首页 > 文献资料
-
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。
目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。
方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。
结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 -
新生鼠真皮细胞的分离培养及其毛囊诱导能力的鉴定
目的 成功地体外分离培养新生鼠的真皮细胞,为毛囊组织工程提供种子细胞.方法 应用中性蛋白酶和胶原酶消化法分离新生鼠皮肤的真皮细胞,进行体外培养后观察细胞的形态变化,并采用细胞免疫组织化学方法及细胞体外移植法检测其毛囊的诱导能力.结果 新生鼠的真皮细胞体外培养生长状况良好,呈成纤维细胞样,CD133、多能聚糖表达呈阳性.结论 新生鼠真皮细胞体外培养生长稳定,具有较强的毛囊诱导能力,可为其在毛囊组织工程中的应用奠定基础.
-
兔骨髓源性单核细胞分化为血管内皮祖细胞的体外研究
目的 探讨采用密度梯度离心法和差速贴壁法分离兔骨髓源性血管内皮祖细胞,并对分离细胞进行培养及鉴定.方法 通过细胞形态观察、免疫荧光染色、管腔形成实验以及低密度脂蛋白吞噬和植物凝集素贴附实验进行鉴定.结果 分离培养的细胞呈多角形生长,细胞能够形成放射样克隆集落,细胞表达血管假性血友病因子(vWF),在基质胶呈管腔样生长,吞噬低密度脂蛋白并能够黏附植物凝集素.结论 采用密度梯度离心法和差速贴壁法分离兔骨髓源性干细胞,在一定条件下能分化成为血管内皮祖细胞.
-
人脂肪干细胞的分离、培养及鉴定
目的:探讨胶原酶消化法从人脂肪组织中提取脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的可行性.方法:采用胶原酶消化法将真空抽脂术抽取的新鲜脂肪组织进行消化分离,获取ADSCs并进行培养,用流式细胞术鉴定ADSCs的表面特异性标志物CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果:利用胶原酶消化法可成功提取ADSCs,其标志物CD44和CD105表达阳性,CD34为低表达,CD45表达为阴性.结论:通过胶原酶法可成功提取人ADSCs.
-
人脐血来源CD34+内皮祖细胞的分离、培养、鉴定及集落形成特性
目的:分离、培养及鉴定人脐血来源的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),对内皮克隆形成细胞(Endothelial colony-forming cells,ECFCs)与内皮细胞集落形成单元(Endothelial cell colony-forming units,CFU-ECs)进行鉴别和界定.方法:应用流式细胞术、RT-PCR、免疫荧光、Dil-Ac-LDL摄取、集落形成和成血管实验等多种方法对两类细胞进行鉴别及界定.结果:ECFCs和CFU-ECs表达相同内皮细胞表面抗原,如VEGFR-2、CD31、CD144、CD105和CD146.而CD45和CD14在两者的表达存在差异,CFU-ECs表面强表达,ECFCs表面几乎检测不到.另外两者在集落形态、细胞增殖能力、Dil-Ac-LDL摄取和体外成血管能力等方面均存在明显差异.结论:CFU-ECs可能是造血干细胞源性的细胞集落,并非真正的EPCs.而ECFCs为真正意义上的EPCs,在组织工程和临床等方面有极大的应用前景.
-
大鼠附睾脂肪间充质干细胞的分离培养和鉴定
目的 成功体外分离培养大鼠附睾脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC),为组织工程提供种子细胞.方法 应用胶原酶消化法分离大鼠ADSC,进行体外培养、连续传代,并观察细胞的形态变化;细胞计数绘制生长曲线;用MTT比色法测定细胞增殖活性;用流式细胞仪检测细胞周期;采用细胞免疫荧光化学方法检测表面标记.结果 ADSC体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,增殖活跃,传代稳定,Vimentin、CD105表达阳性,α-SMA、CD31不表达.结论 大鼠ADSC生长稳定,增殖能力活跃,便捷的分离培养方法能为其在组织工程中的应用奠定基础.
-
食管上皮细胞的体外原代培养及形态学观察
食管上皮细胞为未角化的复层鳞状上皮,我们借鉴了表皮细胞的培养方法[1,2],摸索了新生牛食管上皮细胞体外原代培养的条件,并进行了形态学观察和细胞鉴定.
-
应用流式细胞分选技术高效纯化大鼠视网膜神经节细胞及其鉴定
目的 探索一种高效、稳定的纯化视网膜神经节细胞(RGC)方法.方法 结合免疫抗体吸附方法,利用流式细胞仪分离新生大鼠RGC,并采用流式细胞及荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测分选RGC的纯度.结果 新生SD大鼠视网膜混合细胞为(4.37 ±0.22) ×106个/视网膜,通过流式细胞仪分离出Thy1.1阳性的RGC为(5.70±0.21) ×103个/视网膜;荧光定量PCR及流式细胞分析结果均显示此方法分离的RGC细胞纯度高,可达90.11％,且纯度高低可控.结论 通过流式细胞分选技术可获得较高纯度的RGC.该方法分选速度快、稳定,为深入开展RGC的体外研究,提供了一种理想的、基于流式细胞仪的细胞快速分离纯化方法.
-
肿瘤干细胞研究现状
近年来,对肿瘤干细胞的研究已经成为热点.研究发现一小部分肿瘤细胞具有干细胞特性,即具有自我更新、无限增殖与分化潜能,这部分细胞就是肿瘤干细胞.目前已经在多种肿瘤中发现并鉴定出肿瘤干细胞,包括白血病、乳腺癌、脑肿瘤、肝癌、结肠癌等.本文就肿瘤干细胞的概念、存在证据、研究方法以及临床应用前景作一综述.
-
大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定
利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14 d)胚胎中分离出神经干细胞,并进行传代培养,采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达,同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型.证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力,并表达神经巢蛋白,分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原,为中枢神经系统的干细胞.
-
SD大鼠胚胎神经干细胞分离、培养及鉴定
目的 体外培养并鉴定神经干细胞,为相关实验研究奠定基础.方法 分离SD大鼠胎鼠的间脑,加入神经生长因子EGF和bFGF在神经干细胞条件培养基中克隆培养.用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞.结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力,表达神经巢蛋白(nestin),并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞.结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法,可用于进一步的实验研究.
-
牙再生研究中干细胞的分离、培养和鉴定技术
日趋成熟的成体干细胞体外分离、培养、定向诱导分化和鉴定技术,使牙再生研究取得了显著进展.继牙髓干细胞成功分离培养并用于牙再生研究之后,相继利用牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞作为牙再生的种子细胞,取得了令人瞩目的 成果.本综述从上述种子细胞的分离、培养、鉴定等方面阐述牙再生研究中的干细胞技术.
-
小鼠成纤维样滑膜细胞原代培养的影响因素研究
目的：基因敲除小鼠已广泛用于关节疾病的研究中。文中探讨小鼠关节处理方式、消化酶种类及胶原酶消化时间3种因素对获取原代成纤维样滑膜细胞（ fibroblast-like synoviocytes ， FLSs）数量的影响。方法将12只雄性SPF级小鼠，采用打开关节（6只）与不打开关节（6只）的方法处理双后肢，使用Ⅳ、Ⅱ型胶原酶消化分离原代细胞，差速消化法逐代纯化FLSs。倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞种类、活力与纯度。结果不打开关节处理获得的FLSs数量[（24933±503）个]显著高于打开关节处理获得的数量[（19133±115）个]，差异有统计学意义（ P＜0．05）；连续收集消化单支后肢1～7 h细胞悬液， FLSs数分别为（700±300）、（600±100）、（15200±900）、（5100±800）、（2700±300）、（900±200）、（300±100）个，以3 h的FLSs 数量多。Ⅳ型胶原酶消化所得FLSs 细胞总数[（24900±500）个]明显高于Ⅱ型胶原酶[（18100±400）个]，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论消化培养小鼠原代FLSs，建议不打开关节，使用Ⅳ型胶原酶消化，取2～6h消化的细胞悬液进行后续培养。
-
我国肝脏相关干细胞的研究现状
2004年我国在肝干细胞研究方面获得的成果颇丰,分别在干细胞的分离富集、细胞因子调控、体内外定向诱导分化、细胞鉴定以及细胞移植等方面均取得了较大进展.有数项政府基金资助的研究项目结题并进行了报道.综观这些研究报告,虽然还处于基础研究阶段,但其先进性并不逊色于国外,已向临床治疗肝病的研究迈出了坚实的一步.在2004年3月11日的
报道"胚胎国家"(an embryonic nation)一文中详细介绍和较高地评价了中国的干细胞研究情况,认为在西方国家对该方面研究还很敏感的情况下,中国"对胚胎技术相对宽松的条件使其有可能成为该领域的世界领头人".我国的干细胞研究成为能与国际上起点相近不多的科研项目.当然,与国际上的总体研究水平相比,和其它领域一样也存在着研究机构散、深度和系统性差的问题.因此缺乏说服力,这也是很少能被国外文献所引用的一个主要原因.现就我国在肝干细胞方面的研究状况,参考近几年国内有关肝干细胞研究报告作一简述. -
鼻咽癌细胞株CNE-2Z中肿瘤干细胞样细胞的悬浮培养与鉴定
目的 探讨鼻咽癌细胞株CNE-2Z中肿瘤干细胞样细胞的富集与鉴定方法.方法 鼻咽癌细胞株CNE-2Z细胞普通培养至对数生长期,不同密度细胞分别加入无血清培养液中继续培养,制备第9天无血清培养细胞爬片,CD133和CD44克隆抗体免疫组化染色,电镜观察超微结构.结果 无血清悬浮培养至第9天时,以1×l05/ml细胞密度组活细胞比率高;普通培养细胞爬片的CD133和CD44细胞强阳性率分别是2.71%和3.00%,而无血清培养细胞爬片的CD133和CD44强阳性率分别为66.7%和67.00%(P＜0.01),表现正相关(P＜0.01);扫描电镜和透射电镜观察显示,阳性细胞表现特殊的超微结构特点.结论 无血清悬浮培养法可富集鼻咽癌细胞中的肿瘤干细胞样细胞,CD133和CD44可作为其特异性表面标志物.
-
人皮肤角质形成细胞的胰蛋白酶消化分离及无血清培养
目的探索用DMEM-SF培养基对经胰蛋白酶两步消化分离的人角质形成细胞进行培养的方法和条件. 方法取临床整形外科手术后剩余皮肤,用0.25%的胰蛋白酶经冷和温两步消化分离后,用DMEM-SF完全培养基于5% CO2、37℃培养,绘制生长曲线,并用单克隆抗角蛋白抗体和鼠-IgG免疫组化试剂盒进行细胞鉴定. 结果用胰蛋白酶两步消化分离的角质形成细胞在DMEM-SF培养基中可正常生长2周以上,生长曲线显示细胞在第4天进入对数生长期,第10天进入停滞期.鉴定显示角质形成细胞占95%以上.来源于3个不同个体的皮肤角质形成细胞经等量混合后培养与单独培养相比,细胞生长无统计学差异. 结论用胰蛋白酶对人皮肤进行冷和温两步消化分离的角质形成细胞,在DMEM-SF完全培养基中生长状况良好,其他细胞污染少,实验成本低廉,操作简单.
-
家兔腰椎纤维环细胞的培养与鉴定
目的:建立家兔腰椎纤维环细胞体外培养模型并对其进行鉴定,为进一步研究椎间盘退变提供理论依据.方法:用酶消化法得到家兔原代纤维环细胞,再用差速贴壁法及自然消化法得到传代后纯化的细胞,观察纤维环细胞的细胞学特征,MTT法绘制细胞生长曲线,用间接免疫荧光法联合Hoechst核染法、免疫组织化学法分别检测纤维环细胞特征性表达产物Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白,进行细胞鉴定.结果:初贴壁的细胞呈类圆形,很快伸展为短梭形,传代后细胞逐渐伸展为长梭形或多角形,第四代后细胞开始老化;纤维环细胞表达Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白.结论:成功在体外培养出家兔腰椎纤维环细胞,为研究椎间盘退变的发生发展机制提供基础.
-
大鼠外周血内皮祖细胞分离培养与鉴定
目的 获得大鼠外周血内皮祖细胞(EPCs)并进行鉴定.方法 首先采用密度梯度离心法获得大鼠外周血单个核细胞,然后用EGM-2完全培养基体外培养条件下诱导单个核细胞分化为靶标细胞,后分别用EPCs特异性标记物CD133和Flk-1检测及内吞乙酰低密度脂蛋白(ac-LDL)和荆豆凝集素-1(UEA-1)的能力,识别和鉴定靶标细胞.结果 靶标细胞培养至第6天呈纺锤形,梭状排列,具有与典型EPCs形态一致的生物学特征,CD133及FLK-1双抗体荧光检测结果阳性,内吞ac-LDL及UEA-1的能力实验结果阳性,证明该纺锤形细胞为EPCs.结论 通过密度梯度离心法及多细胞因子诱导大鼠外周血单个核细胞获得EPCs的方法可行,该方法可为EPCs的基础研究及临床应用提供理论与实验方法学基础.
-
SD大鼠肝脏枯否细胞分离方法改进研究
目的：研究一种简单、高效、实用并且稳定的SD大鼠肝脏原代枯否细胞( KCs)的提取及培养方法。方法选择体质量200 g左右的健康SD雄性大鼠,采用0．05% IV型胶原酶在体原位灌注法结合剪碎法,37℃水浴振荡20 min,经30%和60%Percoll密度梯度离心后,再经40% Percoll离心及贴壁法纯化提取KCs。倒置显微镜下观察细胞形态,并用台盼蓝染色实验鉴定细胞活力,吞墨实验观察细胞吞噬功能及流式细胞术鉴定细胞纯度。结果每只大鼠平均肝脏KCs的获得量为(1．00±0．20)×107(n=20),细胞活力为(92．34±0．15)%,细胞纯度均在(93．56±0．24)%。结论改良的SD大鼠肝脏KCs提取方法操作简单,效果可靠,可为今后KCs的研究奠定基础。
-
成人骨髓源内皮祖细胞的体外分离培养及鉴定
目的 探讨成人骨髓源内皮祖细胞(EPCs)体外分离培养的可行性.方法 抽取成年男性骨髓,体外全骨髓培养,传代后采用免疫微珠分选方法收集CD+133细胞,EGM-MV2条件培养基诱导培养EPCs,观察细胞形态、生长情况；采用流式细胞技术检测分选细胞纯度,免疫荧光法检测EPCs特殊分子标志物CD34、CD133和VE-cadherin表达,透射电子显微镜观察分选细胞超微结构,UEA-1和Dil-ac-LDL双染色法检测分选细胞的吞噬功能.结果 分选后细胞培养第3天出现集落样生长,集落边缘细胞形态伸展呈梭形或多边形,传代后呈现串珠样排列；培养至5～6 d,细胞连接成大片条索状结构；CD+34、CD+133细胞百分率分别为24.13％、93.29％,其表面特异性表达CD133、CD34、VE-cadherin,具有EPCs形态特征,能吞噬Dil-ac-LDL并结合UEA-1.结论 成人骨髓来源的EPCs经体外培养后形态、增殖率、生存能力、表面标志表达、功能等均较为稳定,可作为心血管组织工程种子细胞或用于干细胞治疗.
