首页 > 文献资料
-
人外周血滤泡辅助T细胞的分选鉴定与功能检测
目的:探索分选、鉴定和检测人外周血滤泡辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh)功能的方法.方法:使用密度梯度离心(density gradient centrifugation,DGC)、免疫磁珠分选(magnetic-activated cell sorting,MACS)和流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分选法来分选人外周血Tfh细胞,分选后使用FCM检测细胞纯度和活性,实时荧光定量PCR检测细胞群的特异性转录因子B细胞淋巴瘤因子(B-cell lymphoma,Bcl)-6 mRNA的表达,激光共聚焦显微镜观察细胞形态和表面分子CD4、CXCR5的表达及定位,鉴定后使用FCM进行功能检测.结果:①FCM检测经分选后Tfh细胞纯度达(87.69±5.01)％,活性达(98.21±0.85)％,纯度和分选前有显著提高(P＜0.05).②实时定量PCR检测分选后的Tfh细胞群的Bcl-6 mRNA相对表达量显著高于分选前(P＜0.05),分选后的Tfh细胞群具有高纯度.③激光共聚焦显微镜观察到分选后的Tfh细胞形态完整,CD4及CXCR5的荧光表达于细胞膜并可以融合.④FCM可检测分选鉴定后Tfh细胞功能相关的表面分子PD-1、ICOS、CD40L的表达.结论:采用DGC+MACS+FCM,经鉴定可以得到纯度高、活性好的Tfh细胞,并可以开展其功能检测.
-
组织块法培养大鼠肺微血管内皮细胞的综合鉴定
目的 为组织块法培养的大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVECs)建立合理可靠的多指标综合鉴定方案.方法 采用外周肺组织贴块法培养RPMVECs,抽取组织块进行切片观察,以大鼠肺动脉平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞为对照,对培养细胞进行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定,通过光镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构.结果 组织切片显示组织块源于外周肺组织,CD34免疫细胞化学染色阳性,植物凝集素BSI结合试验阳性,而Ⅷ因子相关抗原染色阴性,透射电镜未见Weibel-Palade小体.结论 Ⅷ因子相关抗原和Weibel-Palade小体并非RPMVECs鉴定的理想指标,联合应用外周肺组织切片、CD34和植物凝集素BSI三指标为组织块法培养的RPMVECs提供了一个简单易行、合理、可靠的综合鉴定方案.
-
树突状细胞的培养、鉴定及在移植中应用的研究进展
树突状细胞(dendritic cell,DC)由Steinman和Cohn[1]于1973年首次在小鼠脾淋巴结中分离出来,因在体内成熟时细胞表面伸出树突样或伪足样突起而得名,是目前已知的专职抗原提呈细胞[2],能够激活初始T细胞.有研究表明DC在免疫应答中起着关键作用[3],在移植免疫中起着双向作用.
-
猪的冠状动脉内皮细胞体外培养方法
目的:建立实验小型猪的冠状动脉内皮细胞体外培养方法.方法:冠状动脉血管块短暂酶消化后采用植块法进行培养.结果:植块培养2日细胞从植块中移出;培养6日植块周围细胞呈铺路石样特征,传代/纯化一次后5日细胞单层贴壁生长,融合成片.细胞因子Ⅷ免疫荧光检测内皮细胞表达阳性,纯度100％.结论:成功建立猪冠状动脉内皮细胞体外培养方法,此方法操作简单、快速,得到细胞纯度高.
-
犬冠状动脉平滑肌细胞培养及鉴定
目的:建立犬冠状动脉平滑肌细胞培养及鉴定的方法.方法:用胶原酶消化法体外培养犬冠状动脉平滑肌细胞.结果:分离犬冠状动脉后,用胶原酶消化法培养原代冠状动脉平滑肌细胞,8天后细胞细胞呈“峰-谷”状态,平滑肌细胞α-肌动蛋白免疫组织化学鉴定为平滑肌细胞,纯度为100％.结论:此方法操作简单、快速,得到细胞数量大、纯度高,是一种稳定的冠状动脉平滑肌细胞培养法.
-
犬脐静脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定
目的 建立一种简便、高效的犬脐静脉血管内皮细胞分离方法,并进行培养和鉴定. 方法 无菌条件下取12只新生比格犬脐带共12根,脐带长(13.0±1.5)cm.PBS液冲洗后,各取4根脐带注入1％Ⅰ型胶原酶分别消化脐静脉5、7、10 min后,收集细胞并行锥虫蓝计数；倒置相差显微镜下观察细胞形态,待细胞爬满培养瓶后以1∶2比例传代.取Ⅰ型胶原酶消化7 min获得的第3代细胞,通过免疫荧光染色和流式细胞仪检测细胞中血管假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)和血小板-内皮细胞黏附分子CD31表达,进行细胞鉴定；MTT检测细胞增殖. 结果 消化5、10 min后未收集到或偶尔收集到血管内皮细胞；消化7 min可见大量血管内皮细胞,培养24 h后细胞呈多角形,随培养时间延长细胞逐渐呈“铺路石”样生长,细胞核较大,多为单核,少数细胞为双核,传代后细胞形态无明显变化.荧光倒置显微镜下观察,培养细胞vWF和CD31表达阳性；流式细胞仪检测示培养细胞vWF阳性表达率为99.0％±0.7％,CD31阳性表达率为98.0％±1.2％,提示培养细胞为血管内皮细胞.MTT检测示,随培养时间延长,血管内皮细胞增殖速度明显提高. 结论 采用酶消化法从犬脐静脉中分离培养血管内皮细胞操作简便,且细胞数量多、纯度高.
-
外周血早晚期内皮祖细胞的生物学特性及鉴定的初步研究
目的 通过人外周血分离培养早晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),比较两类EPCs的特性,以期找到可靠的稳定生物学表征及鉴定方法鉴定EPCs.方法 通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,体外种植于内皮细胞全培养基诱导培养,分别于培养4～7d及2～3周获得早、晚期EPCs.对两类EPCs的细胞形态、增殖能力、细胞表型、细胞因子表达情况、体外成血管能力及一氧化氮(nitric oxide,NO)释放能力进行检测比较,并以成熟人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs)作为阳性对照.结果 两类EPCs形态不同,早期EPCs形成纺锤样细胞簇,而晚期EPCs呈鹅卵石样外观;晚期EPCs具有高增殖潜能,可在基质胶上形成毛细管状结构,而早期EPCs则不具备该特性;两类EPCs均可摄取乙酰化低密度脂蛋白,并能与荆豆凝集素Ⅰ结合;流式细胞仪检测发现早期EPCs不表达CD34和CD133,但造血干细胞标记CD14和CD45表达却呈阳性,而晚期EPCs对于内皮型表面标记CD31和CD34表现为强阳性,但CD14、CD45、CD133表达则呈阴性.RT-PCR分析发现早期EPCs的血管内皮生长因子受体2及血管内皮钙黏蛋白基因的相对表达量显著低于晚期EPCs及HAECs (P＜0.05),而血管性血友病因子及内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)基因的相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05).细胞因子分泌方面,早期EPCs培养上清液中的VEGF、粒细胞集落刺激因子及IL-8浓度明显高于晚期EPCs (P＜0.05).Western blot检测示,两类EPCs均表达eNOS,但培养5周的晚期EPCs的eNOS表达水平高于早期EPCs (P＜0.05);两种EPCs均可释放NO,但NO产量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 eNOS的表达及NO释放能力作为内皮细胞的可靠生物学特征可用于EPCs鉴别,多方法联合方式用于鉴定EPCs更为可行.
关键词： 内皮祖细胞 内皮型一氧化氮合成酶 一氧化氮 细胞鉴定 -
人心房成纤维细胞的体外培养与鉴定
目的：：探索和建立适用于人心房成纤维细胞体外培养及鉴定的可靠的技术方法。方法：采用组织块贴壁法对人心房成纤维细胞进行体外细胞培养及传代。并在倒置相差显微镜下观察成纤维细胞的生长情况，利用波形蛋白免疫荧光染色进行细胞鉴定。结果：在倒置相差显微镜下人心房成纤维细胞呈长梭形、多角形，胞质透明，胞核2~3个，无自发性搏动，细胞免疫荧光检测波形蛋白表达阳性。结论：建立了稳定培养人心房成纤维细胞的方法，为研究心肌纤维化相关疾病的发病机理提供了充足的种子细胞。
-
大鼠胃窦平滑肌细胞原代培养优化与鉴定研究
目的:为提高大鼠胃窦平滑肌细胞(GASMC)原代培养成活率,对原代培养大鼠胃窦平滑肌细胞方法进行创新与优化,以增强胃窦平滑肌细胞原代培养方法实用性、可操作性.方法:绝对严格无菌环境取大鼠胃窦组织,剥离胃粘膜层及浆膜层,应用优化法原代培养、0.25％胰酶消化传代培养、苏木素染色法细胞形态观察、免疫组化法细胞鉴定.结果:应用优化大鼠胃窦平滑肌细胞原代培养法2～4天组织块周围有长梭形细胞爬出,5～8天爬出细胞放射状或网状生长,9～11天有明显“峰-谷”样结构,且相互融合.传代细胞生长速度快,呈大片融合,细胞体积增大.免疫组化染色鉴定表达阳性的细胞93％以上.结论:应用优化的大鼠胃窦平滑肌细胞原代培养方法,细胞生长快、成活度高、操作简便易行,具有创新性,实用性强,值得推广.
-
大鼠脾源性内皮祖细胞培养及鉴定
目的 培养、鉴定大鼠脾源性内皮祖细胞.方法 机械损伤大鼠脾脏,用密度梯度离心法收集单个核细胞层,富含胎牛血清EMDM培养液培养,观察细胞形态,将培养第7天内皮祖细胞与DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白37℃孵育4h,以检测内皮祖细胞对Dil-乙酰化低密度脂蛋白的摄取,再用20 g/I,多聚甲醛固定细胞10 min,固定后用PBS浸洗,将FITC标记的凝集素I加入上述标本,37℃孵育1 h,PBS浸洗,通过激光共聚焦显微镜鉴定FITC-凝集素1和DiI-乙酰化低密度脂蛋白.结果 贴壁细胞呈现类圆形、纺锤形或多边形,7～14 d可见部分贴壁细胞生长呈"铺路石"样外观.胞浆摄取DiI-乙酰化低密度脂蛋白显示红色,胞膜结合FITC-凝集素I显示绿色,双染色阳性细胞为黄色,为正在分化的内皮祖细胞.结论 大鼠脾源性内皮祖细胞分离、培养简单、可行.
-
大鼠腹主动脉平滑肌细胞培养及鉴定
目的 培养、鉴定大鼠腹主动脉平滑肌细胞.方法 采用组织贴块法分离培养大鼠腹主动脉平滑肌细胞,胰蛋白酶消化传代,相差显微镜及即用型SABC免疫组化染色试剂盒进行细胞鉴定.结果 平滑肌细胞呈梭形或长梭形生长,透射电镜可见细胞的胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝和与之相连的致密体.高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝.核卵圆形居中,呈淡蓝色.结论 大鼠腹主动脉平滑肌细胞分离、培养方法简单、可行.
-
人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定
目的 体外分离、培养及鉴定人牙髓干细胞,构建人牙髓干细胞系.方法 采用组织块酶消化法获取原代细胞,通过有限稀释克隆法纯化细胞;流式细胞仪检测细胞表面标记物;分别进行矿化诱导和成脂诱导,观察诱导后细胞矿化结节和脂滴形成情况.结果 原代培养后5～7d有细胞从组织边缘爬出,有限稀释法获得相对纯化均一的牙髓干细胞;流式细胞仪分析细胞表面抗原,CD29、CD90、CD105、CD146、STRO-1表达阳性,CD34及CD45表达阴性;矿化诱导的细胞茜素红染色镜下见矿化结节形成,成脂诱导的细胞油红O染色镜下见脂滴形成.结论 分离所得的细胞具有人牙髓干细胞的生物学特性,成功构建人牙髓干细胞系.
-
成人真皮成纤维细胞原代培养及鉴定
目的 探讨建立成人真皮成纤维细胞原代培养方法.方法 新鲜皮肤组织用分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)消化,分离上皮和真皮层,分别采用组织块法和Ⅰ型胶原蛋白酶消化法分离真皮层成纤维细胞.用倒置相差显微镜观察细胞生长情况,波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞类型及纯度;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期分布.结果 培养48 h,经胶原蛋白酶分离得到的成纤维细胞95％以上贴壁,同时细胞开始从组织块边缘贴壁延伸生长.培养5d时,组织块周围有大量细胞贴壁增殖.细胞生长迅速,第7天,增殖细胞层铺满培养皿.组织块法分离的成纤维细胞中可混杂少量上皮细胞团,而胶原蛋白酶消化法分离的细胞波形蛋白阳性率接近100％,几乎均为成纤维细胞.结论 胶原蛋白酶消化和组织块法均是快速、经济、有效获取真皮成纤维细胞的方法.胶原蛋白酶消化法可以更有效避免上皮细胞污染,分离的真皮成纤维细胞有较好的增殖能力.
-
成年小鼠心脏成纤维细胞的分离、纯化和原代培养
目的 探讨并建立成年小鼠心脏成纤维细胞原代培养方法.方法 采用0.8 g/LⅣ型胶原蛋白酶和1 g/L胰蛋白酶为消化液,以多次短时间水浴振荡的方式消化成年小鼠心脏组织,差速贴壁法分离纯化心脏成纤维细胞.波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞类型及纯度;倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线;CCK-8法测定细胞增殖能力、Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)刺激后细胞SMAD家族成员2/3(Smad2/3)蛋白及磷酸化水平.结果 差速贴壁后在相差显微镜下可见大量球形贴壁细胞;3d后细胞逐渐由圆形伸展为长梭形并迅速增殖,分裂象多见;5d后细胞数量显著增多,完全汇合无空隙;细胞生长曲线近似“S”形.波形蛋白阳性率可达95％.CCK-8法显示在第3～5天细胞增殖能力显著,给予第2代心脏成纤维细胞TGF-β1刺激显示Smad2/3蛋白磷酸化水平明显增加.结论 建立了一种快速、经济、有效获取成年小鼠心脏成纤维细胞的方法.
-
一种高效分离和培养人脐动脉内皮细胞方法的建立
目的 探索和建立一种高效的人脐动脉内皮细胞分离和培养方法.方法 用PBS灌注清洗脐动脉后,以0.1 g/L1型胶原酶消化脐动脉内膜,收集、离心消化液,重悬细胞在特定培养基中培养.观察其形态特点,同时用CD31免疫荧光染色和内皮细胞管状结构形成实验对所得细胞进行鉴定.结果 倒置相差显微镜下观察所获得的细胞为单层生长,呈现铺路石样形态,并且大量表达内皮细胞特异性膜蛋白CD31,同时能够形成明显的管状结构.结论 本研究建立了操作简单、快速、高效分离人脐动脉内皮细胞的方法,所分离得到的内皮细胞纯度高、成活率高.
-
小鼠肾小球系膜细胞的分离、原代培养及鉴定
目的 建立小鼠系膜细胞(MC)的分离、培养及鉴定的方法.方法 采用分样筛法分离出肾小球、通过优生选择法进行系膜细胞原代培养.相差显微镜、HE染色、扫描电镜、透射电镜观察小鼠系膜细胞的结构,免疫荧光细胞化学技术鉴定原代系膜细胞,血管紧张素Ⅱ刺激MC观察生物学特性.CCK-8法确定细胞生长曲线.结果 原代培养的肾小球经20～30 d系膜细胞逐渐铺满皿底.传代后MC一般6～10h贴壁,第2～3天进入指数增殖期,第3～5天进入平台期.α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体免疫荧光染色阳性,nephrin抗体间接免疫荧光阴性.血管紧张素Ⅱ刺激15 min后,系膜细胞明显收缩.结论 成功建立了小鼠系膜细胞的分离、培养及鉴定的方法体系.
-
皮肤血管瘤内皮细胞原代分离培养与鉴定
目的 建立一种体外分离纯化血管瘤内皮细胞原代培养方法,探讨血管瘤内皮细胞的生物学特性及其分子机制.方法 采用组织块法结合差速贴壁进行原代培养.通过相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学和免疫荧光染色鉴定细胞CD34和Ⅷ因子相关抗原.结果 培养48h后可见组织块周围游离出细胞,呈多边形,胞核清晰,72h去除组织块,2w后细胞长满培养板底形成单层细胞呈铺路石样生长.免疫组化显示CD34表达阳性;免疫荧光染色证实Ⅷ因子相关抗原阳性.结论 组织块法结合差速贴壁可获得高纯度的血管瘤内皮细胞,是一种简单实用的原代培养方法.
-
组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索
目的:建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法.方法:获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定.结果:采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力;HE 染色证实细胞形态和结构正常;AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性.结论:采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式.
-
大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较
目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓问充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力.方法:取7～10dSD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较.结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P＜0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性.在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达.第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有“矿化”结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势.结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞.
-
人成牙本质细胞的分离和鉴定
目的:分离并鉴定完整的成熟人成牙本质细胞.方法:收集人健康恒牙,采用胶原酶和蛋白酶联合消化法分离出成牙本质细胞,并对分离出的细胞进行细胞形态学和免疫组织化学鉴定. 结果:实验分离出的细胞为柱状或立方状,有较长的细胞突起,具有典型的成牙本质细胞形态,免疫组化染色显示细胞表达Ⅰ型胶原、DMP1和DSP蛋白.结论:本研究分离得到了完整的成熟人成牙本质细胞,为后期研究成牙本质细胞的分化、功能及特点奠定基础.
