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  • 新生兔骨髓基质细胞向成骨样细胞诱导分化

    作者:张林朴;王冠华;代晓华;姚晖

    新研究表明骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)不仅是具有多向分化能和旺盛增殖活力的细胞,还具有特殊的免疫学特性,表达对异体宿主低免疫原性和免疫抑制作用[1].本实验分离培养的新生兔骨髓基质细胞,经成骨诱导可以为成年兔骨修复提供充足的骨组织工程种子细胞.

  • 定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

    作者:张本斯;李庄;王凡;李光忠;羊惠君;李瑞祥

    目的建立体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为成骨细胞的模型,为将MSC3用作骨组织工程的种子细胞奠定基础.方法用成骨添加剂(地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C 50mg/L)定向诱导传代大鼠骨髓MSCs分化为成骨细胞,通过形态学、生长曲线、免疫细胞化学及碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞.结果诱导组具有成骨细胞的形态和生长特点,增殖相对缓慢,但与对照组间的差异没有统计学意义(P>0.05),碱性磷酸酶活性增强.结论建立了体外定向诱导大鼠骨髓MSCs向成骨细胞转化的模型,成骨添加剂不影响细胞的增殖,可迅速大量获得种子细胞.

  • 人骨形成蛋白2基因成骨诱导作用研究

    作者:郭勇;张西正;武继民;李娜;赵红斌;毛艳

    目的:制备一种具有成骨活性的生物材料.方法:将人BMP2-pcDNA3.1质粒添加到壳聚糖-胶原海绵支架材料中,然后将大鼠成骨细胞和成纤维细胞分别接种在该复合材料中,体外培养细胞-支架材料复合物,另外将该材料植入BALBc小鼠皮下,以添加了pcDNA3.1质粒的壳聚糖-胶原海绵支架材料为对照.10天以后,取出细胞-支架材料复合物和皮下植入物,分别检测样品的碱性磷酸酶活性和钙含量.结果:与对照相比,体外培养细胞-支架材料复合物中的碱性磷酸酶活性和钙含量均显著提高;小鼠皮下植入物的碱性磷酸酶活性和钙含量也分别提高了61.5%和16.2%.结论:添加了人骨形成蛋白2基因的壳聚糖-胶原海绵支架材料具有成骨诱导活性,这种材料为骨组织工程中的成骨诱导可能提供一种新的方法.

  • 大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导及鉴定

    作者:郭立达;王捷;夏冰

    目的:研究大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性,探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性.方法:通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs,经条件培养液诱导培养后,进行形态学观察和碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的测定.结果:经过体外成骨诱导的BMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征,同时在诱导2周后表达ALP活性,在结节期和矿化期OCN表达呈阳性.结论:体外成骨定向诱导的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征,可以作为骨组织工程的种子细胞.

  • 大鼠ADSCs、BMSCs、PMSCs体外诱导成骨样细胞的抗原性差异

    作者:马刚;秦书俭;包翠芬;李磊;高源

    目的 探讨大鼠ADSCs、BMSCs、PMSCs诱导成骨后在体外环境下的抗原性差异.方法 体外培养8周龄SPF级近交系Wistar大鼠ADSCs、BMSCs、PMSCs,对细胞进行分离培养,采用CD分子表面标志物鉴定细胞并定向诱导为成骨样细胞,碱性磷酸酶染色、钙结节染色检测细胞成骨分化能力;与同种异体SPF级近交系WKY大鼠脾淋巴细胞共培养检测三者对脾淋巴细胞增殖的影响.结果 第五代(成骨诱导前)CD分子表面标志物鉴定:三种细胞均强表达CD29,极弱表达CD34.成骨诱导28d后经过茜素红染色均可见紫红色钙结节;经过碱性磷酸酶染色后三者均显示深浅不一咖啡色颗粒,Kaplow评级:PMSCs(4分)>BMSCs(3分)>ADSCs(2分).结论 在体外与同种异体脾淋巴细胞共培养试验中,MTT检测显示三种细胞都表现出抑制脾淋巴细胞增殖的作用,数据分析显示三种细胞诱导前后及三者之间横向比较免疫源性的统计学差异没有显著性.

  • 脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

    作者:鞠晓东;娄思权;马庆军;张克;刘岩

    目的研究脂肪间充质干细胞(MSCs)在特定培养条件下向成骨细胞分化,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性.方法取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪MSCs,用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞分化的情况.结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs,能大量稳定增殖传代.在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下,脂肪MSCs的ALP活性增高,Von Kossa染色出现钙结节,OPN、BMP-2免疫细胞化学染色阳性,Western blotting检测到诱导后细胞OPN、BMP-2的表达,且随诱导时间延长表达增强.结论从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs,并能在体外稳定增殖传代,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一.

  • 人滑膜间充质干细胞的分离培养与鉴定

    作者:陈松;符培亮;丛锐军;吴海山;许震宇

    背景:软骨一旦损伤将很难自我修复,组织工程学修复损伤软骨是目前的研究热点。组织工程学中找到合适的“种子细胞”至关重要。滑膜间充质干细胞(SMSCs)因较其他来源的间充质干细胞成软骨能力、增殖能力更强,且细胞容易获取、对机体损伤小等优点,越来越受到研究者的青睐。
      目的:探讨人SMSCs体外分离、培养的方法与步骤,探索对SMSCs进行鉴定的新方法。
      方法:关节镜下获取11例行关节镜手术患者的滑膜组织,按照Pei等[6]的方法分离培养滑膜干细胞;从细胞形态学观察、细胞生长曲线分析、CCK-8测定增殖活力、流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原、对SMSCs进行成脂/成骨/成软骨诱导、免疫细胞荧光染色以及RT-PCR检测成脂/成骨/成软骨相关基因的表达等方面对SMSCs进行鉴定。
      结果与结论:按照Pei等的方法可以成功地从人滑膜组织中分离出干细胞,分离出的干细胞具有间充质干细胞特异性表型和多向分化潜能。

  • 成骨诱导自体脂肪源性干细胞用于修复兔颅骨缺损

    作者:张钦;马真胜;刘建;孟国林;张堑;李毅;张志敏

    目的 探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞在修复骨缺损中的应用前景.方法 提取兔脂肪源性干细胞,成骨诱导,将成骨诱导前后的脂肪源性干细胞种植到自制松质骨支架上,将细胞一支架复合物和单纯支架材料,分别移植至兔颅骨缺损部位.术后14周,处死取材,Micm-CT扫描.结果 与未诱导的脂肪源性干细胞复合支架、单纯支架以及空白处理对比,成骨诱导后的脂肪源性干细胞复合支架成骨量显著增高,差异具有统计学意义.结论 脂肪源性干细胞叮作为骨组织工程的种子细胞,其成骨诱导后与自制松质骨复合植入体内,能显著促进骨缺损的修复.

  • 二磷酸盐和骨碎补总黄酮对诱导后成骨细胞影响的实验研究

    作者:田坤;尹文哲;刘伟;薛震;赵金东

    目的 探索二磷酸盐和骨碎补总黄酮联合作用如何在分子水平发挥作用于成骨细胞,揭示其效果如何.方法 使用诱导方法作用于骨髓基质干细胞,使之转化为成骨细胞;用RT-PCR检验成骨细胞;不同浓度的二磷酸盐或骨碎补总黄酮配制成条件培养基,作用于成骨细胞,并分析生长曲线,分析细胞基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)和胶原酶Ⅰ(collagenase colⅠ)表达情况.结果 骨髓基质细胞经过4周诱导可转化为表达colⅠ和ALP的成骨细胞,经过生长曲线分析,二磷酸盐和骨碎补总黄酮10-4~10-6 mmol·L-1时,对诱导后的成骨细胞有抑制作用;10-8mmol·L-1有促进作用;10-10~10-12 mmo1·L-1不明显,其中10-8mmol·L-1作用强;基因分析后,发现二磷酸盐和骨碎补总黄酮促进成骨细胞表达colⅠ和ALP,且两者合用效果大于单独用药.结论 二磷酸盐和骨碎补总黄酮合用均可促进成骨细胞基因表达,且两者合用效果大于单独用药.

  • 左、右归丸及其拆方含药血清对骨髓间充质干细胞增殖和成骨诱导的影响

    作者:何文智;宋囡;王智民;任艳玲

    目的 观察左、右归丸及其拆方含药血清对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖和向成骨细胞(osteoblast,OB)诱导的影响.方法 运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠BMSCs;分别以左归丸、右归丸、两方共同药、滋肾阴药、补肾阳药、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂(地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠)、诱导剂和空白含药血清组共8组对BMSCs进行干预,采用MTT法检测BMSCs增殖和左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs增殖的影响;流式细胞仪对BMSCs进行鉴定;用PNPP法检测左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs向OB诱导的影响.结果 P4代以后细胞细胞表型CD90呈阳性表达,CD11 b/c、CD45呈阴性表达.左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs增殖和成骨诱导都具有促进作用,左归丸、右归丸、滋肾阴药组与其他组比较效果显著(P<0.05).结论 左、右归丸及其拆方含药血清可以协同诱导剂对BMSCs增殖和成骨诱导具有显著的促进作用.

  • 人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究

    作者:毛丽霞;刘加强;赵晶蕾;王洁;夏韫晖;王博;袁玲君;房兵

    目的:探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。方法:用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、 CD29、 CD34、 CD44、 CD45、 CD90、 CD105的表达。体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况,通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达,未成骨诱导细胞作为对照。结果:人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、 CD29、 CD44、 CD90、 CD105,阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性,21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成,对照组为阴性。成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达,OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。结论:经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,形成钙盐沉积和矿化结节, ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。

  • 特殊富含AT序列结合蛋白2在诱导骨髓基质细胞成骨分化中的作用

    作者:王庆;余优成;顾章愉;毕玮;孙健

    目的 探讨转录因子特殊富含AT序列结合蛋白2(special AT-rich binding protein 2,SATB2)在骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)成骨分化中的作用,以期为牙组织工程筛选种子细胞及调控因子提供实验依据.方法 采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法,分离并鉴定BMSC;构建SATB2表达载体,转染BMSC,设立转染组(SATB2组)、转染空质粒组(Mock组)及未转染组(对照组),蛋白质印迹法及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SATB2蛋白及mRNA的表达,分析SATB2在成骨分化过程中对成骨因子(Runx2、Osx、Atf4及骨涎蛋白)表达的影响.结果 BMSC在体外分离培养后形态呈长梭形或多角形;流式细胞仪分析结果显示第3代BMSC细胞CD29呈阳性表达,CD34呈阴性表达;生长曲线呈S形.satb2基因成功转染至BMSC后,矿化结节明显增多,SATB2组IA值为125974±241,对照组IA值为178 486±406;且迁移速率提高,8 h时SATB2组划痕宽度为(0.72±0.01) mm,对照组为(0.83±0.03) mm.SATB2组Runx2、Osx、Atf 4及骨涎蛋白的表达与对照组相比均增高.结论 获得了均一性较好的牙组织工程种子细胞;明确了SATB2可有效诱导BMSC的成骨分化,为建立具有潜在临床应用价值的种植牙骨整合研究模型提供了实验依据.

  • 脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究

    作者:袁志坚;何文涓;周红;蒋美玲

    目的 分离提取脂肪干细胞(ADSCs),对其进行成脂、成骨的鉴定,并与脂肪颗粒混合移植,观察移植后的脂肪组织的存活情况.方法 取大鼠腹股沟脂肪,磷酸盐缓冲液清洗,0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h,离心,取沉淀,用含10%血清的DMEM培养基进行培养、传代,取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定;另取第3代ADSCs用于移植,分为两组:ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组、脂肪颗粒1.5 mL组,分别移植于大鼠背部两侧,共移植24只大鼠,分别于2周、l、3个月时脱颈椎处死8只大鼠,再取出背部脂肪组织.结果 大鼠AD-SCs成脂、成骨诱导后,经油红O、茜素红染色呈阳性,移植2周、1个月时,两组取出的脂肪组织的体积变化不大;但移植3个月后,取背部脂肪组织,称重:脂肪颗粒1.5 mL组平均重量为(0.4551±0.0024)g,而ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组的平均重量为(0.7798±0.0033)g,两组脂肪组织的重量差异有统计学意义(P<0.05).结论 原代分离、培养的ADSCs生长状况良好,具有向成脂、成骨分化的能力,与脂肪颗粒混合移植后组织的存活率高,并能够改善脂肪颗粒单独移植时的液化吸收情况.

  • 树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导

    作者:陆彩霞;李晓飞;王文广;孙晓梅;仝品芬;匡德宣;代解杰

    目的:探讨树鼩骨髓间充质干细胞( BM-MSCs)的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜进行形态学观察。用成脂诱导液( DMEM/F12+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+1.0μmol/L地塞米松+0.2 mmol/L吲哚美辛+0.01 mg/mL胰岛素+0.5 mmol/L IBMX)和成骨诱导液(高糖DMEM+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+50 ng/mL BMP-2)对分离的树鼩BM-MSCs分别定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果原代和传代细胞为梭形或三角形,可增殖形成克隆。 BM-MSCs成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色可观察到矿化结节。结论密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养树鼩BM-MSCs简便可行,获得的BM-MSCs可体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。

  • 大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响实验研究

    作者:姜健;秦书俭

    了解ADSCs的体外生长规律、生物学特性及成骨诱导分化能力的各种参数,已经成为目前急需解决的问题.本研究通过探讨ADSCs的生长增殖活性以及成骨分化能力,为ADSCs是否可以成为理想的种子细胞以及进一步基础研究和临床应用提供依据.

  • 骨形态发生蛋白在骨修复中的作用及临床应用进展

    作者:颜艳;连小丽;李燕妮;邹慧儒

    骨形态发生蛋白(BMPs)是转化生长因子(TGF)-β超家族成员之一,在胚胎发育、骨及软骨的形成和修复中起着重要的调节作用.BMPs作用机制的复杂性早已被大量细胞与分子生物学研究和转基因动物实验研究所证实.基因工程实现了BMPs的大量生产并应用于临床骨组织工程修复,但要达到理想的修复效果还需结合合适的载体材料,以保证BMPs在手术部位的控制性释放和大的生物活性.目前,BMP-2和BMP-7已获美国食品与药品监督管理局批准被广泛应用于长骨骨折、脊柱融合术及口腔颌面外科等的临床治疗,并取得了令人满意的效果,但同时其引起的副作用也被广泛关注.对BMPs在骨修复中的作用和临床应用新进展进行了综述.

  • 骨髓间充质干细胞的成骨性诱导

    作者:杨武斌;王平;师彬

    目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的效果.方法:采用全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,把生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为两组,对照组用DMEM-LG培养基培养;实验组用含有成骨诱导剂的DMEM-LG培养基培养.结果:全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁且呈梭形;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组(P<0.01),茜素红染色出现阳性的钙化结节.结论:全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性.

  • 左、右归丸含药血清通过p38 MAPK信号通路干预BMSCs成骨诱导的研究

    作者:曲宁宁;何丽娟;何文智;任艳玲

    目的:基于p38信号通路探讨左、右归丸含药血清对BMSCs成骨诱导的机制.方法:运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠BMSCs;分别以左归丸、右归丸、两方共同药、滋肾阴药、补肾阳药、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂(地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠)、诱导剂和空白含药血清组共8组对BMSCs进行干预,采用改良钙钴染色法检测碱性磷酸酶(ALP)表达,采用茜素红染色法检测钙化结节,采用Western blotting法检测核结合因子α1(Cbfα1)和Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、p38、p-p38蛋白表达,采用real time PCR法检测Cbfα1、Col Ⅰ mRNA表达.结果:左、右归丸及滋阴药组可以上调ALP表达,促进BMSCs矿化结节形成,增强Cbfα1、Col ⅠmRNA和蛋白的表达并且可以促进p38蛋白的磷酸化;给予p38特异性阻滞剂SB203580后,各组BMSCs ALP表达下调,矿化结节形成减少,p38蛋白磷酸化水平降低,并且Cbfα1、ColⅠ mRNA和蛋白的表达下降.结论:左、右归丸及其拆方含药血清可能部分通过p38 MAPK信号通路对BMSCs成骨分化产生调控作用的.

  • 电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

    作者:张斌;胡炜;俞兴;朱陵群;徐林;王硕仁

    背景:目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法.但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚.目的:尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓闻充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓.分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养.当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中.实验随机分为3组:空白对照组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组:每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%-70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培葬液,电针刺激.采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d.相差倒置显微镜观察细胞形态变化:茜索红染色结果:细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性:RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达:Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达.结果与结论:①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5-7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象:电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状.②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到育矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应.③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P<0.05):且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P<0.05),但28 d时差异无显著性意义(P>0.05).④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P<0.05).提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.

  • 小型猪富血小板血浆对牙周膜干细胞的成骨诱导

    作者:张远;钟良军;张鹏涛;张源明;徐艳

    背景:组织工程技术为牙周炎致骨组织缺损的修复提供了新的思路.目的:探寻富血小板血浆在小型猪牙周膜干细胞成骨诱导中的作用.方法:采集贵州小型猪静脉血,三次离心制备富血小板血浆.采用组织块法分离培养小型猪牙周膜干细胞,分别将含体积分数0.8%,1.0%,1.2%的富血小板血浆与牙周膜干细胞共同培养3,7,14,21 d,以未添加富血小板血浆的牙周膜干细胞作为对照.结果与结论:体积分数0.8%,1.0%,1.2%的富血小板血浆成骨诱导第14天,碱性磷酸酶活性达到峰值,其中体积分数1.0%的富血小板血浆诱导的细胞碱性磷酸酶活性高,第21天时碱性磷酸酶活性降低.茜素红染色显示富血小板血浆成骨诱导第21天细胞染色呈阳性.单克隆纯化后细胞的生长曲线从第3天起进入对数生长期,第8天细胞数量达到顶峰.说明富血小板血浆具有诱导牙周膜干细胞成骨的能力,以体积分数1.0%时诱导成骨效率优.

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