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人脂肪干细胞的分离培养与鉴定
目的 探索一种体外分离培养人脂肪干细胞(hADSC)的有效方法.方法 选择健康女性5例,年龄25~45岁;无任何其他系统性疾病.对其应用抽脂术获取人脂肪组织,并用Ⅰ型胶原酶进行消化,贴壁培养,传代扩增,绘制不同代数细胞增殖曲线,诱导hADSC向成骨、成脂细胞分化,确定其分化潜能,并分别用茜素红和油红O染色进行鉴定.结果 原代hADSC第2天开始贴壁,形态呈纺锤型,类似纤维细胞,增殖较快,呈漩涡状排列.第3代至第5代hADSC生长曲线类似,都呈S形;成骨、成脂诱导2周后进行茜素红染色和油红O染色,结果都为阳性.结论 通过对抽脂术获得的人脂肪组织进行分离培养,可以得到有效的hADSC,且具有向成骨、成脂细胞方向分化的能力,可作为进一步实验研究的种子细胞.
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胎儿肝干细胞的分离、鉴定及培养
目的:分离、鉴定人胎肝中肝干细胞并短期培养,为体外扩增及诱导分化实验提供细胞来源.方法:采用原位两步胶原酶灌注结合Percoll液密度梯度离心的方法分离、纯化胎肝中肝干细胞,用光镜、电镜观察所得细胞形态,通过免疫细胞化学染色检测细胞AFP、CK19、CD34.测量肝脏重量及获得的肝千细胞数量,计算肝干细胞产量,对肝干细胞进行短期培养.结果:两步胶原酶灌注可有效消化胎儿肝脏结缔组织,分离的肝脏细胞经不连续Percoll密度梯度离心,可得到肝干细胞,细胞活性率为(88.35±2.45)%(n=30).光镜下肝干细胞呈卵圆形,直径约为成熟肝细胞的1/3,电镜下肝干细胞直径约10μm,细胞大部分被卵圆形细胞核所占据,细胞质少,核浆比例大,内质网、线粒体、高尔基体等细胞器不发达.ABC法免疫细胞化学染色显示:胎儿肝干细胞CK19、CD34及AFP呈阳性信号.对肝干细胞进行培养,12 h后肝干细胞逐渐粘附、贴壁、铺展,呈现为圆形、椭圆形,呈上皮细胞样平铺生长.肝干细胞产量为(8.76±0.46)×105个/g(n=15).结论:两步胶原酶灌注结合不连续Percoll液密度梯度离心法可较好地分离纯化胎儿肝干细胞,所得细胞可体外培养,可做为进一步实验的材料.
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家兔髓核间充质干细胞的体外培养与鉴定
①目的 建立家兔腰椎髓核间充质干细胞(NPMSCs)体外培养模型并对其进行鉴定,为进一步研究椎间盘退变提供理论依据.②方法 首先用酶消化法得到家兔原代髓核细胞,再将其加入间充质干细胞完全培养基中分离出NPMSCs并进行传代培养,观察NPMSCs的细胞学及生物学特性.后进行细胞鉴定:运用流式细胞术检测家兔NPMSCs的细胞表面免疫表型CD105、CD90、CD34、CD45的表达情况;运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测间充质干细胞基因SOX2、Nanog的表达.③结果 家兔髓核组织来源细胞在原代培养4～6天后即可见部分细胞贴壁生长,形态为短梭形或多角形.传代后细胞增殖速度明显加快,到第三代可见细胞大多为长梭形,待细胞达到90％ 融合时,可见细胞呈漩涡状生长.通过流式细胞术检测所培养细胞的表面免疫分子标志:CD105、CD90阳性表达,CD34、CD45阴性表达;运用RT-PCR检测所培养细胞可表达干细胞基因SOX2、Nanog.④结论 成功在体外培养出家兔NPMSCs,为研究椎间盘退变的发生发展机制打下基础.
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第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定
背景:有文献证实以酶消化法可获得在脂肪组织间充质干细胞,传至第10代时细胞生长仍良好,但表面标志物表达下降. 目的:分离培养大鼠脂肪组织间充质干细胞,传代至第4代,检测免疫表型. 方法:从6只SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离培养脂肪组织间充质干细胞,以贴壁细胞扩增传代至第4代.相差显微镜下观察脂肪组织间充质干细胞的形态,并用流式细胞术鉴定脂肪组织间充质干细胞的表面标志物CD11b,CD29,CD45,CD49d,CD90 和 CD106的表达率.结果与结论:大鼠脂肪组织间充质干细胞呈现类似成纤维细胞样形态学特征,免疫表型分析显示CD29和CD90 呈阳性,而CD11b、CD45、CD49d和CD106呈阴性反应.结果提示通过这种酶消化法获得的SD大鼠的脂肪组织间充质干细胞,免疫表型分析显示符合间充质干细胞的特征.
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大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定
背景:内皮祖细胞参与血管新生,但其分离、培养、鉴定方法目前并不统一.目的:探索大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及鉴定方法.方法:使用密度梯度离心法及差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,使用Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC 标记的荆豆凝集素1 双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133表达情况.结果与结论:培养前4 d细胞增殖不明显,第5~10 天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成.培养第7 天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1 的功能.流式细胞仪检测体外培养第10 天的细胞,CD133+ 细胞占19.2%,CD34+ 细胞占28.7%,CD34+/CD133+细胞占19.1%.说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞.
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脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞
背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据.目的:动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化.方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增.选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响.取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养.结果与结论:运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性.脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%).细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似.提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性.
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血清剥夺法分离U87细胞系中的胶质瘤干细胞
背景:细胞周期分析已证实,90%以上的干细胞处于G0静止状态,因此采用不含任何生长因子和其他相关营养添加剂的血清剥夺培养基更适合筛选分离肿瘤干细胞.目的:应用血清剥夺法培养胶质瘤U87细胞,并筛选鉴定该细胞系中的胶质瘤干细胞.方法:将U87细胞培养在只含有DMEM和L-谷氨酰胺的培养基中培养6 d,筛选出胶质瘤干细胞,接着更换为神经干细胞培养基,观察细胞肿瘤球的形成过程;将肿瘤球接种于血清培养基,观察其在体外的分化特点;免疫荧光鉴定血清剥夺后尚存的细胞、增殖形成的肿瘤球细胞和分化细胞.结果与结论:应用血清剥夺的方法成功地筛选出了表达CD133的肿瘤干细胞,并能增殖形成肿瘤球;肿瘤球可多向分化,子代细胞表达胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶.说明U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞.
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牙周膜干细胞的研究进展
背景:从牙周膜组织中分离出的牙周膜干细胞被认为是牙周组织工程的首选种子细胞,有自我更新能力,能分化形成牙周的3种组织:牙槽骨、牙周膜和牙骨质.目的:就近年来牙周膜干细胞的分离、鉴定、相关细胞因子等方面进行简要综述.方法:由第一作者检索Pubmed 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)、中国知网数据库(http://www.cnki.net/)2004-01/2010-09有关牙周膜干细胞分离、鉴定、相关细胞因子等方面的文献,英文检索词为"periodontal ligament stem cell",中文检索词为"牙周膜,干细胞".排除重复性研究,终纳入35篇文献进行综述.结果与结论:牙周膜干细胞是一种很有潜力的牙周组织工程种子细胞,能构建组织工程牙周膜,促进牙周缺损的修复.随着研究的深入,影响牙周膜干细胞生物性能的因素逐渐被发现,但其研究还有待进一步完善.
关键词： 牙周膜干细胞 金属蛋白酶整合素28 组织工程 信号分子 细胞鉴定 -
改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞
背景:乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力,可以在短期内获得组织工程需要的细胞量.目的:比较传统酶消化法和改良酶消化法获取人乳牙牙髓干细胞的成功率及生物学特性.方法:取无龋滞留乳切牙12颗,随机数字表法均分为两组,分别应用传统酶消化法和改良酶消化法分离获取乳牙牙髓细胞,在不同代次细胞中检测细胞扩增天数、收获量、生长曲线、倍增时间、克隆形成率、细胞表面特异标记物STRO-1、CD146、CD34和CD45的表达.细胞成骨、成脂诱导分化能力及通过检测碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白表达水平,判定细胞牙向分化潜能.结果与结论:两组细胞生长曲线,扩增天数、细胞收获量及细胞倍增时间相比,差异有显著性意义(P＜0.05)；牙向分化实验结果显示,改良酶消化法碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白较传统酶消化法和对照组而言呈强阳性表达.然而,两组在克隆形成率、细胞表面特异标记物及多项诱导分化等方面差异无显著性意义(P＞0.05).说明改良酶消化法与传统酶消法相比,可在较短时间内完成同源乳牙牙髓干细胞体外扩增培养,可为牙齿再生治疗提供高质量种子细胞,是乳牙牙髓干细胞体外培养的可靠方法.
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人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
背景：内皮祖细胞是成熟内皮细胞的前体细胞，具有新生血管和新生内皮化作用，在许多方面均有广泛应用前景，但其生物学特征及鉴定方法仍存争议。
目的：探索从人外周血分离培养内皮祖细胞的方法并鉴定其生物学特征。
方法：外周采血后应用密度梯度离心法分离成人外周血单核细胞，在内皮细胞全培养基重悬后接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中，体外培养扩增获取人内皮祖细胞并观察其形态变化、生长增殖潜能及细胞表面抗原表达情况，并通过细胞一氧化氮分泌功能测定及体外血管形成实验检测其功能学特征。
结果与结论：体外诱导培养后，六七天形成纺锤样细胞簇，两三周黏附细胞发育形成鹅卵石样外观细胞，逐渐融合呈外生性生长。在相同培养条件下，与人主动脉内皮细胞相比人内皮祖细胞具有高的增殖潜能。人内皮祖细胞表达CD31、CD34、CD144、KDR，表现为典型内皮细胞系表型，此外细胞可摄取ac-LDL并结合UEA-Ⅰ。在功能上内皮祖细胞可分泌一氧化氮并可在Matrigel中形成管腔样结构。提示通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞体外黏附诱导培养可获取人外周血内皮祖细胞；细胞形态、增殖能力、生物表型特征结合细胞功能学的综合性鉴定方法用于内皮祖细胞的鉴定具有一定意义。 -
人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定
背景：目前，国内外研究多采用酶消化法结合免疫磁珠法分离微血管内皮细胞，然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而，如何简化人皮肤微血管内皮细胞分离、培养，同时又能获得到高纯度的内皮细胞体外培养方法成为研究热点。
目的：探索一种简便高效的来源于糖尿病患者皮肤微血管内皮细胞的体外培养方法，观察细胞生长状态并进行鉴定。
方法：利用临床上糖尿病伴足部慢性创面截肢后，肢体近心端皮肤和局部创面周围皮肤真皮浅层组织。经剪碎后采用贴壁法和短时少量应用胰酶法得到人皮肤微血管内皮细胞，传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。
结果与结论：①实验成功获取人皮肤微血管内皮细胞，原代培养的人皮肤微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁，第10天进入对数生长期，第12至13天细胞浓度达80%，传代细胞较原代细胞生长活跃，培养5-7d可长满培养瓶底，呈“铺路石样”排布；②免疫组织化学染色结果显示，培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原呈阳性，细胞阳性率达100%；③MTT 法测得培养第2、4、5代人皮肤微血管内皮细胞的生长曲线呈倒“S”形。④结果证实，应用贴壁法，并在培养过程中少量短时应用胰酶法，可获得大量高纯度的人皮肤微血管内皮细胞。 -
猪心脏瓣膜成肌纤维细胞的分离、鉴定与培养
背景：瓣膜间质细胞是心脏瓣膜中的主要细胞成分，成肌纤维细胞是一种能够表达平滑肌α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原纤维，并具有一定分化潜能的重要的瓣膜间质细胞，不仅在瓣膜的结构中起着支架作用，尤其在瓣膜的正常生理以及病理应答过程中发挥着重要的调控作用。
目的：建立一套可靠的心脏瓣膜成肌纤维细胞分离、原代培养与鉴定的方法，为心瓣膜钙化等疾病的进一步研究奠定基础。
方法：①从猪心中获取主动脉辨，分别用酶联和消化法、普通酶消化法以及组织块种植法提取猪主动脉瓣瓣膜成肌纤维细胞，进行原代培养；②显微镜观察3种方法培养出的成肌纤维细胞的活性和形态；③用光学显微镜和免疫细胞化学方法鉴定细胞。
结果与结论：①3种方法中，利用胰酶和胶原酶Ⅱ联合消化，然后迅速终止消化的方法获得成肌纤维细胞的活性更高，状态更好，纯度更高；②在荧光显微镜下，观察到获得的主动脉瓣成肌纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白染色阳性，抗血管性血友病因子染色阴性，提示培养的细胞为成肌纤维细胞。 -
年龄对猕猴骨髓间充质干细胞体外分化和细胞因子水平的影响
背景:间充质干细胞因其良好的生物学特性和广泛的应用前景而受到关注,但随着个体衰老和体外培养时间的增加,细胞逐渐呈现衰老的特征.非人灵长类动物与人具有相似的生物学特性,在动物模型和疾病治疗研究方面具有独特的优势.目的:分析不同年龄段猕猴骨髓间充质干细胞的增殖和分化情况,探讨年龄对骨髓间充质干细胞的影响及可能机制.方法:通过骨髓穿刺术采集3岁以内和20岁以上雄性猕猴的骨髓,分为幼年组和老年组,每组3只,分离骨髓间充质干细胞进行体外培养,观察其形态变化、增殖能力和分化能力,进行衰老相关的β-半乳糖苷酶染色,ELISA法和蛋白芯片检测细胞因子水平.结果与结论:随着年龄的增长,老年猕猴骨髓间充质干细胞的增殖、分化能力显著降低,衰老细胞显著增加,细胞因子白细胞介素1b、白细胞介素4、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子水平显著降低,肝素结合碱性成纤维细胞生长因子和胎盘生长因子水平显著升高,说明骨髓间充质干细胞的增殖、分化、旁分泌等功能会因衰老而逐渐受到损害.
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人肺鳞癌干细胞的体外分离培养和鉴定
背景：研究显示可从肺癌细胞系中分离出肺癌干细胞，但对于从新鲜肺鳞癌标本中原代培养肺癌干细胞的报道较少。
目的：探索从新鲜肺鳞癌组织标本中分离肺鳞癌干细胞的可行方法。
方法：借助胶原酶消化法、密度梯度离心法和Hoechst33342染料外排法初筛SP细胞，将初筛细胞置于条件培养基分离培养，后续应用流式细胞分析及分选技术，进一步分离纯化肺鳞癌干细胞。实验结合CD133和CD44鉴定目标细胞，并计数第4代细胞CD133+、CD44+及CD133/CD44双阳性细胞的阳性率。
结果与结论：接种后0.5 h细胞贴壁生长，培养第4天形成典型的细胞集落，第7天呈铺路石样外观，细胞数量级可达108。传代培养第4代肺癌干细胞的CD133+、CD44+和CD133/CD44双阳性细胞数明显增多。说明
实验初步从肺鳞癌患者新鲜肺组织标本中分离培养并快速扩增SP细胞，并从中获取更多更纯的干细胞样肺鳞癌细胞，为进一步研究肺鳞癌干细胞的异质性和耐药性奠定基础。 -
组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞
背景：研究显示兔脂肪干细胞的体外分离方法大多数为Ⅰ型胶原酶消化法，采用组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞尚不多见。
目的：采用组织块贴壁法从兔脂肪组织中分离培养兔脂肪干细胞，并进行成脂、成骨的诱导分化。
方法：采用组织块贴壁法分离出兔脂肪干细胞，进行体外培养，观察其形态特征。取对数生长期的第3代细胞，用MTT法绘制其生长曲线；流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况；分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化，油红O、茜素红染色定性鉴定。
结果与结论：体外培养的兔脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态，生长力旺盛。流式细胞术分析结果显示，第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD29，CD44，阴性表达CD45。兔脂肪干细胞经成脂诱导14 d后，油红O染色阳性；成骨诱导培养14 d后，茜素红染色阳性。提示组织块贴壁法可以分离培养出兔脂肪干细胞。 -
骨桥蛋白及其受体在黄韧带骨化症黄韧带细胞中的表达及其意义
背景：黄韧带骨化症的机制尚不明确，骨桥蛋白可能是其骨化过程中重要的影响因素。目的：观察骨桥蛋白及其受体CD44、整合素β3在人黄韧带细胞及人骨化黄韧带细胞中的表达及其意义。方法：胸/腰椎后路减压术中取人骨化节段黄韧带组织和非黄韧带骨化黄韧带组织各8例，均来自成人，两组组织进行体外细胞分离、培养及鉴定，分别行骨桥蛋白、CD44、整合素β3免疫组织化学染色，用倒置相差显微镜观察结果，提取总RNA行半定量PCR检测。结果与结论：免疫细胞化学染色结果显示，黄韧带组织组中骨化节段黄韧带细胞骨桥蛋白、CD44、整合素β3表达强度均大于非黄韧带骨化组(P <0.01)。PCR检测结果显示，黄韧带组织组中骨化节段黄韧带细胞骨桥蛋白、CD44、整合素β3 mRNA表达强度明显强于非黄韧带骨化组(P<0.05)。结果表明，黄韧带骨化时黄韧带细胞中骨桥蛋白及其受体CD44、整合素β3基因表达均升高。
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分离与鉴定人脂肪间充质干细胞来源的外泌体
背景:脂肪间充质干细胞是重要的种子细胞之一,可通过较简单的方法大量提取,但其储存条件较苛刻,运输不便,临床应用较困难.外泌体可由脂肪间充质干细胞分泌,其结构稳定,不易分解,为脂肪间充质干细胞在临床应用提供了新的可能性.目的:提取人脂肪间充质干细胞,鉴定脂肪间充质干细胞,诱导脂肪间充质干细胞多向分化,提取脂肪间充质干细胞来源的外泌体,鉴定脂肪间充质干细胞来源的外泌体.方法:收集青岛大学附属医院医学美容中心的正常成年女性行吸脂术后腹部浅层皮下脂肪组织,用酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞进行原代培养,用细胞贴壁法纯化,胰酶消化传代.选取第3代细胞分别行流式细胞学鉴定,成脂肪细胞诱导与鉴定;成骨细胞诱导与鉴定.取第3-6代脂肪间充质干细胞,收集细胞上清液,差速离心法提取外泌体,BCA法测定蛋白浓度,透射电镜观察外泌体形态,粒度仪测外泌体直径分布,免疫磁珠法和流式细胞学鉴定.结果与结论:①脂肪间充质干细胞形态为长梭形,形似成纤维细胞,排列紧密时呈巢状;②流式细胞学检测显示CD29,CD44,CD90及CD105均为阳性表达,CD34和CD45为阴性表达;③成骨细胞诱导至第9天碱性磷酸酶染色为蓝紫色,诱导至21 d时,茜素红S染色可见细胞外基质内出现红色钙结节;④成脂肪细胞诱导14 d后油红O染色呈橘红色;⑤透射电镜显示外泌体结构为杯状,直径为(81.225±22.226)nm,有膜结构.蛋白浓度约为1.5 g/L,直径分布集中于70-100 nm,外泌体流式细胞学显示CD9,CD29,CD44,CD63,CD90和CD105为阳性表达,CD34和CD45为阴性表达;⑥结果证实,人脂肪间充质干细胞来源的外泌体能通过超速离心法顺利提取,并通过透射电子显微镜、免疫磁珠法和流式细胞学检测相结合的方法成功鉴定.
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冻存人脐带间充质干细胞的分离培养
背景:目前大多数报道是从新鲜脐带中分离培养脐带间充质干细胞,而从冻存脐带组织中分离培养间充质干细胞鲜有报道.目的:从冻存人脐带中分离培养间充质干细胞,并比较多种培养方法获得的脐带间充质干细胞的生物学特性.方法:采用组织块贴壁法从冻存脐带组织中分离培养脐带间充质干细胞,分别用有血清和无血清培养基培养,观察其形态特征,绘制其生长曲线;流式细胞仪检测第3代脐带间充质干细胞(无血清培养基培养)和第14代脐带间充质干细胞(含血清培养基培养)表面抗原表达;第3代脐带间充质干细胞(无血清培养基培养)分别用成脂、成骨、成软骨诱导培养液诱导其分化,qPCR鉴定分化标记基因表达;检测第7代脐带间充质干细胞(无血清培养基培养)及其培养上清中的细胞因子水平.结果与结论:①从冻存人脐带组织原代培养的脐带间充质干细胞,呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛,脐带间充质干细胞可用无血清培养基传代培养,但增殖速率还远低于有血清培养基;②流式细胞术分析结果显示为脐带间充质干细胞CD90、CD73、CD105呈强阳性表达,CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79a/CD19、HLA-DR呈阴性表达;③经成脂、成骨和成软骨诱导培养14-28 d后,脂肪细胞标记基因PPARγ、骨细胞标记基因 Osteonectin、软骨细胞标记基因 CollagenⅡ的表达量显著升高;④第 7 代脐带间充质干细胞及其培养上清可检测出粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素α2、趋化因子 IP-10、白细胞介素4、白细胞介素6等细胞因子;⑤结果提示可从冻存人脐带中培养扩增脐带间充质干细胞.
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人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定
背景：建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前，国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞，然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而，如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤，同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。
目的：探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法，观察细胞生长状态并进行鉴定。
方法：利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织，经两步酶消化法和非连续 Percol 密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞，传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。
结果与结论：实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞，原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁，第10天进入对数生长期，第12至13天细胞浓度达80%，传代细胞较原代细胞生长活跃，培养5-7 d可长满培养瓶底，呈“铺路石样”排布。免疫荧光化学结果显示，培养的细胞中 FⅧ因子与 CD31相关抗原双荧光染色呈阳性，细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒“S”形。结果证实，应用两步酶消化法、非连续 Percol 密度梯度离心法分离细胞，并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞，可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。 -
Y-27632促进人胚胎干细胞向类神经元细胞的分化
背景:Y-27632是Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶抑制剂,已被证实具有调节干细胞的自我更新、促进克隆形成和存活的作用.另外,其对神经细胞生长和发育也具有调节和保护作用.而如何提高胚胎干细胞向类神经元细胞分化是神经损伤修复和神经再生领域热点问题.目的:探讨Y-27632对人胚胎干细胞向类神经元细胞分化效率的作用.方法:取16代人胚胎干细胞复苏后,进行形态观察和染色鉴定,采用悬浮培养法制备类胚体,培养8 d后,进行分组贴壁培养:对照组细胞为常规Sato培养基诱导分化;Y-27632组分别在Sato培养基加入5,10, 20,40 μmol/L Y-27632.培养10 d后进行染色鉴定;10-18 d后,进行免疫荧光染色检测胚胎干细胞分化效率和类神经元细胞突起生长情况.结果与结论:①人胚胎干细胞共表达Oct4和SSEA-3干细胞特异蛋白;②悬浮分化培养8 d后,进一步贴壁培养10 d,可观察到具有神经形态,且表达Tuj-1的类神经元细胞;③经不同浓度的Y-27632诱导后,免疫荧光染色发现贴壁细胞数和Tuj-1阳性细胞数显著增加,提示胚胎干细胞向类神经元细胞分化速率加快,且在浓度为10 μmol/L时为明显;④分化培养18 d后,免疫荧光染色显示,与对照组相比,10 μmol/L Y-27632组的Tuj-1阳性细胞数及突起数和突起长度显著增加;⑤结果说明,Y-27632不仅能够促进人胚胎干细胞向类神经元细胞分化,同时促进类神经元细胞突起的生长.
