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NF-E2相关因子2对视网膜细胞保护作用的研究进展
核转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)介导的抗氧化还原通路在细胞氧化应激损伤过程中起到重要的保护作用.在氧化应激的刺激下,Nrf2可以启动多种细胞保护性基因的表达从而维持细胞稳态.因此,在治疗氧化应激损伤的疾病时,药物诱导Nrf2通路表达上调成为了一个新的研究方向.我们主要从视网膜神经细胞和视网膜血管内皮细胞两个方面总结了Nrf2在视网膜病变中的细胞保护作用的相关研究进展.
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川芎嗪注射液对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞增殖作用的影响
目的 观察川芎嗪注射液对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞生长、增殖的影响.方法 体外培养牛视网膜血管内皮细胞( RVEC),将传代的细胞分成3组,即正常细胞对照组(DMEM常规培养基培养)、缺氧模型组、缺氧+不同浓度川芎嗪组(含0.002、0.02、0.2和2 μg/ml川芎嗪的培养基).培养24、48 h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组血管内皮细胞的增殖情况.结果 缺氧组及各药物组各时间点的光密度值明显低于正常细胞对照组(P＜0.01);川芎嗪0.002 μg/ml组的光密度值与缺氧组比较无统计学差异(P>0.05),0.02、0.2 μg/ml组的光密度值与缺氧组比较有统计学差异(P＜0.01),其中0.2 μg/ml组的数值高,但仍低于正常细胞对照组;而川芎嗪2 μg/ml组的光密度值有下降趋势.结论 川芎嗪可抑制缺氧引起的视网膜血管内皮细胞活性降低,对细胞的增殖有一定的促进作用.
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水蛭渗滤液对猴RF/6A细胞表达TNF-α的影响
目的 观察水蛭渗滤液对凝血酶诱导下猴脉络膜-视网膜(内皮)细胞(RF/6A)表达促血管生成因子TNF-α的影响.方法 采用消化培养法,对猴RF/6A细胞进行体外传代培养,选择20 μ/ml的凝血酶作为诱导浓度,分别作用于RF/6A细胞2、4、6、8、10、12及24 h,用ELISA法观察凝血酶对视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的诱导情况.观察在有或无凝血酶诱导下水蛭渗滤液(64 mg/ml)对视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的影响.结果 (1)凝血酶作用2h,TNF-α的表达开始增加,作用4h,TNF-α的表达达到大,持续至10h;4、6、8h与空白组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);当凝血酶作用时间达12 h,TNF-α的表达开始下降,凝血酶组与空白组12h和24 h比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(2)水蛭渗滤液对有或无凝血酶诱导组都能下调TNF-α的表达(P＜0.05).结论 水蛭渗滤液能下调凝血酶诱导下猴RF/6A细胞表达TNF-α.
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体外培养视网膜细胞高糖损伤模型的研究进展
尽管体内实验更接近真实状态,但体内实验影响因素较多,受多种因素干扰.建立合理的体外培养视网膜细胞高糖损伤模型,对进一步深入研究糖尿病视网膜病变的病理特性、药物作用机制和功能重建具有重要的作用.本文拟对体外培养的视网膜血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜Müller细胞以及视网膜神经节细胞高糖损伤模型的建立进行综述.
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冰片对体外培养大鼠视网膜血管内皮细胞屏障通透性的影响
目的 研究冰片对体外培养大鼠血视网膜屏障通透性影响及其作用机制.方法 获取大鼠视网膜血管内皮细胞(REVC),经原代培养并鉴定.大鼠REVC经胰酶消化后接种于铺有层黏连蛋白的Transwell小室中,培养15 d后成功建立REVC紧密连接屏障模型.将紧密连接屏障模型分为2组:实验组(加入冰片血清)和对照组(加入空白血清),用跨上皮细胞电阻测量仪测定2组在0,12,24h这3个时间点的跨上皮细胞电阻(TER)值;以逆转录-聚合酶链反应法检测2组的紧密连接相关蛋白ZO-1 mRNA表达水平.结果 在12 h的TER值:实验组与对照组分别为(159.24 ±3.51),(269.53±5.86)Ω×cm2,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01);但在24h,组间差异无统计学意义(P＞0.05),表明加入冰片血清12 h后,大鼠REVC间紧密连接间隙增大,紧密连接开放,导致TER值降低,24 h后紧密连接恢复正常,TER值恢复到0h水平,表明冰片具有开放体外培养的大鼠REVC间紧密连接的作用.在12 h的ZO-1 mRNA值:实验组与对照组分别为0.47±0.39,0.80±0.02,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01);但在24 h,组间差异无统计学意义(P＞0.05),表明加入冰片后,大鼠REVC的紧密连接相关蛋白ZO-1 mRNA值表达减少,而后逐渐增加,在24 h恢复到0h的水平.表明冰片可以下调大鼠REVC的紧密连接相关蛋白ZO-1mRNA表达水平,降低紧密连接相关蛋白ZO-1蛋白的表达.结论 冰片可在转录水平上减少紧密连接相关蛋白ZO-1 mRNA表达,能够开放大鼠REVC间的紧密连接,增加血视网膜屏障的通透性.
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sEphB4对糖尿病视网膜病变兔模型视网膜血管内皮细胞EphB4/EphrinB2和VEGF表达的影响
目的 探讨sEphB4对糖尿病视网膜病变兔模型视网膜血管内皮细胞EphB4/EphrinB2和VEGF表达的影响.方法 选8～10周的雄兔8只为实验对象,建立糖尿病视网膜病变兔模型.将所有DR兔的右眼作为药物干预组,为药物干预组,分别予sEphB4200、500、1000μg各50μL玻璃体腔注入.左眼作为对照组,予以生理盐水50μL玻璃体腔注入.每月注射1次,治疗6个月后,应用检测兔眼视网膜及玻璃体增殖膜EphB4、EphrinB2和VEGF的表达.结果 随着sEphB浓度的不断增加,EphB4、EphrinB2、VEGF水平逐渐降低,且均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 sEphB4可抑制糖尿病视网膜病变兔视网膜新生血管内皮细胞EphB4/EphrinB2和VEGF的表达.
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脂联素对高糖条件下RF/6A细胞的保护作用
目的 观察脂联素(adiponectin,APN)对高糖培养条件下恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(monkey choroid-retinal endothelial cell line,RF/6A)增殖及凋亡的影响. 方法 将体外培养的生长良好的RF/6A细胞随机分为空白对照组(PBS)、甘露醇对照组(25 mmol/L甘露醇)、高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖)、高糖+APN组(25 mmol/L D-葡萄糖+10,g/mlAPN),各组加入不同的药物处理48 h.分别采用CCK-8法检测细胞增殖,Western blot检测细胞凋亡关键蛋白Bax、Bcl-2的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率. 结果 高糖组(71.42％±2.29％)和高糖+APN组(90.87％±1.68％)细胞增殖率低于空白对照组(100％±0％)和甘露醇对照组(99.09％±0.46％) (P＜0.001);与高糖组相比,高糖+APN组细胞增殖率明显升高(P＜0.001).高糖组和高糖+APN组的RF/6A细胞Bax的相对表达量高于空白对照组和甘露醇对照组(P＜0.001).高糖组和高糖+ APN组细胞Bcl-2的相对表达量低于空白对照组和甘露醇对照组(P＜0.001).与高糖组相比,高糖+APN组细胞Bax的表达明显降低,Bcl-2的表达明显升高(均P＜0.001).高糖组及高糖+APN组细胞凋亡率均比空白对照组和甘露醇对照组增多(P＜0.001).与高糖组相比,高糖+APN组细胞凋亡率明显减少(P＜O.001). 结论 APN处理可抑制高糖培养条件下的RF/6A细胞凋亡,促进细胞增殖,提示APN对视网膜血管内皮细胞具有一定的保护效应.
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缓激肽对体外培养大鼠血视网膜屏障通透性的影响
目的 探讨缓激肽对体外培养大鼠血视网膜屏障通透性的影响.方法 将缓激肽作用于Transwell小室建立体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞(REVC)间紧密连接屏障模型,通过跨上皮细胞电阻(TER)值观察缓激肽对大鼠REVC间紧密连接结构的影响;RT-PCR 法检测紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin mRNA表达水平的变化.结果 实验组作用2 h的TER值小于测量前、作用4 h组和对照组(P<0.01);实验组作用4 h组和测量前、对照组TER值无明显变化(P>0.05).结论 缓激肽可在转录水平上减少紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin mRNA表达,能够开放大鼠REVC间的紧密连接,增加血视网膜屏障的通透性.
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基质细胞衍生因子-1对大鼠视网膜血管内皮细胞功能的影响及其与MAPK／Erk信号通路的关系
目的：探讨基质细胞衍生因子（SDF）-1及MAPK／Erk信号通路抑制剂U0126对体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞（MRVEC）增殖的影响。方法体外培养的MRVEC采用0、25、50和100μg／L的SDF-1处理，100μg／L SDF-1处理体外培养的 MRVEC细胞0、24、48和72 h，采用Western印迹方法检测MRVEC细胞中MAPK／Erk信号通路的磷酸化活化情况，采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测MRVEC细胞的增殖情况。采用MAPK／Erk信号通路抑制剂 U0126预处理 MRVEC 细胞，观察 MAPK／Erk 信号通路在 SDF-1调控 MRVEC 细胞增殖中的作用。结果与100μg／L的SDF-1处理组相比，25、50和100μg／L的 SDF-1均可显著上调 MRVEC 细胞中 Erk 的磷酸化水平，加强 MRVEC 细胞的增殖能力（ P＜0.01），且这种作用具有剂量依赖性。采用Erk信号通路阻断剂U0126阻断MRVEC细胞中的Erk信号通路后，SDF-1促MRVEC细胞增殖的能力显著降低（ P＜0.01）。结论胰岛素可通过激活MRVEC细胞中的MAPK／Erk信号通路，进而增强MRVEC细胞的增殖能力，从而在糖尿病视网膜病变中发挥一定的作用。
关键词： 基质细胞衍生因子-1 视网膜血管内皮细胞 糖尿病 增殖 -
牛视网膜微血管内皮细胞的体外分离培养
目的探讨一种方便可靠的牛视网膜微血管内皮细胞(borein retinal microvas cular endothelial cell,BREC)体外培养方法.方法采用机械剪碎牛视网膜血管,用含牛血清、肝素、血管内皮生长因子(Vascularendothelial growthfactor,VEGF)的条件化培养基培养牛视网膜血管内皮细胞,观察细胞生长状况,制作生长曲线.应用Von Willebrand因子抗体免疫鉴定BREC,并通过透射电镜观察BREC的超微结构.结果添加了VEGF的条件化培养基对BREC有很好的选择刺激作用,初期细胞呈鲤鱼样聚集在微血管碎片周围,对数生长期细胞似铺路石样大片单层生长,存在接触抑制.Von Willebrand因子抗体染色阳性,获得BREC纯度在95％以上,能够连续传代.培养的细胞电镜下符合内皮细胞的特征.结论含VEGF培养基的应用可以获得高纯度、具有良好生长特性的BREC,是一种简便、效果稳定可靠的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法.
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缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF-1α的表达与细胞内ATP含量的相关性研究
目的 探讨在缺氧状态下视网膜血管内皮细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及其与细胞内ATP含量的相关性.方法 对体外分离的牛视网膜血管内皮细胞分别进行常规和CoCl2模拟缺氧培养,采用免疫组化法检测HIF-1α的表达,生物荧光法检测细胞ATP含量,分析HIF-1α的表达与ATP含量的相关性.结果 正常对照组HIF-1α有极低表达,在缺氧1h时表达量显著上升,4h达到高峰,16h后下降.与对照组比较,各缺氧组HIF-1α的表达差异均有显著性(P<0.01).HIF-1α的表达与细胞内ATP含量显著正相关(P<0.01).结论 视网膜血管内皮细胞在缺氧早期HIF-1α表达有短暂、迅速的增加,其表达与细胞增殖有关.
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高迁移率蛋白1的小干扰RNA对高糖环境下视网膜血管内皮细胞凋亡的影响
目的 探讨高迁移率蛋白1(high-mobility group box-1,HMGB1)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对视网膜血管内皮细胞的影响.方法 采用siRNA对HMGB1的表达进行抑制,采用CCK8检测试剂盒、Hochest33342染色、流式细胞仪检测,观察高糖环境下HMGB1 siRNA对视网膜血管内皮细胞的影响,同时通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达.结果 HMGB1转染后,siRNA组的蛋白表达与正常对照组相比减少了73％ (P ＜0.05),siRNA组的蛋白表达与非特异性siRNA(scr-siRNA)组相比减少了75％ (P ＜0.05),而正常对照组和scr-siRNA组之间差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪检测结果显示,正常对照组、高糖组、scr-siRNA组和siRNA组细胞的总凋亡率分别为(0.40±0.03)％、(49.80±3.50)％、(47.60±1.98)％和(23.60±2.40)％.与正常对照组相比,高糖组、scr-siRNA组、siRNA组的细胞凋亡率均明显升高(均为P＜0.05);与scr-siRNA组相比,siRNA组的细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);而scr-siRNA组和高糖组的细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).与正常对照组相比,高糖组和scr-siRNA组的cleaved-caspase 3蛋白(半胱天冬酶3)表达分别增加了(233±10)％、(266±22)％(均为P＜0.05);与scr-siRNA组相比,siRNA组的cleaved-caspase 3蛋白表达减少了(43±3)％(P＜0.05);而高糖组和scr-siRNA组的蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).与正常对照组相比,高糖组和scr-siRNA组的B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达分别减少了(32±2)％、(29±3)％(均为P＜0.05);与scr-siRNA组相比,siRNA组的Bcl-2蛋白表达增加了(42±2)％(P＜0.05);而高糖组和scr-siRNA组的蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HMGB1 siRNA可以通过抑制cleaved-caspase 3的活化和增加Bcl-2蛋白的表达减轻高糖环境下视网膜血管内皮细胞的凋亡.
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血管内皮细胞生长因子抑制剂对视网膜血管内皮细胞自噬的促进作用
目的 观察血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂对小鼠视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVECs)自噬水平的影响.方法 将RVECs随机分为五组:正常对照组、缺氧对照组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组、VEGF抑制剂(anti-VEGF)组和3-MA+anti-VEGF组.采用Western blot法检测RVECs中两种自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)及Bec-lin-1的表达;计算绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性斑点细胞占比;透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬体的超微结构.结果 正常对照组、缺氧对照组、3-MA组、anti-VEGF及3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为0.182±0.125、0.587±0.101、0.309±0.151、0.914±0.037及0.585±0.098;Beclin-1分别为0.205±0.035、0.590±0.120、0.425±0.082、0.842±0.087及0.607±0.022;GFP阳性斑点细胞比例分别为17.107％ ±3.521％、90.278％ ±2.684％、82.591％ ±4.490％、94.798％ ±1.760％及89.472％ ±3.764％.与正常对照组相比,缺氧对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达增高,GFP阳性斑点细胞的比例增加(均为P<0.05),同时自噬体增多.与缺氧对照组相比,3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低(均为P<0.05),同时自噬体减少;anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率升高(均为P<0.05),同时自噬体增多.与anti-VEGF组相比,3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低(均为P<0.05),同时自噬体减少.结论 VEGF抑制剂对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的自噬水平有促进作用.
关键词： 自噬 血管内皮细胞生长因子 缺氧 视网膜血管内皮细胞 -
BAMBI过表达抑制缺氧诱导的恒河猴视网膜血管内皮细胞增殖和迁移
目的 探讨过表达激活素膜结合抑制剂(bmp and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI)对缺氧诱导的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)增殖和迁移的影响.方法 将RF/6A细胞分为四组:正常对照组、缺氧组、缺氧+pFLAG组和缺氧+BAMBI组.Western blot检测各组细胞中BAMBI的表达,倒置显微镜观察各组细胞形态和密度,CCK-8法和流式细胞仪分别检测各组细胞的增殖和周期情况,Transwell检测细胞的迁移,Western blot检测转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达.结果 与对照组相比,缺氧组细胞数目明显增多,增殖增加,培养120 h后,对照组细胞增殖倍数为5.00±0.28,缺氧组为7.64±0.32 (P ＜0.001);缺氧组S期进程显著加快,占(10.44±2.61)％,对照组S期占(20.79±2.23)％(P＜0.05);细胞迁移增加,缺氧组细胞数目为33.80±4.20,对照组为8.35±2.50(P ＜0.05),TGF-β1和VEGF的表达明显增加(P＜0.05).缺氧+BAMBI组:缺氧处理的细胞转染pFLAG-BAM-BI后,与缺氧组相比,BAMBI蛋白表达显著上调,细胞数目明显减少,增殖显著降低,培养120 h后,增殖倍数为5.53±0.27 (P＜0.001),细胞S期受到阻滞,占(18.75±2.92)％,迁移显著下降,数目为13.00±2.80 (P ＜0.05),TGF-β1和VEGF的表达明显下调(P＜0.05).结论 过表达BAMBI可抑制缺氧诱导的RF/6A细胞的增殖和迁移,进而有望抑制视网膜血管新生.
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Notch信号对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞凋亡的保护作用
目的 探讨Notch1信号对高糖情况下多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1[Poly(ADP-ribose) polymeras-1,PARP-1]和核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的p50亚单位(NF-κB50)介导的人视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVECs)凋亡的抑制作用.方法 体外培养人RVECs及HEK293T细胞,并进行传代,同时构建高糖(葡萄糖浓度为30 mmol·L-1)人RVECs细胞模型.构建pCMV-Script-Notch1和pCMV-Script-DLL4质粒,酶切鉴定后Western Blot法检测重组质粒表达目的基因的效果,同时合成siNotch1并转染高糖培养的人RVECs,Westem Blot法检测Notch基因敲除效果.应用免疫共沉淀及Western Blot法检测siNotch1对高糖下PARP-1和NF-κB的相互作用的影响;应用Western Blot法检测高糖条件下Notch1/DLL4上调和下调后人RVECs中PARP-1、p-AKT、NF-κB50及caspase-3的表达变化.结果 人RVECs复苏后24 h贴壁,细胞呈扁平梭形,3d左右细胞开始融合呈铺路石样,单层生长,铺满瓶底,并可见接触抑制现象.免疫共沉淀结果显示高糖组培养的人RVECs其PARP-1结合的NF-κB50的量较正常对照组增加;将siNotch1转染高糖组培养的人RVECs后或同时加入DLL4,则人RVECs中PARP-1结合的NF-κB50的量较前增加显著,提示Notch能抑制高糖下PARP-1和NF-κB50的相互作用.Western Blot检测结果显示高糖条件下,Notch1和DLL4上调后其PARP-1及caspase-3表达量较前显著降低;Notch1下调后其PARP-1及caspase-3表达量较前增加;p-AKT表达量则相反;提示Notch信号能抑制高糖诱导的PARP-1及caspase-3的激活及表达.结论 高糖情况下Notch信号可调控PARP-1和NF-κB的相互作用,并抑制PARP-1激活引起的人RVECs的凋亡.
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组织块半悬浮培养法分离培养大鼠视网膜血管内皮细胞
目的 利用组织块半悬浮培养法分离培养大鼠视网膜血管内皮细胞.方法 分离大鼠视网膜并剪碎,将4～5个碎块半悬浮培养,培养基为含有体积分数10％胎牛血清并滴加重组牛碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液,获得的细胞用Ⅷ因子相关抗体鉴定,并使用传统冻存及复苏的方法保存.结果 24 h组织块生长固定在培养皿中,6d可见细胞从组织块边缘游出,并可见多个细胞集落,16 d基本铺满培养皿.Ⅷ因子相关抗体染色阳性,细胞可持续生长并传代.结论 用组织块半悬浮培养法可以简便的获得视网膜血管内皮细胞,所获细胞性状稳定,可用于进一步实验研究.
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多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1通过激活NF-κB途径导致高糖人视网膜血管内皮细胞凋亡
目的 探讨多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1[poly(adenosine diphosphate-ribose)polymeras-1,PARP-1]和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在高糖人视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVEC)中的相互作用及其在人RVEC中的表达定位及作用机制.方法 体外培养人RVEC及HEK293T细胞,并进行传代,同时构建高糖人RVEC细胞模型.构建PARP-EGFP及Flag-NF-κB质粒,酶切鉴定后转染高糖培养的人RVEC,Western blot法检测重组质粒表达目的基因的效果,并应用Western blot法和免疫共沉淀法检测高糖人RVEC中PARP-1和NF-κB的相互作用.PARP-EGFP和Flag-NF-κB质粒共转染人RVEC,激光共聚焦扫描显微镜检测PARP-1和NF-κB在高糖人RVEC中的定位及其相互作用.结果 人RVEC复苏后24 h贴壁,细胞呈扁平梭形,3d左右细胞开始融合呈铺路石样,单层生长,铺满瓶底,并可见接触抑制现象.成功构建PARP-EGFP及Flag-NF-κB质粒,并有效表达目的基因.免疫共沉淀结果显示PARP-1和NF-κB是相互作用的蛋白质,高糖组NF-κB p50的条带比正常对照组明显增粗,并且高糖情况下PARP-1结合NF-κB的量较正常对照组明显增加.激光共聚焦扫描显微镜结果显示PARP和NF-κB均表达于正常的人RVEC的细胞核和核周区域,当受到高浓度葡萄糖影响后,PARP-1和NF-κB均集中表达于细胞核内,尤以NF-κB显著.结论 PARP-1和NF-κB是相互作用的蛋白质,血糖增高时,PARP-1可能进入细胞核内并结合同时进入细胞核的NF-κB,激活NF-κB信号通路,引起RVEC凋亡,导致DR的发生.
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CCR3拮抗剂对视网膜血管内皮细胞管腔形成的影响及机制
目的 探讨CCR3拮抗剂对人视网膜血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cell,HREC)管腔形成能力的影响以及具体机制.方法 常规培养HREC细胞系并收集细胞,应用RT-PCR和Western blot检测CCR3在HREC中的表达.按CCR3拮抗剂浓度分为对照组(0 ng·mL-1)和CCR3拮抗剂组(500 ng·mL-1),应用基质胶Matrigel体外三维成型法检测不同浓度CCR3拮抗剂对HREC管腔形成的影响.CCK-8增殖法检测不同浓度CCR3拮抗剂对HREC细胞增殖的影响.RT-PCR和Western blot检测不同浓度CCR3拮抗剂对HREC内VEGF和一氧化氮合酶(nitricoxide synthase,NOS)表达的影响.结果 两组HREC在基因水平和蛋白水平均表达CCR3分子.CCR3拮抗剂组HREC管腔形成明显受到抑制:对照组(60.27±6.68)个/视野,CCR3拮抗剂组(31.55 ±6.81)个/视野,差异有统计学意义(p=0.004).进一步检测结果发现CCR3拮抗剂抑制HREC的增殖,在0 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1浓度下的增殖抑制率分别为0.10±0.03、0.16 ±0.08、0.19±0.12、0.87±0.28、1.45±0.31,并呈浓度依赖性,在CCR3拮抗剂浓度为100 ng·mL-1和200 ng·mL-时,其增殖抑制率与对照组相比差异均有统计学意义(P=0.02、0.00).RT-PCR和Western blot检测结果显示:CCR3拮抗剂干预后,HREC内VEGF的表达未出现明显变化(PmRNA =0.727、P蛋白=0.793);两组NOS的基因表达(对照组0.89±0.23,CCR3拮抗剂组0.46±0.11)和蛋白表达(对照组0.64±0.12,CCR3拮抗剂组0.35±0.10)差异均有统计学意义(PmRNA=0.048、P蛋白=0.032).结论 CCR3拮抗剂对HREC的管腔形成有抑制作用,其机制可能通过抑制细胞增殖以及抑制NOS的表达等途径发挥效应.
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葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞增殖的影响
目的 观察不同浓度葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞增殖的影响.方法 取第7代牛视网膜血管内皮细胞用于实验.葛根素组中加入含不同浓度葛根素的培养液,对照组加入等量空白培养液.24 h及48 h后采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测视网膜血管内皮细胞的增殖情况.结果 与空白对照组比较,0.05 mg·L-1、0.50 mg·L-1、5.00 mg·L-1、50.00 mg·L-1和500.00 mg· L-1葛根素组作用24h及48 h后视网膜血管内皮细胞增殖明显.24h葛根素组OD值(按照葛根素浓度由低到高分别为:0.283±0.060、0.337±0.030、0.349±0.030、0.405±0.030、0.352±0.020)明显高于对照组(0.161±0.060),差异均有统计学意义(均为P＜0.01)；48 h葛根素组OD值(按照葛根素浓度由低到高分别为:0.371±0.030、0.377±0.040、0.410±0.040、0.400±0.020、0.310±0.040)也明显高于对照组(0.279±0.050),差异均有统计学意义(均为P＜0.01).结论 葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞有明显的促增殖作用,其作用与葛根素的剂量有关.
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水蛭提取液对恒河猴视网膜血管内皮细胞增殖和细胞周期的影响
目的 观察渗滤法水蛭提取液对恒河猴视网膜血管内皮细胞RF/6A细胞增殖和细胞周期的影响.方法 采用MTT法观察不同浓度水蛭提取液(0g·L-1、8g·L-1、16g·L-1、32g·L-1、64g·L-1、128g·L-1)对RF/6A细胞增殖的影响,筛选佳抑制浓度.应用流式细胞仪观察水蛭提取液对凝血酶诱导的RF/6A细胞周期的影响.结果 8g·L-1、16g·L-1浓度组水蛭提取液对血管内皮细胞RF/6A有促进生长作用,与空白对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05);32 g·L-1、64g·L-1、128g·L-1浓度组水蛭提取液对血管内皮细胞RF/6A均有明显抑制作用,与空白对照组相比差异也均有统计学意义(均为P<0.05);24h IC50为97g·L-1;64 g·L-1为水蛭提取液的佳抑制浓度,用于后期实验.流式细胞仪检测发现:水蛭提取液组Gl期细胞比例(91.95±1.69)%高于其他各组,合药组(83.60±1.88)%高于凝血酶组(77.78±3.22)%,差异均有统计学意义(均为P<0.05).凝血酶组S期细胞比例(21.75±2.94)%高于其他各组,水蛭提取液组(7.55±2.45)%低于合药组(14.42±1.48)%,差异均有统计学意义(均为P<0.05).结论 不同浓度的水蛭提取液对视网膜血管内皮细胞RF/6A的增殖产生不同作用,64 g·L-1水蛭提取液可以抑制血管内皮细胞的增殖,将细胞阻滞在G1期,可能是一种潜在的抗新生血管药物.
