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生物起搏研究新进展
自全埋藏式心脏电子起搏器应用于临床以来，患者预后明显改善。然而接踵而来的电极脱落、电池耗竭、心内膜感染等弊端驱动人们寻找新的治疗方案。随着人类基因组计划的完成和分子生物学的迅猛发展，心脏生物起搏已引起医学界的高度关注。
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心脏生物起搏细胞治疗的研究进展
自1958年首次问世至今,电子起搏器治疗已成为心律失常,特别是缓慢性心律失常的首选治疗方法.70余年来,虽然人工心脏起搏器的技术逐渐完善,临床适应证也不断拓宽,但其也暴露了一些缺点,如电池寿命有限、价格昂贵、感染、出血、电极脱位及缺乏对神经激素自动反应性等.从心脏生理功能和人体适应性的角度,理想的起搏器应该是生物起搏器.随着分子生物学和细胞生物学的发展,近几年来,生物起搏心脏的技术不断取得突破.目前生物起搏主要集中于两个方面,即细胞治疗和基因治疗.在此我们将重点阐述细胞治疗的研究进展.
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转录因子Tbx18导入人诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞构建起搏样细胞的实验研究
目的:研究转录因子Tbx18能否转染人诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)并使其向起搏细胞分化.方法:纯化接种hiPSC-CMs,构建重组腺病毒-绿色荧光蛋白Ad-(GFP)-Tbx18载体,转染hiPSC-Cs为实验组,转染只含GFP的腺病毒组及空白未转染组作为对照.转染后定期检测细胞的变化情况,荧光倒置显微镜计数转染后细胞的搏动频率变化情况;RT-PCR测定起搏细胞特异性基因的表达.结果:实验组hiPSC-CM的搏动频率高于对照组[(61.3±13.6)vs.(33.0±1.67)次/min,P＜0.05)].实验组起搏特异性基因HCN4的表达较对照组明显增加,KIR2.1、SCN5A、CX43等心室肌特异性基因表达较对照组下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:Tbx18基因可成功转染hiPSC-CMs,并使之转化为窦房结样起搏细胞.
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心脏生物起搏基因治疗的研究进展
缓慢性心律失常严重威胁着患者的生命健康。自从1958年问世至今，心脏植入性电子起搏器已成为临床上治疗缓慢性心律失常的一线手段。虽然电子起搏器技术不断完善，但在长期临床应用过程中暴露出一些问题［1］，如导线断裂、电磁干扰、囊袋感染、电池寿命有限以及缺乏对自主神经系统的反应性等。基于上述问题，探索一种新的治疗方法势在必行。本文以现有文献，对心脏生物起搏基因治疗的研究进展加以综述。
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ISL-1诱导脂肪干细胞向起搏样细胞分化
目的 探讨过表达胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1)的慢病毒在体外转染脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),能否诱导ADSCs向起搏样细胞分化.方法 取第3～5代ADSCs,随机分成Bank、mCherry和胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1)3组,按分组分别转染病毒,经荧光强度和流式分析确定适感染复数,与乳鼠心室肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRVMs)共培养7天后迸行实时荧光定量聚合酶式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹、免疫荧光检测分析,期间观察细胞形态和搏动频率变化,并用膜片钳技术记录细胞内电流活动.结果 分离贴壁后的ADSCs呈长梭形,慢病毒转染ADSCs的适感染复数为50.ISL-1组ADSCs形态呈多样化,窦房结特异性基因HCN4、Cx45和Tbx3的mRNA表达水平上调,而工作心肌特异性基因Nkx2.5下调,组间比较差异有统计学意义(P<0.05).ISL-1组大多数细胞可检测到HCN4表达并且可记录到超极化内向电流.结论 经ISL-1基因修饰的ADSCs通过体外心肌微环境诱导,产生了一定的高表达窦房结标志性基因并具有细胞内典型超极化电活动的起搏样细胞.
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生物起搏的研究进展
目前临床已经使用电子起搏器来治疗由房室传导阻滞或窦房结功能障碍引起的心动过缓,虽然不断改进,但仍然存在很多弊端.随着分子生物学的迅猛发展,心脏生物起搏为治疗开辟了一个全新的领域.生物起搏是指利用细胞分子生物学及相关技术对受损的自律性节律点或特殊传导系统的细胞进行修复或替代,从而达到恢复心脏起搏或传导功能的目的.本文总结近年来生物起搏中的一些研究进展,希望为今后的临床应用提供理论依据.
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细胞治疗在生物起搏中的研究进展
随着分子生物学、细胞生物学和基因工程改造细胞技术的飞速发展,以及对起搏电流的进一步阐明,生物起搏成为心律失常治疗中的探索"热点".心脏生物起搏指利用细胞分子生物学及其相关技术对受损的自律性节律点或特殊传导系统的组织进行修复和替代,使心脏的起搏和传导功能得以恢复.
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转录因子 Tbx18、Tbx3、Shox2在生物起搏方面的研究进展
近年来，一些转录因子在生物起搏方面的作用受到了极大关注，无论是离体的细胞实验还是在体直接注射，都产生了令人瞩目的成果。文章就转录因子Tbx18、Tbx3、Shox2在生物起搏方面的研究进展做一综述，希望为其今后在临床上的应用提供依据。
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心脏无导线起搏及生物起搏研究进展
心脏起搏器技术自1958年问世以来，已应用于缓慢心律失常、心源性猝死的预防及心脏再同步治疗的患者，取得可观成效。起搏器经历了从初期的大型到后来的小型化，然而微创和降低并发症是起搏器更新换代的驱动力，起搏器本身产生的并发症如导线折断、脱位及绝缘层破裂、导线与脉冲发生器连接问题及静脉血栓形成等，使得无导线心脏起搏技术得以长足发展。另一方面，心脏生物起搏由于其生物环保、更接近人体正常生理节律，近些年来成为学者们研究的新宠，备受推崇。
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心脏电子起搏器时代与生物起搏替代的前沿话题
植入电子起搏器是目前治疗症状性缓慢心律失常的主要方法,然而它存在许多缺点.能否利用分子生物学原理发展生物起搏器成为大家关注的热点.通过转染编码If电流的超极化激活环核苷酸门控通道基因,过度表达超极化激活环核苷酸门控通道,增加心脏舒张期内向电流,从而在窦房结被抑制时提供起搏作用,这种利用基因治疗和细胞治疗构建的生物起搏在不久的将来可能会成为电子起搏器为理想的替代方法.目的:总结超极化激活环核苷酸门控通道基因构建生物起搏的研究进展.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索.Pubmed数据库1979-01/2007-06的相关文献.检索词"hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated nnel;biological pacemaker",并限定文章语言种类为English.共检索到157篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与生物起搏及超极化激活环核苷酸门控通道基因密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:重复性研究.文献评价:文献的来源主要是超极化激活环核苷酸门控通道基因的基础实验.所选剧的36篇文献中,10篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①在4种异构体中超极化激活环核苷酸门控通道1,2,4是心脏中的主要部分,超极化激活环核苷酸门控通道3只在胚胎起搏细胞中有低水平表达.起搏活性小的区域(如心室肌),超极化激活环核苷酸门控通道2的表达占优势;而起搏活性高的区域超极化激活环核苷酸门控通道4的表达占优势.此外,超极化激活环核苷酸门控通道2在整个发育阶段,是心室的主要异构体,超极化激活环核苷酸门控通道2:超极化激活环核苷酸门控通道4的相当表达量在乳鼠为5:1,成年鼠为13:1.②超极化激活环核苷酸门控通道通道缺陷可导致病窦综合征.③到目前为止.转染编码If电流的超极化激活环核苷酸门控通道基因被认为是有可能实现生物起搏的.结论:基因治疗和细胞治疗必将成为改善生物"起搏"功能理想的方法,以超极化激活环核苷酸门控通道基因和细胞为主的生物起搏在缓慢性心律失常治疗中必将占有一席之地.
关键词： 超极化激活环核苷酸门控通道基因 生物起搏 综述文献 -
生物起搏在细胞移植中的作用
近年来随着分子生物学、细胞移植及基因工程的快速发展,生物起搏成为治疗缓慢心律失常的新方向,生物起搏器的研究主要经历了3个阶段:①细胞治疗:将具有多向分化能力的胚胎干细胞或骨髓间充质干细胞植入心脏分化成起搏样细胞后发挥起搏功能.②基因转移:将窦房结细胞中的起搏基因通过载体转入心脏,使普通心肌细胞转化成自律细胞从而产生自主兴奋.③基因细胞治疗:将起搏基因转染干细胞后注入心脏,两者共同增强心肌生物起搏功能.尽管目前生物起搏器在大量动物实验中取得成功,但应用于临床仍面临许多问题,随着窦房结细胞起搏机制进一步阐明,心脏生物起搏器必将造福人类.
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组织工程窦房结构建及血管化的新研究与应用进展
背景:理论上组织工程窦房结移植入体内可以建立新的起搏点,并且可以随着机体发育,达到治疗窦房结综合征的目的,但目前仍处于初级的阶段,需要进行不断的探索.目的:总结综述现阶段组织工程窦房结构建的不同方法及心脏组织工程血管化的研究进展.方法:由第一作者检索PubMed数据库及CNKI全文数据库1984年至2016年的相关文献,并进行筛选,归纳和总结.英文检索词为"Vascularize,Tissue Engineering,Sinus Node",中文检索词为"血管化、组织工程、窦房结".阐述组织工程窦房结的构建方法,总结归纳了各种心脏组织工程血管化的重要性及策略,分析组织工程窦房结血管化应用的方法,后组织工程窦房结血管化进行总结和展望.结果与结论:起搏种子细胞的选择大致为窦房结原代细胞,脂肪、骨髓间充质干细胞,胚胎干细胞等.组织工程支架材料更是种类繁多,活体的窦房结本身就处于胶原支架上,因此胶原类材料更为适用于组织工程窦房结.3D打印技术、细胞膜片技术使血管化组织工程窦房结的构建和移植成为可能.移植早期的血液供应,是窦房结移植是否成功的关键,组织工程窦房结血管化的相关文献在仍处于空白状态,内皮祖细胞作为成血管能力较强的细胞已经有了巨大的进展,但是仍有一些缺陷,还面临着重大的挑战.
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细胞工程和基因技术修复已损害的房室传导或建立人工房室通路
背景:利用细胞工程和基因技术治疗缓慢性心律失常具有不需要外来能源,不受机体神经激素调控的特点,是更为接近人体的起搏方式,具有药物和电子起搏治疗所无法比拟的优势.目的:综述目前利用细胞工程和基因技术治疗缓慢性心律失常的进展及存在的问题.方法:检索2000-01/2011-06 PubMed数据库和万方数据库相关文献.结果与结论:基因工程技术治疗缓慢性心律失常早被关注的是β2肾上腺素受体基因、Kir2.1基因,目前研究热门的为HCN基因、AC-VI基因和Tbx3基因.细胞工程中的干细胞移植(包括基因修饰干细胞移植)、细胞融合以及新兴的诱导多能干细胞和成体心肌干细胞移植技术也展示了其治疗缓慢性心律失常的巨大潜能.因此,利用细胞工程和基因技术修复已经损害的房室传导通路或建立一个人工的房室旁路,允许正常的窦性电活动传导至心室是一个更好的选择,但仍很多关键的问题有待解决,比如佳化的房室延迟、自动应答的程序设计、人工通路的位置如何固定等.
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生物起搏:电信号的产生与传导
利用细胞移植结合基因技术构建生物起搏器已取得初步成果,其关键问题在于起搏电信号的产生及其传导.本文将分别从这两个角度总结分析现有的生物起搏器研究,并提出目前存在的问题.
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心脏生物起搏的研究进展
心脏生物起搏主要包括基因生物起搏和细胞生物起搏.生物起搏尚处于动物实验研究阶段,应用于临床还面临许多问题,但是随着基因工程技术和分子生物学的不断发展,生物起搏将成为治疗缓慢性心律失常的新技术.
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ISL-1和Tbx18联合转染对乳鼠心室肌细胞重编程的作用研究
目的:探讨ISL-1和 T bx18联合转染对乳鼠心室肌细胞重编程的作用,及能否在体外构建生物起搏点. 方法:将乳鼠心室肌细胞随机分成空白对照组、GFP组、ISL-1组、T bx18组、ISL-1+ T bx18组,分别转染相应病毒,培养5～7 d后 qRT-PCR 、Western blot和免疫荧光检测超极化激活环核苷酸门控离子通道蛋白亚型4(HCN4)的表达情况,观察细胞形态和搏动频率变化,并用膜片钳技术记录细胞内电流活动. 结果:ISL-1组、Tbx18组和ISL-1+ Tbx18组的细胞搏动频率和 HCN4的mRNA 和蛋白表达水平较空白对照组和 GFP组明显升高,其中ISL-1+ Tbx18组的细胞搏动频率和HCN4的mRNA和蛋白表达水平明显高于ISL-1组和Tbx18组(P均＜0 .05).通过免疫荧光技术,ISL-1组和T bx18组可检测到HCN4不连续表达,ISL-1+ T bx18组 HCN4连续高表达.通过膜片钳技术,ISL-1组和T bx18组均仅有少数细胞可记录到起搏电流活动,而ISL-1+ T bx18组大多数细胞可记录到起搏电流活动. 结论:ISL-1和 T bx18联合表达能提高乳鼠心室肌细胞重编程为起搏样细胞的效率.
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HCN4和Cx45基因导入间充质干细胞构建起搏细胞的实验研究
目的:将小鼠超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(mHCN4)基因和小鼠连接子蛋白45 (mCx45)基因导入大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),构建生物起搏细胞.方法:构建携带mHCN4基因的重组慢病毒转染rMSC,用电压钳记录起搏电流(If);构建携带mCX45基因的重组慢病毒,转染mHCN4-rMSC,与新生大鼠心室肌细胞(NRVM)共培养,记录NRVM的搏动频率. 结果:电压钳记录到mHCN4-rMSC存在电压-时间依从的超极化激活的内向性If;共培养NRVM的搏动频率对照null-rMSC组为(60±5)次/min、mHCN4-rMSC组为(70±7)次/min、mHCN4-Cx45-rMSC组为(79±8)次/min,组间比较均具有显著性差异(P＜0.05). 结论:mHCN4基因导入rMSC可以成功构建生物起搏细胞,mCx45和mHCN4基因共表达可以提高起搏功能.
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生物起搏
应用起搏治疗缓慢性心律失常的历史可追溯到1932年,美国的心胸外科医生Hyman设计制成了一台发条驱动的电脉冲发生器,并为一例心脏停搏的病人成功地使用了这一技术.
关键词： 生物起搏 -
干预NRG-1/ErbB通路对大鼠脂肪干细胞向类窦房结细胞分化的影响
目的 探讨在大鼠脂肪干细胞(ADSCs)向心肌样细胞分化的一定时期内,通过干预NRG-1/ErbB通路是否可调控其向类窦房结样细胞或工作肌样细胞分化.方法 分离培养大鼠ADSCs,免疫荧光测定细胞相关表面抗原鉴定其干细胞特性.取3代ADSCs加入含10 μmol·L-1 5-氮胞苷(5-Aza)和10 μg·L-1 bFGF的培养基处理24 h后分3组向心肌样细胞诱导分化,包括对照组、AG1478组、神经调节蛋白-1(NRG-1)组,取正常培养的为ADSCs组.诱导3周后,通过RT-PCR检测各组NKx2.5、HCN4、TBX3、TBX2基因,Western blot检测TBX3蛋白,膜片钳检测各组动作电位的表达差异.结果 ADSCs加5-Aza 诱导3周后表达心脏早期转录因子Nkx2.5及肌钙蛋白,证明5-Aza可以将ADSCs诱导成心肌样细胞.而AG1478组起搏相关基因(HCN4、TBX3、TBX2)的表达明显强于对照组及NRG-1组(P＜0.05),TBX3蛋白也强于对照组(P＜0.05),并能产生窦房结样动作电位.而NRG-1组Nkx2.5的表达高于对照组及AG1478组(P＜0.05),亦能检测到心室肌样动作电位.结论 在大鼠ADSCs向心肌样细胞分化的一定时间内通过干预NRG-1/ErbB通路可使其定向分化为起搏样细胞或工作肌样细胞,这为今后干细胞生物起搏研究做了有益探讨.
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携带TBX18的慢病毒载体转染脂肪干细胞并诱导其向起搏样细胞分化的研究
目的 观察TBX18慢病毒载体在体外转染脂肪干细胞(ADSCs),能否诱导其向起搏样细胞分化.方法 取40～50g SD大鼠的腹股沟脂肪,采用酶混合消化法分离培养ADSCs,光学显微镜下观察细胞形态,将细胞随机分为TBX18组、GFP组、null组,TBX18组转染携带TBX18转录因子和绿色荧光蛋白(GFP)的TBX18慢病毒, GFP组转染等量的GFP慢病毒作为空病毒对照组,null组不转染病毒作为空白对照组.一周后通过蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测三组相关转录因子TBX3、ISL1、SHOX2,缝隙连接蛋白CX45、CX43、CX30.2及心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白I(cTNI)、肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达量;通过免疫荧光技术检测TBX18组及GFP组的α-SMA蛋白的表达.病毒转染后第7、14、21、28天分别采用实时荧光定量聚合酶链式反(RT-PCR)检测TBX18组及GFP组TBX18及HCN4水平.结果 TBX18组转染ADSCs后,细胞形态发生改变,转染后4周内可通过荧光显微镜下观察到持续的荧光表达,诱导分化后,TBX18组TBX3、ISL1、SHOX2、CX45、CX30.2、cTN1、αSMA蛋白水平明显高于GFP组及null组,而CX43蛋白表达低于null组;TBX18组免疫荧光检测到了α-SMA,而GFP组表达阴性;TBX18组TBX18及HCN4表达在慢病毒转染后4周内持续表达,明显高于GFP组(P<0.05).结论 TBX18慢病毒载体体外转染入ADSCs,能在细胞内稳定表达,且能使其向起搏样细胞分化.
