入23℃水浴中孵育30 min备用.倒置相差显微镜和红外微分干涉相差显微镜观察脑片的神经元形态;全细胞膜片钳记录脑片神经元的电生理学特性.结果:海马CA1区神经元光泽度好,立体感强且突起明显；在进行膜片钳全细胞记录时,封接顺利,并且可以记录到电流和动作电位的变化图形.结论:本方法制备的成年大鼠脑片,可以耐受离体后缺血缺氧造成的损伤,保持电生理活性而适应膜片钳全细胞记录模式.
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低龄扩张型心肌病鼠心室肌细胞钠电流变化的初步研究
目的:探究阿霉素诱导的低龄鼠扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)模型中心室肌细胞钠电流(sodium current,INa)的变化.方法:将40只健康的两周龄SD大鼠随机平均分为DCM组(n=20)和对照组(n=20).DCM组予腹腔注射阿霉素1 mg/kg每周2次,连续6周,诱导建立DCM模型,对照组给予等量生理盐水腹腔注射,以酶解法分离得到单个心室肌细胞,通过全细胞膜片钳技术记录INa、电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)曲线和钠通道激活、失活和复活的变化情况.结果:与对照组比较,DCM组INa呈电压依赖性减小,Ⅰ-Ⅴ曲线上移,INa电流密度明显下降[(47.370±4.118) pA/pF vs.(64.310±3.278) pA/pF,P=0.003];钠通道激活过程减慢,稳态激活曲线右移,半数稳态激活电压明显升高[(-48.441±0.966) mV vs.(-55.132±0.945)mV,P=0.000];失活过程加快,稳态失活曲线左移,半数稳态失活电压降低[(-98.490±1.152) mV vs.(-90.700±1.983) mV,P=0.003];稳态复活曲线与对照组相比无统计学差异(P=0.617).结论:阿霉素诱导的低龄DCM模型鼠心室肌细胞INa电流密度显著减少,钠通道激活过程减慢,失活过程加快,降低了INa,DCM中传导阻滞的发生可能与此有关.
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BK通道对大鼠膀胱Cajal间质细胞兴奋性的调控作用
目的 观察BK通道在大鼠膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)中的表达,探讨其对膀胱ICCs的调节功能.方法 健康雌性清洁SD大鼠48只,Western blot和免疫荧光双标观测膀胱ICCs BK通道表达情况,膜片钳记录膀胱ICCs BK通道电流,激光共聚焦检测膀胱ICCs钙内流.结果 膀胱ICCs表达起主要功能的BK通道α、β1亚基,记录到ICCs上BK通道外向电流.通道特异性阻断剂蝎毒素(IBTX)可明显抑制膀胱ICCs细胞BK电流,+80 mV下药物作用后相对电流由(23.627±3.897) pA降低为(3.603±1.885) pA(P ＜0.05).IBTX可增加膀胱ICCs钙离子内流,胞内钙荧光强度(F1/F0)从(1.00±0.07)增加到(1.84±0.45),(P＜0.05).结论 膀胱ICCs表达BK通道,阻断BK通道可增加膀胱ICCs的兴奋性.
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分化早期胚胎大鼠神经干细胞电生理特征
目的 探索分化早期神经干细胞的电生理特征.方法 分离培养胚胎大鼠海马神经干细胞.应用膜片钳全细胞记录技术检测神经干细胞和分化早期(1～3 d)神经细胞的电压门控离子电流.结果 未分化的神经干细胞不表达内向钠离子电流,而诱导分化1 d的神经细胞即表达内向性钠离子电流,但不能诱导产生动作电位.神经干细胞和分化早期的神经细胞均表达两种类型的外向钾离子电流,并表达内向T-型钙电流.结论 钠离子电流的功能性表达是神经干细胞退出细胞周期开始分化的标志.分化早期是神经干细胞离子通道发育过程的重要阶段.
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BRL-37344对豚鼠心肌细胞ICa-L、Ito的影响
目的 为研究β3肾上腺素能受体介导的心脏生物学效应--β3肾上腺素能受体激活后心肌细胞电生理活动的变化.方法 以原代培养的豚鼠心肌细胞为对象, 采用全细胞膜片钳技术记录心肌细胞孵育β3肾上腺素能受体激动剂4-[-[2-hydroxy-(3-chlorophenyl)ethyl-amino]propyl]phenoxyacetate(BRL-37344; BRL)5~10 min前后ICa-L,Ito(L型钙离子通道和瞬时外向钾通道)的变化.结果 显示10-6 mol/L的BRL显著增强豚鼠心肌细胞的Ito,上移I-V曲线;去极化刺激到+80 mV时,电流密度从(6.11±1.03) pA/pF上升到(8.46±2.07) pA/pF(n=6,P=0.013064).10-6 mol/L的BRL显著增强豚鼠心肌细胞的ICa-L,为对照组的(2.30±0.75)倍(n=5,P=0.0063);去极化刺激到+10 mV时,电流幅度从(89.25±17.83) pA上升到(205.00±72.24) pA.结论 BRL-37344可增强豚鼠心肌瞬时外向钾电流和L型钙电流,进而调控心脏的活动.
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神经病理性痛大鼠背根神经节P2X3受体表达及电生理学特性的改变
目的 观察坐骨神经缩窄性损伤(CCI)致神经病理性痛后大鼠背根节神经元P2X3受体的表达和电生理学特性的变化.方法 应用免疫组化技术观察CCI后不同时间相应节段(L4、L5、L6)脊髓及背根神经节P2X3受体表达的变化;全细胞膜片钳技术观察CCI后不同时间L4、L5、L6节段背根节神经元ATP反应电流的变化.结果 CCI后7、14 d,损伤同侧L4、L5、L6节段背根节P2X3免疫阳性神经元数量明显增加,而且染色加深,相应节段的脊髓背角浅层P2X3免疫反应性亦明显增加.CCI后7、14 d,损伤同侧相应节段背根节产生ATP快反应电流的细胞数量明显增加,电流幅度亦增强.应用非选择性P2X受体拮抗剂Suramin能明显抑制ATP反应电流.结论 坐骨神经缩窄性损伤致神经痛后同侧对应节段的背根节神经元P2X3受体表达明显增加,ATP快反应电流明显增强.
