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丹酚酸B和延胡索乙素对大鼠心室肌细胞L-型钙通道的影响
目的 观察单独及联合使用丹酚酸B和延胡索乙素对大鼠心室肌细胞L-型钙通道的影响.方法 采用急性酶解分离法获得大鼠的单个心肌细胞,使用全细胞膜片钳技术记录钙通道电流.观察给药前后钙通道电流峰值(钙电流活化后峰值点与完全失活后电流轨迹的垂直距离)的变化.结果 单独使用丹酚酸B(1,10,100 μmol/L)对钙电流峰值的抑制率分别为:(25.3±16.4)％(n=4),(44.6±24.0)％(n=6),(86.0±20.4)％(n=4).单独使用延胡索乙素(10,30,100 μmol/L)对钙电流峰值的抑制率分别为:(22.2±6.4)％(n=5),(27.4±1.6)％(n=3),(51.0±23.0)％(n=9)；联合使用丹酚酸B(1μmoL/L)和延胡索乙素(10 μmol/L)对钙通道电流峰值的抑制作用强于单独使用丹酚酸B(1 μmol/L)或延胡索乙素(10μmoL/L),差异有统计学意义(P＜0.05)；盐酸阿托品(14 mmoL/L)能够逆转延胡索乙素对L-型钙通道的抑制作用,而加强丹酚酸B的抑制作用.结论 丹酚酸B和延胡索乙素对大鼠心室肌细胞L-型钙通道均有抑制作用,两者之间能够产生协同效应,并且这两种有效成分调控L-型钙通道的作用机制不同.
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大鼠骨髓间充质干细胞L-型钙通道的表达及电流检测
目的 探讨L-型钙通道基因和蛋白在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达及离子电流,以进一步研究其在MSCs增殖和分化中的作用.方法 分离、培养和纯化大鼠骨髓间充质干细胞,细胞免疫荧光化学方法检测表面分子CD14、CD29、CD34,CD44、CD45、CD106的阳性率和L-型钙通道蛋白的表达;采用RT-PCR技术观察MSCs细胞中钙离子通道不同亚基α1C、α1D、α1G、α1H、α1S mRNA的表达;全细胞膜片钳技术记录单个细胞离子电流.结果细胞免疫荧光化学方法检测CD29、CD44、CD106阳性率在93%左右,CD14、CD34、CD45表达阴性.RT-PCR结果显示,可见L-型钙通道α1C亚基的mRNA高表达;但未见L-型钙通道α1D、α1S亚基和T-型钙通道的α1G、α1H亚基mRNA的表达.L-型钙通道蛋白(α1C)呈阳性表达.在36例细胞中16例细胞记录到电压依赖性内向电流,此电流激活电位-30 mV,大激活电位为0～10 mV,可被nifedipine(10 μmol/L)阻断,细胞外液中以10 mmol/L Ba2+作为负载离子,记录的电流强度明显大于2 mmol/L Ca2+时,证实为L-型钙电流.结论 MSCs不仅有L-型钙通道的基因和蛋白的表达,并且具有功能电流.
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花生四烯酸对L-型钙通道的作用及其抗心律失常机制
目的 研究花生四烯酸(arachidonic acid,AA)对家兔单个心室肌细胞L-广型钙通道的作用及其抗心律失常作用的机制.方法 采用酶解法分离得到家兔单个心室肌细胞,全细胞膜片钳技术记录单个心室肌细胞L-型钙电流(L-type calcium current,Ica-L),用累积给药的方法在灌流液中加入不同浓度的AA,观察给药前后L-型钙电流的变化,统计学方法采用单因素方差分析.结果 不同浓度的从均能明显抑制心室肌细胞,Ica-L.3 μmol/L,μmol/L,20,μmol/L的AA使Ica-L峰电流密度从(10.79±0.93)pA/pF分别减少剑(8.99 ±0.43)pA/pF、(7.60 ±0.35)pA/pF和(5.60±0.30)pA/pF(n=7,P<0.05),经冲洗后Ica-L可部分恢复,并且AA可使Ica-L的I-V关系曲线上移,其形状和峰值电压保持不变;20 μmol/L的AA使Ica-L失活曲线左移,失活后恢复时间明显延长,但对激活曲线无明显影响.结论 花生四烯酸可通过加快L-型钙通道失活,延长其失活后的恢复过程而减少细胞外钙离子的内流,延长有效不应期,从而发挥抗心律失常作用.
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低强度超声对离体大鼠膀胱平滑肌收缩的影响
目的 观察低强度脉冲超声(LIPUS)对离体大鼠膀胱平滑肌收缩的影响.方法 将32只SD雌性大鼠的32段离体膀胱肌条随机分为超声辐照组、超声辐照+尼莫地平组、超声辐照+低分子肝素组及对照组,每组各8段.采用BL-410F生物机能实验系统测量并记录超声辐照组、超声辐照+尼莫地平组、超声辐照+低分子肝素组在LIPUS辐照前、后的收缩曲线,并比较3组膀胱平滑肌条收缩频率、幅度.对超声辐照组LIPUS辐照后和对照组膀胱平滑肌进行组织病理学观察.结果 与LIPUS辐照前比较,辐照后超声辐照组的收缩频率和幅度均明显增加(P均＜0.05),超声辐照+尼莫地平组的收缩频率和幅度均明显降低(P均＜0.05),超声辐照+低分子肝素组的收缩频率和幅度均无明显变化(P均＞0.05).组织病理学显示超声辐照组膀胱平滑肌细胞与对照组比较无明显差异.结论 LIPUS辐照可激活膀胱平滑肌细胞膜L-型钙通道,继而引起膀胱平滑肌的收缩增强.
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丹参Ⅱ-A对大鼠心肌细胞L-型钙通道的影响
目的 研究丹参酮Ⅱ-A对大鼠心肌细胞L型钙通道的影响.方法 采用酶解法制备大鼠心肌细胞,应用全细胞膜片钳技术检测大鼠心肌细胞L-型钙通道的电流密度和动力学.结果 丹参酮Ⅱ-A对L-型钙通道有抑制作用.在0μmol/L、10 μmol/L、20μmol/L和40μmol/L丹参酮Ⅱ-A作下,L-型钙通道的峰值电流密度分别为-13.34±1.06 pA/pF、-10.46 ±0.75 pA/pF、-7.62±0.50 PA/pF和-4.69±0.18 PA/pF,其抑制率分别为28.40％、52.14％和73.50％ (n=8,P＜0.05).结论 丹参酮Ⅱ-A抑制大鼠心肌细胞L-型钙通道,降低L-型钙通道的电流密度,呈浓度依赖性.
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肿瘤坏死因子α在急性缺氧状态下对豚鼠心室肌细胞L型钙通道电流的抑制作用
目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)在正常和急性缺氧状态下对豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的作用.方法 急性分离成年豚鼠的心室肌细胞,采用全细胞膜片钳法记录L-型钙通道电流,并分别在正常和急性缺氧的条件下,给予不同浓度的TNF-α(100U/ml、300U/ml、500U/ml),观察其对豚鼠心室肌细胞L-型钙通道电流的作用.结果 在全细胞封接后20min,L-型钙通道峰值电流分别是:正常对照组-471.948 306.587 pA;不同浓度TNF-组-497.698 296.686pA(100U/ml)、-471.894 366.758pA(300U/ml)、-503.988 396.958pA(500U/ml)(与正常对照组相比P＞0.05);急性缺氧组-369.577 104.280 pA(与正常对照组相比P=0.022);急性缺氧+不同浓度TNF-α组-268.445 124.112pA(100U/ml)、-190.588 102.281pA(300U/ml)、-87.666 70.670pA(500U/ml)(与急性缺氧组相比P值均＜0.05).结论 在正常条件下,TNF-α对豚鼠心室肌细胞的L型钙通道电流无明显影响,但在急性缺氧条件下,TNF-可以增强缺氧对该电流的抑制作用.
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柯萨奇病毒B3感染培养大鼠心室肌细胞L-型钙通道mRNA表达的变化
目的:观察柯萨奇病毒B3感染对培养大鼠心室肌细胞L-型钙通道mRNA表达的影响.方法:用柯萨奇病毒B3感染原代培养新生大鼠心室肌细胞,合成大鼠心室肌细胞L-型钙通道各亚单位引物,通过逆转录-聚合酶链反应技术,以β-actin为内参照,测量钙通道各亚单位mRNA表达量在病毒感染前后的变化.结果:病毒感染组心室肌细胞L-型钙通道α1(4.00±0.07 vs 2.21±0.41,p＜0.01),β(2.06±0.06 vs 1.22±0.30,p＜0.05)亚单位mRNA表达量较正常对照组显著增加,而α2/δ(4.12±0.19 vs 4.13±0.27,P＞0.05)亚单位mRNA表达量变化无统计学意义.结论:柯萨奇病毒B3感染心室肌细胞钙通道mRNA表达量增加,可能是病毒介导心室肌细胞L-型钙电流变化的分子基础.
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伊贝沙坦对兔心室肌细胞L-型钙通道电流的影响
目的研究伊贝沙坦(irbesartan)对正常家兔心室肌细胞L-型钙电流(ICa-L)、内向整流性钾电流(IK1)、快钠流(INa)以及跨膜动作电位的影响.方法应用膜片钳全细胞记录方法记录各项离子流和跨膜动作电位.结果(1)伊贝沙坦呈浓度依赖性阻断ICa-L;(2)伊贝沙坦可使ICa-LⅠ-Ⅴ曲线上移,但不改变其激活电位、峰值电位和反转电位;(3)伊贝沙坦呈使用依赖性阻滞ICa-L;(4)伊贝沙坦对ICa-L激活曲线无明显影响,但可使钙电流稳态失活曲线左移,加速钙通道电压依赖性失活;(5)伊贝沙坦(100 nM)使ICa-L失活后再激活的恢复时间常数(τ)明显延长;(6)伊贝沙坦对IK1和INa无明显影响;(7)伊贝沙坦(100 nM)可使单个心室肌细胞动作电位时限缩短,对静息电位(RP)、动作电位幅度(APA)无影响.结论伊贝沙坦作用于L-型钙通道的失活态从而阻断ICa-L.
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非去极化停搏液对缺血再灌注心肌细胞L-型钙通道的影响
目的 探讨非去极化停搏液(non-depolarizing solution,NDP)对缺血再灌注心肌细胞L-型钙通道(ICa-L)的影响.方法 实验分为对照(Con)组、缺血再灌注(I/R)组和非去极化停搏液(NDP)组.选择培养18～48h的SD乳鼠心肌细胞用于实验.Con组细胞不经过缺血再灌注处理;I/R组细胞经模拟缺血缺氧3 h、再灌注1h处理;NDP组在模拟I/R过程中,加NDP液于细胞培养基中进行干预.用全细胞膜片钳技术检测ICa-L的电流强度和门控特性.结果 与对照组相比,I/R组ICa-L的峰值电流密度明显降低[(-9.0±3.8)pA/pF vs(-15.1±8.8)pA/pF,P＜0.05],电流-电压曲线(I-V曲线)上移,翻转电位绝对值减小,稳态激活曲线和失活曲线左移,恢复曲线右移.与I/R组相比,NDP组ICa-L的峰值电流密度升高[(-11.4±6.7)pA/pF vs(-9.0±3.8)pA/pF,P＜0.05],I-V曲线下移,翻转电位绝对值增大,稳态激活曲线和失活曲线右移,恢复曲线左移.结论 NDP液可减轻心肌细胞I/R损伤对ICa-L通道的抑制作用和门控特性的改变,有利于保护心肌收缩和舒张功能、减少心律失常的发生.
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谷氨酸致脑缺血再灌注损伤中钙超载的信号转导机制
目的 观察谷氨酸所致脑缺血再灌注的钙超载损伤,探究谷氨酸参与调控钙超载的分子机制.方法 建立大鼠脑缺血再灌注模型以及体外培养小鼠的小脑颗粒神经元,随机分组:对照组(5只)、二甲基亚砜溶剂组(3只)、谷氨酸组(5只)、硝苯地平组(4只)、谷氨酸+硝苯地平组(4只)、TRPC1中和性抗体组(5只)、谷氨酸+TRPC1中和性抗体组(5只).采用干湿重法测定大鼠脑水肿程度,采用激光共聚焦显微镜fura-2探针检测神经元细胞内Ca2+水平.结果 在大鼠MCAO模型中,谷氨酸明显增加脑水肿(P＜0.05),硝苯地平显著抑制由谷氨酸引起的脑水肿(P＞0.05),而TRPC1中和性抗体无此效应(P＜0.05).在体外神经元培养中,谷氨酸显著增加细胞内Ca2+水平,而硝苯地平能降低由谷氨酸引起的神经元内Ca2+升高,差异有统计学意义(P＜0.05);TRPC1中和性抗体只能部分降低谷氨酸引起的神经元内Ca2+升高,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 谷氨酸在脑缺血再灌注中所致钙超载,主要通过L-型钙通道钙内流后激活钙库释放,终导致脑水肿.钙库调控的TRPC1通道不参与谷氨酸所致的钙超载.
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快速心房起搏后不同时期犬心房肌细胞电生理特性的变化
目的探讨快速心房起搏后不同时期犬心房肌电生理特性的变化,包括动作电位及钙离子通道的变化以及诱发心房颤动(房颤)的情况.方法通过植入420次/min的固定频率起搏器并将电极固定于右心房制成犬快速心房起搏模型,起搏持续时间分别为2,4,6,8周,然后将犬处死,分离单个心房肌细胞,并应用全细胞膜片钳法,记录犬心房肌细胞跨膜动作电位和L型钙离子电流(IcaL)的变化.结果①9只起搏持续时间为4～8周的犬中,有4只出现阵发性房颤,②与对照组(未起搏组)相比,在2,4,6,8周动作电位时程(APD90)分别减少33.4%、48.6%、47.8%和48.3%:动作电位幅度(APA)分别减少9%、15.8%、17.9%和18.4%;IcaL分别减少40.7%、63%、62.8%和61.7%.③起搏4～8周的犬中,出现阵发性房颤(4/9)与无阵发性房颤的犬(5/9)相比,APD90,APA和Ⅰ-caL的数值无明显变化(P＞0.05).结论随着快速起搏时间的延长,动作电位时程,动作电位幅度及L型钙电流密度呈进行性减低,于第四周达到低水平,然后持续在这一低水平.
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二甲基氨氯吡咪对高钾预收缩大鼠胸主动脉环的效应及其机制研究
目的 研究二甲基氨氯吡咪(DMA)对高钾预收缩大鼠主动脉血管环的效应及其可能的机制.方法 采用离体血管环实验方法,记录KCl(30 mmol/L)预收缩的离体大鼠主动脉环张力变化,观察DMA对大鼠主动脉血管环的作用及不同工具药的影响.结果 二甲基氨氯吡咪(1×10-6mol/L～3×10-5mol/L)对基础状态的大鼠主动脉血管环无作用,而对KCl(30 mmol/L)引起的大鼠主动脉血管环的张力变化有浓度依赖性的收缩作用,大收缩率为(30.49±4.11)%,EC50为5.38 mol/L±1.68 mol/L.DMA可使CaCl2量效曲线非平行左上移,在KCl预收缩基础上,钠钙交换体的阻滞剂KB-R7943、钙通道阻滞剂尼卡地平、Na+-K+-ATP酶阻滞剂洋地黄均可抑制二甲基氨氯吡咪对血管的收缩作用.结论 二甲基氨氯吡咪对KCl引起的血管收缩有浓度依赖性的进一步收缩作用,此作用可能与DMA促进细胞外钙内流有关,与血管平滑肌上的钠钙交换体,L-型钙通道以及Na+-K+-ATP酶有关.
关键词： 二甲基氨氯吡咪 钠钙交换体 L-型钙通道 Na+-K+-ATP酶 胸主动脉环 -
部分纯化的牛心细胞质提取物对心肌细胞膜“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用
目的 研究牛心细胞质部分纯化提取物及钙调蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ)对大鼠心肌细胞膜L-型钙通道活性的调节作用.方法 采用常规的蛋白提取方法制备牛心细胞质提取物,离子交换方法进行部分纯化.应用膜片钳制技术的细胞贴附和膜内向外记录模式记录大鼠心室肌细胞单通道钙电流,观察牛心细胞质部分纯化提取物和CaMKⅡ对“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用.Western blot方法验证活性蛋白.结果 膜内向外记录模式下,L-型钙通道出现“run-down”现象,活性下降至细胞贴附记录模式的(0.46±0.15)％；牛心细胞质部分纯化提取物使“run-down”的通道活性恢复至细胞贴附记录模式的(44.29±13.51)％(P＜ 0.01),加入CaMKⅡ抑制剂KN-62(1 μmol/L)后活性仅恢复至(1.30±0.94)％,与未加抑制剂组相比差异有统计学意义(P ＜0.05)；Western blot方法验证牛心细胞质部分纯化提取物中含有CaMKⅡ；基因重组融合蛋白法制备的CaMKⅡ也可将“run-down”后的钙通道活性恢复至细胞贴附记录模式的(71.59±14.76)％ (P＜ 0.05).结论 牛心细胞质部分纯化提取物对“run-down”钙通道活性具有恢复作用,该作用可能与CaMKⅡ密切相关.
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大鼠心室肌细胞单通道钙电流的记录及其电生理学特性分析
目的 分离大鼠心室肌细胞,记录大鼠心室肌细胞的单通道钙电流,并分析其基本电生理学性质.方法 胶原酶法分离大鼠心室肌细胞；应用膜片钳技术细胞贴附式和内膜向外式记录L-型钙通道的电流,并用pClamp 10分析软件进行分析.结果分离得到大鼠心室肌细胞,细胞存活形态良好,呈杆状或柱状,具有清晰的横纹.记录到的L-型钙通道单通道电流,平均电流幅度为(1.13±0.01)pA,电导为19 pS,平均开放时间常数为(1.35±0.03)ms,平均关闭时间常数为(46.75±10.04) ms.此外,还记录到L-型钙通道的Run-down现象.结论 本实验分离得到的大鼠心室肌细胞适用于膜片钳单通道记录模式；记录到的L-型钙通道的基本电生理学性质与文献报道相符.
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抗大鼠心室肌细胞L-型钙通道亚单位抗体的制备与验证
目的:用人工合成的大鼠心室肌细胞L-型钙通道4个亚单位的抗原表位短肽免疫家兔,产生可识别该通道不同亚单位的特异性抗体,并进行验证.方法:从大鼠心室肌细胞L-型钙通道4个亚单位的氨基酸序列中筛选出三段短肽,进行人工合成.用化学合成的多肽与破伤风类毒素(TT)以戊二醛法连接,并以此作为抗原免疫家兔制备抗大鼠心室肌细胞L-型钙通道的免疫血清,经分离纯化获得抗体.抗体的验证通过ELISA,Western blot,免疫荧光组织化学技术进行检测.结果:所制备的抗大鼠心室肌细胞L-型钙通道α1c、β2和α2/δ亚单位的抗体滴度分别为1:51 200～1:102 400、1:1 280和1:1 280,3个抗体结合到大鼠心肌细胞膜蛋白的分子量分别为235、89和162 kD.免疫荧光组织化学实验显示,抗体均能特异性的结合在培养大鼠心室肌细胞膜上.结论:所制备的抗大鼠心室肌细胞L-型钙通道亚单位抗体能特异性识别大鼠心室肌细胞膜上L-型钙通道的不同亚单位.
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辛伐他汀对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞L-型钙通道mRNA表达的影响
目的:研究辛伐他汀对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染BALB/c小鼠后心肌细胞L-型钙通道(LCCs)mRNA表达的影响,探讨辛伐他汀对病毒性心肌炎的治疗作用.方法:应用CVB3感染BALB/c小鼠制作病毒性心肌炎模型,辛伐他汀混悬液灌胃,按辛伐他汀剂量分为10 mg·kg-1组、30 mg·kg-1组及90 mg·kg-1组,并设正常对照组及病毒感染对照组,行心肌病理观察,采用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测正常对照组、病毒感染组及辛伐他汀组心肌细胞LCCs α1亚单位mRNA表达量.结果:病毒感染组小鼠心肌组织有局灶性或弥漫性以单核细胞为主的炎性细胞浸润,重者可见大片状心肌细胞坏死;辛伐他汀组心肌组织炎症细胞浸润及坏死灶明显减轻;正常对照组和病毒模型组心肌LCCs α1亚单位的mRNA表达量分别为0.06±0.01和1.37±0.32,二者比较差异有显著性(P＜0.05);辛伐他汀10 mg·kg-1、30 mg·kg-1及90 mg·kg-1组LCCs α1亚单位的mRNA表达量分别为1.14±0.22、0.17±0.04和0.11±0.02,与病毒模型组比较差异有显著性(P＜0.05),其中以中、高剂量组下降明显.结论:辛伐他汀可减轻病毒性心肌炎的病理损害,并以剂量依赖的方式抑制心肌细胞LCCs α1亚单位的mRNA表达,发挥心肌保护功能,对病毒性心肌炎有一定的治疗作用.
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人重组生长激素对豚鼠心室肌细胞动作电位钙通道的作用
目的探讨人重组生长激素正性肌力作用的机制.方法利用Langendorff模型以及膜片钳技术研究心肌细胞内向钙电流.结果受到人重组生长激素作用10min后,动作电位平台期延长,APD50、APD90分别由261.14±15.42ms至354.65±31.22ms和311.23±13.7至401.33±18.13ms.大内向峰电流(Ica)由2.03±0.09升至2.85±0.11PA,增加约40%.结论人重组生长激素延长动作电位平台期,促进正常豚鼠心肌细胞L-Ca2+通道开放.
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钙诱导钙释放机制与慢性心力衰竭的关系
目的:探讨钙诱导的钙释放(CICR)过程与慢性心力衰竭之间的关系.方法:采用冠状动脉左前降支结扎手术制作大鼠慢性心衰模型,酶解法分离成年大鼠心室肌细胞,然后使用NiCl2(5mmol/L)和毒胡萝卜素(TG, 100nmol/L)分别阻断钠钙交换体和钙泵,采用膜片钳和激光扫描共聚焦显微镜同步实时系统记录心肌细胞的L-型钙电流(ICa.L)以及CICR过程中的钙瞬变.结果:心衰大鼠心肌细胞的ICa.L低于正常大鼠心肌细胞的ICa.L;心衰组心肌细胞内CICR过程中的钙火花发生率低于正常对照组.结论:心肌细胞CICR功能的异常与心力衰竭的发生机制有着十分密切的关系,可能为导致心力衰竭发生的重要原因之一.
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丹参素对大鼠心室肌动作电位、L-型钙电流和ATP敏感性钾电流的作用
目的 研究丹参索对单个大鼠心室肌细胞动作电位、L-型钙电流和ATP敏感性钾电流(IKATP)的影响,探讨丹参素在离子通道水平的药理机制.方法 胶原酶急性酶解法分离单个大鼠心室肌细胞,采用全细胞膜片钳的方法,记录丹参素对动作电位、L-型钙电流和IKATP的影响.结果 丹参紊可影响心室肌细胞动作电位时程(APD),并能使APD 25、APD 50和APD 90显著缩短;丹参素能够抑制L-型钙电流;丹参素可使IKATP外向电流增大,此效应呈浓度依赖性.结论 丹参素的心肌保护作用机制与抑制L-型钙电流和部分激活IKATP外向电流有关.
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细胞内高镁对豚鼠心室肌细胞L-型钙通道活性的影响
本文旨在研究细胞内高镁对离体豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的单通道门控特性的影响.急性酶消化法分离豚鼠心室肌细胞,应用膜片钳膜内向外单通道记录模式观察不同浓度细胞内镁([Mg2+]i)对心肌细胞L-型钙通道单通道电流的影响.结果显示,对照组([Mg2+]i 0.9 mmol/L)的心肌细胞L-型钙通道相对活性为(176.5±34.1)％,而高镁组([Mg2+]i 8.1 mmol/L)钙通道相对活性显著降低至(64.8±18.1)％(P＜0.05).另外,8.1 mmol/L [Mg2+]i使心肌细胞L-型钙通道的平均开放时间缩短至对照组的约25％(P＜0.05),但对通道平均关闭时间无明显影响.以上结果提示,细胞内高镁主要通过缩短通道平均开放时间抑制豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的活性.
