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采用膜片钳技术观察3种中药复方含药血清对大鼠心室肌细胞L-型钙通道的作用
目的:采用膜片钳技术观察3种中药复方含药血清对大鼠心室肌细胞L-型钙通道的作用,探索膜片钳技术和血清药理学实验相结合的的可行性和分析方法.方法:采用血清药理学方法获得大鼠空白血清和3种中药复方制剂(芪苈强心胶囊、参松养心胶囊和莲松异搏停片)含药血清,应用急性酶解分离法获得大鼠的单个心肌细胞,使用膜片钳技术记录L-型钙通道电流,观察给药这些血清灌流前后L-型钙通道电流的变化.结果:(1)给予不同稀释浓度(1∶10;1∶5;1∶4;1∶2)的空白血清前后,钙通道电流峰值无明显变化.(2)与空白血清比较,芪苈强心胶囊(0.37g/kg灌胃,以下同)含药血清可明显增高电流峰值幅度,而参松养心胶囊(0.8g/kg灌胃)和莲松异搏停片(0.8g/kg灌胃)含药血清可明显降低电流峰值幅度.(3)空白血清可使钙通道电压电流曲线和稳态激活曲线左移;与空白血清比较,芪苈强心含药血清可使电压电流曲线下移,稳态激活曲线左移.(4)空白血清灌流后钙通道稳态失活曲线和失活恢复时间曲线皆无明显改变,芪苈强心含药血清可以提高了钙通道失活后恢复幅度和恢复时间常数,对稳态失活曲线无明显影响.结论:采用膜片钳技术和血清药理学实验相结合的方法能够观察中药复方对心肌细胞L～型钙通道的作用和作用特点.
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茜草素增强Wistar大鼠平滑肌细胞BKCa介导的外向电流舒张肾叶间动脉
目的:研究茜草素对Wistar大鼠肾叶间动脉及其平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(Large Conductance Calcium Activated Potassium Channels;BKCa)的影响.方法:压力型小动脉测量仪用于观察给予茜草素前后肾叶间动脉血管直径的变化;全细胞膜片钳技术用于研究茜草素对离体的Wistar大鼠肾叶间动脉平滑肌细胞BKCa介导的外向电流的调节作用.结果:(1)茜草素(10-7～3×10-5 mol/L)舒张肾叶间动脉(P＜0.01);(2)茜草素(104～3×10-5 mol/L)增强Wistar大鼠肾叶间动脉平滑肌细胞外向电流(60 mV)呈浓度依赖性(P＜0.05);(3)在0 mV～60 mV,茜草素(10-5mol/L)增强Wistar大鼠肾叶间动脉平滑肌细胞外向电流呈电压依赖性(P＜0.05);(4) TEA(10-4 mol/L)阻断茜草素(10-5 mol/L)增强的肾叶间动脉平滑肌细胞外向电流(60 mV) (P＜0.01);(5) 10-7mol/L的BKCa阻断剂伊比利亚毒素(ibTX)阻断茜草素(10-5 mol/L)对肾叶间动脉平滑肌细胞外向电流(60 mV)的增强作用(P＜0.01).结论:茜草素通过激活更多BKCa开放促进钾离子外流,引起Wistar大鼠肾叶间动脉平滑肌细胞超极化,舒张肾叶间动脉血管.
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大黄素激活BKCa通道舒张大鼠脑基底动脉
目的:研究大黄素对脑基底动脉平滑肌细胞BKCa通道电流的作用.方法:应用全细胞膜片钳技术在离体大鼠脑基底动脉平滑肌细胞上,研究大黄素对BKCa通道电流的调节机制.结果:大黄素增强大鼠脑基底动脉平滑肌细胞外向电流,10-5 mol/L大黄素使脑基底动脉平滑肌细胞外向电流(+ 60mV)增加1.33±0.08倍(n=6,P＜0.05);10-2 mol/L四乙胺(tetraethyl ammonium;TEA)可阻断大黄素的增强作用(n=6,P＜0.01);无钙外液孵育30分钟后,给予10-5 mol/L大黄素,脑基底动脉平滑肌细胞外向电流不再增加(n=6,P ＞0.05);10-5 mol/L尼莫地平(nimodipine)阻断大黄素对平滑肌细胞BKCa通道电流的增强作用(n=6,P＜0.05);在电极内液加入钙离子螯合剂BAPTA-AM后,给予10-5 mol/L大黄素,脑基底动脉平滑肌细胞外向电流不再增加(n=6,P＞0.05).结论:大黄素激活BKCa通道,钾离子外流.
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环维黄杨星D-甲醇结晶体对大鼠心室肌细胞内向整流钾电流的影响
目的:观察环维黄杨星D(Cyclovirobuxine D,CVB-D)-甲醇结晶体溶液对大鼠单个心室肌细胞内向整流钾电流(inward rectifier current,IK1)的影响.方法:Langendorff灌流系统灌流大鼠离体心脏,急性酶解法获得单个心室肌细胞;全细胞膜片钳技术分别记录对照组、药物组及洗脱组的IK1曲线.结果:对于大鼠心肌细胞,在钳制电位-100 mV时,给予低浓度(4×10-4g/L)、高浓度(4×10-3g/L) CVB-D-甲醇结晶体溶液后,IK1内向电流峰值和内向电流稳态值与给药前相比均明显降低,IK1外向电流峰值也明显受到抑制.使用细胞外液灌流洗脱药液后,与给药后相比IK1内向电流峰值和内向电流稳态值均升高,IK1外向电流峰值升高显著.结论:4×10-4g/L组和4×103g/L组CVB-D-甲醇结晶体溶液对IK1内向电流成分和外向电流成分均具有可逆性抑制效应,这可能是其具有延长动作电位时间与抗心律失常作用的药理机制之一.
关键词： 环维黄杨星D-甲醇结晶体 Ik1 动作电位 膜片钳 心律失常 -
环维黄杨星D对豚鼠心室肌细胞膜电位的影响
目的:观察环维黄杨星D(Cyclovirobuxine D,CVB-D)一甲醇结晶体溶液与CVB-D原料溶液对豚鼠单个心室肌细胞动作电位(Action Potential,AP)的影响.方法:Langendorff灌流系统灌流离体心脏,急性酶解法获得单个心室肌细胞;全细胞膜片钳技术记录膜电位.结果:CVB-D一甲醇结晶体引起静息电位(RP)从(-80.8 ±6.6)mV减小至(-79.7±6.7)mV(n=6,P<0.05),动作电位0相除极幅度(APA)从(119.1±6.5)mV下降至(115.7±5.8)mY(n=6,P<0.01),复极至50%时动作电位时程(APD50)从(419.6±132.9)ms延长至(554.3±135.7)ms(n=6,P<0.01),复极至90%时动作电位时程(APD90)从(445.4±132.3)ms延长至(584.1±134.1)ms(n=6,P<0.01),复极至50%到复极至90%的动作电位时程(APD50-90)从(25.8±6.4)ms延长至(29.8±7.8)ms(n=6,P<0.05),3相复极斜率(V3)从(-1.9±0.5)V·s-1减慢至(-1.6±0.4)V·s-1(n=6,P<0.01).CVB-D原料溶液组AP相关指标的变化趋势与CVB-D一甲醇结晶体溶液组一致.结论:CVB-D引起RP减小、APA下降、APD50延长、APD90延长、APD50-90延长和V3减慢,以上影响可能是CVB-D具有正性肌力作用和抗心律失常作用的药理机制.CVB-D一甲醇结晶体的药物效应更强.
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HEK细胞NaV1.5电流对甘松挥发油浓度及电压依赖性阻滞
目的:研究甘松挥发油对人肾胚胎(HEK)细胞Nav1.5电流的影响.方法:应用细胞膜片钳技术研究甘松挥发油对鼠cDNA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞(HEK)表达的Nav1.5细胞离子通道电流的影响.结果:发现甘松挥发油对Na电流的阻滞作用受挥发油浓度影响,量一效反应量呈"S"曲线型,电压钳制影响表现为膜电位越低(电位上移)阻滞作用越强.结论:甘松挥发油对钠电位有明显阻滞作用,其作用随剂量增加而增加,随膜电位降低而作用加强.提示临床可用于因心肌缺血导致膜电位降低而诱发的心律失常.
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苯肾上腺素延长糖尿病大鼠心脏QT间期的机理研究
目的:分析苯肾上腺素显著延长糖尿病大鼠心脏QT间期的钾电流机理.方法:采用膜片钳全细胞式的记录方法,观察苯肾上腺素对正常及糖尿病大鼠左心室肌细胞的瞬时外向钾电流(Ito)及稳定状态的钾电流(Iss)的差异作用.结果:与对正常动物的作用相比,苯肾上腺素降低正常的和糖尿病大鼠的瞬时外向钾电流(Ito),和稳定状态的钾电流(Iss).但与正常大鼠相比,降低糖尿病大鼠稳定状态的钾电流(Iss)更明显.结论:与正常动物相比,苯肾上腺素明显延长糖尿病大鼠离体心脏QT间期及动作电位复极90%水平时程(APD90)是由于其更显著降低左心室肌细胞稳定状态的钾电流(Iss).
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黄芪对急性心肌梗死心室肌细胞钙电流的影响
目的:探讨急性心肌梗死(AMI)后兔心室肌细胞L型钙电流的变化及黄芪的影响.方法:兔开胸左前降支结扎造成AMI,腹腔注射黄芪2ml/只·日共7天,酶解分离心室肌细胞,采用全细胞膜片钳记录技术记录左前降支供血区心外膜细胞的ICa-L.结果:①急性心肌梗死1周时兔梗死周边区心室肌细胞L型钙电流受到抑制,电流密度-电压关系曲线(I-V)上移,ICa-L电流密度峰值由正常状态下的-5.58±1.53pA/pF(Con,n=10 cells)降至-3.52±0.93pA/pF(AMI,n=10 cells),大峰电流密度下降了29.1%;其失活曲线左移,半数大失活电位(V0.5)由-13.1±4.2mV左移至-25.9±7.0mV,失活速度加快;灭活后恢复减慢.②黄芪可使AMI后心肌细胞受抑制的ICa-L有所恢复,但对正常心室肌细胞的ICa-L无明显影响.结论:急性心梗后1周梗死周边带心室肌细胞L型钙通道受抑制,可能为急性心梗后室性心律失常发生的机制之一;黄芪对缺血引起的ICa-L的异常有部分改善作用.
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六味地黄汤含药血清对大鼠海马神经元电压门控离子通道的影响
目的:研究六味地黄汤益智作用的机理.方法:应用血清药理学和电生理方法,观察六味地黄汤含药血清对原代培养大鼠海马神经元的电压门控离子通道的影响.结果:六味地黄汤含药血清作用48h可减小延迟整流K+通道电流(IK)和高电压激活Ca++通道电流(ICa),对电压激活Ca+通道电流(INa)的阈值和幅度,及瞬时外向K+通道电流(IA)则无明显影响.结论:六味地黄汤对K+、Ca++电压门控离子通道的作用,可能是其调节海马神经元的兴奋性进而发挥益智作用的机制之一.
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用于膜片钳实验的大鼠心室肌细胞分离方法
目的:研究用于膜片钳实验的SD大鼠心室肌细胞的分离技术,并记录心室肌细胞L型钙通道的电流.方法:采用改进的Langendorff酶液灌流技术分离获得单个心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录L型钙通道电流.结果:分离所得70%～80%的存活心肌细胞中有60%～70%左右的耐钙心肌细胞;并记录到典型的L型钙通道电流,其激活电位为-30mv,大激活电压为0mv.结论:该方法能够分离出足量的可以进行膜片钳实验的心室肌细胞.
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阿斯巴甜对果蝇中间神经元胆碱能突触电活动的影响
目的 阿斯巴甜是食品工业广泛使用的人造甜味剂.其对神经中枢的作用目前研究较少,本文拟探讨阿斯巴甜对果蝇中间神经元胆碱能突触电活动的影响.方法 利用膜片钳技术研究阿斯巴甜对果蝇投射神经元(projection neurons,PNs)电活动的影响.结果 高浓度的阿斯巴甜造成目标神经元自发性动作电位(spontaneous action potential,sAP)和微小兴奋性突触后电流(mini excitatory postsynaptic currents,mEPSC)显著变化,而低浓度则影响有限.结论 本实验为进一步评估阿斯巴甜的生物安全性提供一定的参考.
关键词： 阿斯巴甜 果蝇 膜片钳 微小兴奋性突触后电流 自发电活动 -
顺铂(DDP)对MDCK细胞钙激活钾通道(KCa)的影响
目的探讨顺铂(DDP)对MDCK细胞KCa的影响.方法利用内面向外式(inside-out)膜片钳技术.结果(1)在对称性高钾溶液([K+].:[K+]i=140mmolL-1/140mmolL-1)中,主要记录到电导为51.425±0.570pS(n=5)的外向通道电流,随电压增加而增加.(2)浴液中钾离子浓度由140mmolL-1改变为45mmolL-1,在0mV记录到内向电流,从+30mv开始记录到记录到外向电流,电导为50.385±0.307pS(n=5).(3)在对称性高钾溶液、膜电位+60mV时;向浴液中加入不同浓度的Ca2+,从10-7molL-1开始,通道活动浓度依赖性增加.(4)对称性高钾溶液、膜电位为+60mV,向浴液中加入DDP,从1.5×10-5molL-1开始,DDP使通道活性呈现浓度依赖性减少,洗脱后,通道活性部分恢复.结论(1)本实验在MDCK细胞上记录到中电导钙激活钾通道(IKCa),该通道具有电压依赖性和胞内游离Ca2+浓度依赖性,无整流特性.(2)DDP在7.5×10-6molL-1时对KCa没有显著影响;从1.5×10-5molL-1开始使通道活性呈现浓度依赖性减少,减少钾离子外流.
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粉防己碱(Tet)对MDCK细胞钙激活钾通道(KCa)的影响
目的MDCK细胞钙激活钾通道(KCa)的鉴定及探讨Tet对该通道的影响.方法内面向外式(inside-out)膜片钳技术.结果 (1)在对称性高钾溶液([K+].:[K+]i=140mmolL1/140mmolL-1)中,主要记录到电导为50.475±0.600pS(n=5)的外向通道电流,随电压增加而增加.(2)浴液中钾离子浓度由140mmolL-1改变为45mmolL-1,在0mV记录到内向电流,从+30mv开始记录到记录到外向电流,电导为50.275±0.294pS(n=5).(3)在对称性高钾溶液、膜电位+60mV时.向浴液中加入不同浓度的Ca2+,从10-7molL-1开始,通道活动浓度依赖性增加.(4)对称性高钾溶液、膜电位为+60mV,向浴液中加入Tet,通道活动在1.5×10-5molL-1时大,在6.0×10-5molL-1时明显受到抑制,几乎为0,洗脱后,部分恢复.结论(1)在MDCK细胞上记录到中电导钙激活钾通道(IKCa),该通道具有电压依赖性和胞内游离Ca2+浓度依赖性,无整流特性.(2)Tet在7.5×10-6molL-1时对MDCK细胞Ka没有显著影响;在1.5×10-5molL-1促进KCa开放,增加钾离子外流;在6.0×10-5molL-1时抑制MDCK细胞Kca开放,减少钾离子外流.
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可诱导稳定表达大电导钙激活钾通道的细胞系构建及蛋白质纯化
目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BKCa)的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化.方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BKCa编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,用潮霉素B筛选建立稳定表达的单克隆细胞系.BKCa-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后,用anti-FLAG抗体对表达的BKCa蛋白质进行纯化.用western blot检测BKCa通道蛋白质的表达,用单通道膜片钳检测通道的电生理特性.结果:BKCa-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后表达了高水平的BKCa-FLAG融合蛋白,BKCa通道电导值为213.39±9.52 pS(n=15,cell-attached)和225.72±10.61 pS(n=13,inside-out),BKCa通道具有典型的大电导特性、电压依赖性、Ca2+依赖性及IbTX敏感性,与在体的人肠系膜动脉平滑肌BKCa通道具有相同的特征.纯化后的BKCa蛋白质条带单一,纯度约为89%.结论:成功构建BKCa-pcDNA5-293细胞系并获得纯化的BKCa蛋白质,为进一步深入研究通道功能及药物筛选奠定了重要的基础.
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钩藤碱对人体肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的影响
目的:探讨钩藤碱(Rhy)对人体肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(BKCa)的作用.方法:切取人体肠系膜动脉并分离细胞,以膜片钳测BKCa活性.结果:(1)高血压病组(EH)与非高血压组(NH)比较,前者BKCaPo较高,Tc较低;加入Ca2+后,与加Ca2+前相比NH组Po的增加幅度高于EH组.(2)加入Rhy后,在细胞贴附式BKCa无反应;在内面向外式EH组BKCa Po增加的幅度高于NH组,同一浓度下,前者Po较高,Tc较低.结论:(1)EH组BKCa活性高于NH组.(2)Rhy可直接激活BKCa,且在EH组更为显著.
关键词： 钩藤碱 大电导钙激活钾通道 人体肠系膜动脉平滑肌细胞 膜片钳 -
对吸入麻醉药敏感性不同的果蝇脑神经元钾电流的研究
目的:以对吸入麻醉药具有不同敏感性的果蝇幼虫脑神经元为模型,利用膜片钳技术记录其钾电流,探讨吸入麻醉药的作用机制.方法:分离制备对吸入麻醉药敏感(S)、耐药(R)和野生(H)果蝇品系脑神经元,以膜片钳技术记录其全细胞钾电流.实验数据以"均数士标准差"表示,SPSS软件进行统计分析.结果:在果蝇晚三龄幼虫脑神经元上只记录到外向钾电流,未见其它电流成分.三品系脑神经元大小(细胞膜电容)没有显著性差异(P＞0.05),而电流峰值有显著性差异:敏感＞野生＞耐药(P＜0.05).结论:钾通道可能是吸入麻醉药的中枢作用位点之一.
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果蝇中枢神经元胰蛋白酶急性分离方法
目的:探索果蝇脑神经元胰蛋白酶急性分离的新方法.方法:解剖果蝇晚三龄幼虫脑组织,用胰蛋白酶化学消化并辅以机械微振荡法分离制备单个细胞,用果蝇细胞培养液适当孵育.在倒置相差显微镜下对其进行形态学观察和分类,结合全细胞膜片钳技术对其电生理学特性进行初步研究.结果:该方法成功制备出三类大小和形态各异、活性较好的果蝇脑神经元,未见神经胶质细胞;以三型细胞为电生理学研究对象,记录到五种类型的全细胞外向钾电流.结论:我们建立的果蝇晚三龄幼虫脑细胞急性分离方法简便易行,稳定可靠.
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大鼠海马神经元钙电流特性及马桑内酯对其影响的研究
用胰蛋白酶消化加吹打的方法急性分离SD大鼠(出生后7～14d)海马神经元,并用银染法对细胞进行验证.在膜片钳的全细胞模式下,记录细胞膜上钙离子通道的电生理活动,观察马桑内酯(Coriaria lactone,CL)对电流幅度的影响.既有高电压激活钙电流(High voltage-activated calcium currents, HVA)又有低电压激活钙电流 (Low voltage-activated calcium currents, LVA),HVA钙电流可分为以下三个部分:峰电流成分、持续的电流成分和瞬时的电流成分.其持续成分主要是L-型钙电流.经20 μl/ml和40 μl/ml的CL作用3 min后, LVA、HVA峰值钙电流密度均增加 (P<0.05),这一作用具有一定的浓度依赖性.CL使海马神经元钙电流增大可以导致神经元兴奋性增高,引发神经元产生异常的癫痫样放电,这在CL致痫过程中起着重要的作用.
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基于USB总线的全自动膜片钳系统数据接口
论述了一种基于USB总线的全自动膜片钳系统数据接口.系统的主控芯片为CY2131QC(Cypress),逻辑控制芯片为EPM3256A(Altera).接口与前端系统之间采用光电隔离.由于使用了USB总线,从根本上简化了现场安装工作.接口传输速率达到1 M bytes/s,符合新一代的全自动膜片钳系统数据采集和控制的要求.
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正常血钾型周期性麻痹SCN4A基因R675Q新突变细胞模型的建立及初步研究
目的 建立一个正常血钾型周期性麻痹(normokalemic periodic paralysis,normoKPP)R675Q新突变的细胞模型并对其通道电流进行初步研究.方法 用编码野生型人骨骼肌钠离子通道a亚单位基因(skeletal muscle Na channel type 4 alpha subunit gene,SCN4A)的cDNA为模板,PCR技术定点突变后磷酸钙沉淀法瞬时转染突变质粒至293细胞,逆转录PCR和Western印迹验证目的 基因和蛋白的表达;膜片钳技术全细胞记录野牛和突变型钠通道电流.结果 突变经测序得以证实;转染后24 h和48h,突变通道的基因及蛋白表达量显著增高;相同的测试电压下R675Q钠通道相对电流在到达峰值前小于野生型钠通道,到达峰值后大于野生型钠通道;R675Q和野生型钠通道均在0 mV测试电压刺激下到达峰值.结论 成功建立了正常血钾型周期性麻痹R675Q新突变的细胞模型;R675Q突变同时提高了通道的激活和失活,其所在的S4区域可能和患者发作性力弱的症状密切相关.
关键词： 正常血钾型周期性麻痹 细胞模型 膜片钳
