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贴壁法体外培养小鼠神经干细胞
神经干细胞是神经组织特异性的具有多向分化潜能的一类干细胞[1].国内外对神经干细胞的分离、培养已有较多研究,不同的实验室有不同的培养方法及培养条件.但用贴壁法体外培养神经干细胞的研究很少见报道,本实验成功地用贴壁法对小鼠的神经干细胞进行了分离、培养和细胞鉴定,并对其生长方式进行了观察.现报告如下.
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一种改良大鼠肝脏Kupffer细胞分离方法
目的 观察改良大鼠肝脏Kupffer细胞 (KCs) 分离方法获取KCs的效果.方法 参照Akira提供的方法进行以下改进:① 前灌注液在体灌注,Ⅳ型胶原酶离体灌注消化;② Percoll分离液不连续密度梯度离心;③台盼蓝染色检测分离细胞的活度;④选择性贴壁法纯化获取的细胞;⑤ 吞墨实验、DAB染色及CD163细胞免疫荧光法鉴定所分选细胞.结果 肝脏KCs的获得量为 (3±1.5)×105/g鼠肝,细胞活度＞92%;光镜下细胞呈圆形,培养24 h后呈梭形或多角形;具有较强的吞噬能力,DAB染色呈"煎蛋"样,荧光显微镜下＞99%为KCs.结论 改良的大鼠肝脏KCs分离方法较Akira法能够获取更高纯度的KCs,简捷经济,值得推广.
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组织块半悬浮培养法分离培养大鼠视网膜血管内皮细胞
目的 利用组织块半悬浮培养法分离培养大鼠视网膜血管内皮细胞.方法 分离大鼠视网膜并剪碎,将4～5个碎块半悬浮培养,培养基为含有体积分数10％胎牛血清并滴加重组牛碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液,获得的细胞用Ⅷ因子相关抗体鉴定,并使用传统冻存及复苏的方法保存.结果 24 h组织块生长固定在培养皿中,6d可见细胞从组织块边缘游出,并可见多个细胞集落,16 d基本铺满培养皿.Ⅷ因子相关抗体染色阳性,细胞可持续生长并传代.结论 用组织块半悬浮培养法可以简便的获得视网膜血管内皮细胞,所获细胞性状稳定,可用于进一步实验研究.
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圆锥角膜相关成纤维细胞的培养与鉴定
目的 分离、培养并鉴定人圆锥角膜相关成纤维细胞(HKCs).方法 采用组织块贴壁法培养HKCs和正常人角膜成纤维细胞(HCFs),倒置相差显微镜和电子显微镜下分别观察细胞形态和超显微结构,细胞计数试剂盒-8(CC K-8)法检测细胞增生,Western blot法检测成纤维细胞标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及α1-1型胶原蛋白(COL1 A1)和α1-3型胶原蛋白(COL3A1)蛋白的表达水平. 结果 与HCFs相比,HKCs生长速度较快,胶原纤维变细减少,线粒体肿大,嵴消失,高尔基体明显扩张,内质网严重肿胀.培养后不同时间点2种角膜成纤维细胞A值比较,差异均有统计学意义(F组间=5 023.13,P＜0.01;F时间=38 518.16,P＜0.01),其中同一时间点HKCs细胞A值均明显大于HCFs细胞A值,差异均有统计学意义(均P＜0.01).HKCs和HFCs中α-SMA的相对表达量分别为120.00±5.77和100.00±0.00,COL3A1的相对表达量分别为158.33±4.41和100.00±0.00,COL1A1相对表达量为88.33±1.67和100.00±0.00,HKCs中α-SMA和COL3A1的相对表达量均较HCFs明显升高,HKCs中COL1A1的相对表达量较HCFs明显降低,差异均有统计学意义(t=-3.46,P＜0.05;t=-13.23,P＜0.01;t=7.00,P ＜0.05).结论 成功培养并鉴定HKCs,该细胞适用于建立体外圆锥角膜细胞模型.
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改良的人视网膜血管内皮细胞的培养与鉴定方法
背景 优化人视网膜血管内皮细胞的培养和鉴定方法在视网膜血管性疾病的研究中有重要作用,以往研究者已成功培养了人视网膜血管内皮细胞,但进一步简化其方法并达到获取量大而纯的细胞是基础研究和临床研究的基础. 目的 探索一种更为简便快速、收获量大且纯度高的视网膜血管内皮细胞的改良培养方法,并对目标细胞的抗原表达特点进行分析,比较眼科新生血管性疾病研究中常用的两种血管内皮细胞的标志性蛋白表达情况.方法 利用正常人角膜移植供体眼球分离视网膜组织,采用质量分数2％胰蛋白酶和质量分数0.133％胶原酶Ⅰ用二步消化法获取人视网膜血管内皮细胞,在传统培养方法中采用含质量分数10％胎牛血清的人血管内皮细胞培养液的基础上,添加内皮细胞生长因子-β(β-ECGF)和肝素钠,对分离的细胞进行体外培养,培养皿用纤维黏连蛋白(FN)包被以促进培养细胞的贴壁.观察收获的目标细胞的形态特征,采用活体显微镜进行形态学观察、常规组织病理学观察目标细胞的生长状态,免疫组织化学法检测Ⅷ因子、CD31、CD34在细胞中的表达以鉴定目标细胞. 结果 应用胰蛋白酶、胶原酶二步消化法可成功获取人视网膜血管内皮细胞,原代培养的细胞72 h贴壁,第9～10天细胞达到融合状态,呈铺路石样.常规组织学观察显示,细胞核呈鲜亮蓝色,细胞质呈淡红色.培养的细胞对Ⅷ因子、CD31、CD34相关抗原表达呈阳性反应.结果显示培养的血管内皮细胞均有CD31、CD34同时表达,但其阳性染色程度低于Ⅷ因子相关抗原阳性反应,人脐静脉血管内皮细胞(UVECs)与人血管内皮细胞相同. 结论 在胰蛋白酶、胶原蛋白酶消化法的基础上用含10％优质胎牛血清的人内皮细胞培养基中添加生长因子和肝素钠,并用FN包被培养皿进行体外培养,可达到快速、大量分离和纯化人视网膜血管内皮细胞的目的.
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乳鼠窦房结细胞的原代培养与鉴定
目的:建立一套可靠的窦房结细胞培养与鉴定技术.方法:取Wistar乳鼠的窦房结组织,用差速贴壁技术及BrdU处理法进行原代细胞培养;对培养细胞进行形态学观察,用电生理技术记录细胞的动作电位.结果:在培养的窦房结细胞中观察到有3种不同形态的细胞,即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞,其中梭形细胞多,且形态结构与电生理特征符合窦房结起搏细胞的特点.三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似.结论:①用差速贴壁技术及BrdU处理法进行乳鼠的窦房结细胞培养,是一种可靠的窦房结细胞培养技术.②培养乳鼠窦房结细胞中的梭形细胞即为窦房结的起搏细胞.
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一种简便实用的大鼠Kupffer细胞的分离与鉴定方法
目的:研究一种简便实用的大鼠Kupffer细胞(KCs)的分离与鉴定方法.方法:原位两步灌流法对大鼠肝脏进行冲洗消化;利用Percoll液进行不连续密度梯度离心分离KCs;;选择性贴壁纯化KCs;台盼蓝染色法鉴定细胞存活率;吞噬实验鉴定细胞功能;ED1单克隆抗体免疫荧光细胞化学鉴定KCs;显微镜下观察KCs形态变化.结果:获取的KCs数量为(2.41±0.32)×107/只,其中活细胞数量占(92.3±2.12)％;吞噬实验显示(95.2±2.58)％的细胞内存在碳素颗粒;免疫荧光化学检测证明KCs纯度为(96.3±1.46)％;在显微镜下观察KCs形态,36h细胞形态变得不规则,3d后呈星形或多角形,体外培养可以存活7～10d.结论:此种KCs分离方法操作相对简便,获取的细胞数量、活性功能、纯度等方面均能达到进一步的实验要求,值得推广.
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人膀胱癌组织中成纤维细胞的培养和鉴定
目的:探索人膀胱癌组织中成纤维细胞的培养和鉴定方法,为其功能的研究奠定基础.方法:分别应用组织块法、消化法进行人膀胱癌组织中成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、透射电镜观察细胞内部结构和免疫组化方法检测细胞膜波形蛋白(vimentin)、角蛋白(keratin)表达情况对细胞进行鉴定.结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,消化法4天后可见细胞贴壁,均于5周左右细胞基本长满培养瓶底.首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第二次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3、4代基本可获纯的含单个核的长梭形纤维样细胞.取第5、6代状态良好的细胞常规准备后进行透射电镜检查和免疫组化染色:电镜提示细胞内可见明显的粗面内质网、高尔基体和(或)微丝结构,线粒体数量少,分布不均;免疫组化结果为vimentin染色阳性,keratin染色阴性.结论:只要给细胞创造良好的生长条件并正规操作,组织块法和消化法均可成功地进行人膀胱癌组织中成纤维细胞的原代培养;因与恶性肿瘤细胞相比,成纤维细胞的优势生长并不明显,故细胞的纯化工作极为重要.
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不同乳腺癌干细胞亚群的自我更新和致瘤能力差异
目的 分析原代培养乳腺癌细胞中不同乳腺癌干细胞亚群的自我更新、致瘤能力差异.方法 采用流式细胞术和免疫荧光实验,从乳腺癌原代培养细胞中分选、鉴定CD44+CD24-/low、ALDH1+和ALDH1+CD44+CD24-/low细胞亚群,分析各分选细胞占总肿瘤细胞的比例;通过克隆形成实验观察各组细胞的自我更新能力;通过裸鼠致瘤实验观察各组细胞的致瘤能力.结果 CD44+CD24-/low细胞占总细胞比例的7.2％,ALDH1+细胞所占比例为4.6％,ALDH1+CD44+CD24-/low细胞所占比例为1.5％.三组细胞自我更新和致瘤能力由强至弱依次为ALDH1 +CD44+CD24-/low、ALDH1+、CD44+CD24-/low细胞,各组细胞间比较差异均存在统计学意义(P＜0.05).结论 乳腺癌组织中CD44+CD24-/low、ALDH1+和ALDH 1+CD44+CD24-/low三组乳腺癌干细胞亚群之间的自我更新和致瘤能力有明显差异,ALDH1+CD44+CD24-/low亚群细胞具有强的自我更新和致瘤能力,提示ALDH1+CD44+CD24-/low可能是更具有特异性的乳腺癌干细胞标志物.
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DNA酶Ⅰ抑制细胞聚集降低骨髓间充质干细胞静脉注射发生急性肺栓塞的风险
目的:探索DNA酶Ⅰ处理后骨髓间充质干细胞降低急性肺栓塞的发生.方法:体外培养小鼠骨髓间充质干细胞.C57小鼠分PBS注射组、10 U/mL DNase Ⅰ-PBS注射组、正常BMSCs注射组、DNase Ⅰ处理后BMSCs注射组.PBS注射组与正常BMSCs注射组尾静脉注射PBS或临界致死剂量的BMSCs,脏器组织学检测,PBS注射组对照,观察急性死亡率；比较正常BMSCs与DNase Ⅰ处理后BMSCs体外增殖、分化能力和悬液中细胞聚集状态；DNase Ⅰ处理后BMSCs注射组注射DNase Ⅰ处理后3×106个BMSCs 5 ml/kg观察急性死亡率.结果:PBS注射组相比正常BMSCs注射组急性死亡率为60％、心肺异常、肺血管内异染物质,急性肺栓塞；DNase Ⅰ预处理不影响BMSCs体外增殖分化能力；DNase Ⅰ处理BMSCs较正常BMSCs聚集成团细胞比例显著下降.DNase Ⅰ处理后BMSCs注射组的急性死亡率为23.3％,与正常BMSCs注射组比较差异显著.结论:DNase Ⅰ预处理不影响BM-SCs的生物学特性并能抑制单细胞聚集降低静脉注射BMSCs所导致的急性肺栓塞.
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大鼠脑皮质微血管内皮细胞的原代培养和鉴定
目的 分离、培养、鉴定大脑皮质微血管内皮细胞(brain microvaseular endothelial cells,BMECs),旨在建立一种可以有效获取较高纯度和产量的BMECs的方法.方法 取出生3～5 dSD大鼠,采用匀浆、二次酶消化、梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于明胶包被的培养板中进行原代培养,倒置相差显微镜观察细胞的形态学特性,细胞免疫荧光化学染色检测血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原的表达,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长曲线.结果 培养6～7 d细胞呈典型的短梭形、多角形和“鹅卵石”样.微血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性,纯度达(96.70±1.53)％.细胞在6～8 d达到生长高峰.结论 成功地分离培养出了高纯度的BMECs,为进一步研究BMECs的生物学特性奠定了基础.
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嗜麦芽窄食单胞菌下呼吸道感染19例
近年来由于广谱抗生素的广泛应用,致使细菌的耐药性增加,其中对多种抗生素耐药的嗜麦芽窄食单胞菌感染呈上升趋势,成为医院感染的重要病原菌之一[1].2001年10月～2002年10月,我院使用VITEK全自动细胞鉴定/药敏分析仪对下呼吸道嗜麦芽窄食单胞菌进行了检测,现报告如下.
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成体小鼠肝脏卵圆细胞的分离及培养
目的 建立一种稳定的成体小鼠卵圆细胞的分离和培养方法 .方法 采用喂饲2-乙酰氨基芴(AAF)加2/3肝切除方法 诱导肝脏卵圆细胞的增殖.经门静脉灌注消化法和等密度离心法分离卵圆细胞,并在体外进行长期培养.免疫荧光和免疫双标法对培养的卵圆细胞加以鉴定.结果 体外培养的卵圆细胞呈集落样生长,稳定传代并已培养至3个月.免疫荧光和免疫双标法证实培养的细胞为卵圆细胞,并显示该细胞具有分化潜能.结论 该方法 是一种稳定的成体小鼠卵圆细胞的分离和培养方法 ,为肝脏干细胞的相关研究和应用奠定基础.
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低氧上调大鼠PASMCs钙激活性氯离子通道表达的ERK1／2通路机制
目的：探讨钙激活性氯离子通道2（ calcium－activated chloride channel 2， CLCA2）在大鼠低氧性肺动脉平滑肌细胞（ pulmo－nary artery smooth muscle cells，PASMCs）中mRNA和蛋白表达的变化及其与ERK1／2信号通路的关系。方法：取14只雄性SD大鼠，使用酶消化法进行PASMCs原代培养，应用小鼠抗大鼠SM α－actin免疫荧光细胞化学法进行细胞鉴定；经培养鉴定PASMCs随机分为常氧组（N组，n＝6）、低氧组（H组，n＝6）、DMSO对照组（D组，n＝6）、U0126干预组（U组，n＝6）和stau－rosporine aglycone干预组（ SA组，n＝6）；采用免疫印迹法检测CLCA2蛋白的表达，选用RT－PCR技术测定CLCA2 mRNA水平的表达。结果：与N组比较，H组PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表达量均显著上调（均P＜0．01）；与D组比较， U组CLCA2 mRNA和蛋白的表达均明显上调（均P＜0．01），SA组mRNA的表达显著下调（P＜0．01），蛋白的表达轻微下调（但P＞0．05）。结论：低氧可上调大鼠PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表达；ERK1／2通路抑制剂U0126能上调PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表达；ERK1／2通路激活剂staurosporine aglycone可下调PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表达。
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小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定
目的 探讨小鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)实用可行的分离、培养及鉴定方法. 方法 改良密度梯度离心法分离出小鼠骨髓单核细胞,经差速贴壁法筛选后在内皮细胞生长培养基-2 MV培养液中培养,倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数试剂盒-8检测细胞增殖力,流式细胞技术鉴定细胞表面标志,管腔形成实验检测其成管腔能力,荧光显微镜检测吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AC-LDL)及异硫氰酸荧光素-荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)及功能. 结果 初期细胞呈圆形;培养4d细胞后开始转变为短梭形;培养7d呈现集落样生长,数量逐渐增多;培养14d后细胞呈短梭、三角等不同形态;培养21d细胞呈现典型“铺路石”样改变.流式细胞技术检测出:CD34+细胞占84.3％,VEGFR2+细胞占74.1％,而CD45+细胞只占到4.04％,该细胞能在Matrigel基质胶上形成管腔样结构,并具有吞噬DiI-AC-LDL及结合FITC-UEA-1功能. 结论 通过对前人经验的改良及反复探索,寻找到了一套小鼠骨髓EPCs分离、培养、鉴定的可靠方法,此方法所获得的EPCs增殖能力良好,数量多,生物学特性稳定,可为相关后续研究提供理想的种子细胞.
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应用长春新碱分离与鉴定U87细胞系中的胶质瘤干细胞
背景与目的:研究表明,肿瘤干细胞具有化疗抵抗性.本研究拟利用肿瘤干细胞对化疗药物耐受的特性,在培养基中添加长春新碱的方法从人胶质瘤细胞系U87中分离鉴定肿瘤干细胞.方法:U87细胞于含血清培养基中贴壁后,换用含有5 ng/ml长春新碱的神经干细胞培养基培养,获得第一代肿瘤细胞球后,将单细胞接种于神经干细胞培养基中,获得第二代肿瘤细胞球.免疫荧光检测巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)在第二代肿瘤细胞球及其分化细胞中的表达.结果:成功地获得了第一代肿瘤细胞球以及来源于单细胞的第二代肿瘤细胞球;细胞间紧密相贴,表面较光滑;神经干细胞标志物nestin在第二代肿瘤细胞球中呈阳性表达;第二代肿瘤细胞球分化细胞中可检测到nestin、GFAP、β-tubulin Ⅲ、MBP的表达.结论:U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞,采用神经干细胞培养基中添加长春新碱的方法能简单有效地从胶质瘤细胞系中分离培养出胶质瘤干细胞.
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胚胎大鼠神经干细胞的体外培养与鉴定
目的利用无血清培养和细胞克隆培养技术从孕鼠(14 d)胚胎中分离出神经干细胞,并进行传代培养和诱导分化.方法采用免疫细胞荧光化学染色方法观察不同代数细胞克隆球中nestin、neuN、GFAP阳性细胞比例,鉴定培养的原代和传代的细胞类型.结果随着传代次数增加,克隆球中nestin阳性细胞的比例无明显变化(P＞0.05),不同代数的神经干细胞克隆球诱导分化后均有一定比例的neuN与GFAP阳性细胞.结论证实从胚胎大鼠大脑皮层分离培养的细胞是神经干细胞,提示体外培养体系中培养的神经干细胞可以长期传代并保持干细胞的特性.
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改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞的研究
目的 探索应用改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞并对细胞进行鉴定.方法 选取18～26岁健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿30颗,采用改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞并通过对细胞的形态观察、细胞表面标记物检测、多向分化能力检测和生长曲线检测等方法鉴定人牙髓干细胞.结果 对人牙髓组织经改良组织块酶消化法原代培养得到的细胞形态类似于成纤维细胞和间充质细胞,生长曲线为S型,细胞表面标记物检测显示间充质干细胞标记物CD29、CD44、CD90表达阳性,造血干细胞表面标记物CD34、CD45、CD106表达阴性,同时细胞具有多向细胞分化的能力.结论 应用改良组织块酶消化法可以从人牙髓组织中成功原代培养人牙髓干细胞.
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人恶性脑膜瘤原代细胞的培养及小鼠颅内原位成瘤模型的建立
目的 培养稳定的恶性脑膜瘤原代细胞以及建立颅内原位成瘤模型.方法 改良法培养术前高度可疑恶性脑膜瘤原代细胞,稳定传代后细胞免疫荧光鉴定;将细胞用立体定向仪接种于6只裸鼠大脑右侧顶叶,同时用注射器种植于6只裸鼠皮下;6周后处死裸鼠,HE染色和免疫组化检测肿瘤的增殖以及对周边脑组织的侵犯.结果 成功培养并稳定传代恶性脑膜瘤原代细胞(术后病理:间变型恶性脑膜瘤),细胞免疫荧光检测Vimentin(+)和EMA(+),生长曲线呈"S"型,FITC法流式细胞术检测Q3区域占95.99±2.58%;6周后,皮下成瘤组可见明显肿瘤结节,原位成瘤组裸鼠明显消瘦;成瘤组织切片染色皮下成瘤组和颅内成瘤组Ki-67表达约36±5.35%,颅内成瘤组周边脑组织侵犯明显.结论 成功培养人恶性脑膜瘤原代细胞并实现稳定传代,首次探究人恶性脑膜瘤原代细胞原位成瘤模型的建立.
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改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞
目的 应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞.方法 15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2.95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desnun)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型.结果 α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%.在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性.三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组.结论 结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞.
